結直腸癌k-ras突變與ERCC1mRNA表達相關性研究

●李林

結直腸癌k-ras突變與ERCC1mRNA表達相關性研究

●李林

目的：探討結直腸癌k-ras基因突變與ERCC1mRNA表達相關性，為結直腸癌化療提供理論依據。方法 選擇2012年1月～2014年6月間我院送檢的結直腸癌病例92例，應用直接測序法檢測腫瘤組織k-ras基因突變情況，應用RT-PCR相對定量分檢測腫瘤組織ERCC1mRNA表達水平。結果：92例結直腸癌患者腫瘤組織中，共有29例發生了k-ras突變，突變發生率為31.5%。k-ras突變型患者ERCC1mRNA表達水平顯著高于k-ras野生型患者（P＜0.05）。不同腫瘤長度、浸潤深度、分化程度、臨床分期及淋巴結轉移患者ERCC1mRNA表達水平（△CT）無統計學差異（P＞0.05）。Pearson相關分析顯示ERCC1mRNA表達水平與腫瘤長度、浸潤深度、分化程度、臨床分期及淋巴結轉移無相關性（P＞0.05），與k-ras突變發生呈正相關（r=0.667, P＜0.05）。結論：結直腸癌k-ras突變與ERCC1mRNA表達密切相關，二者可能與結直腸癌化療聯合西妥昔單抗治療耐藥有一定關系。

結直腸癌；k-ras基因；ERCC1；突變

結直腸癌是消化道最為常見的惡性腫瘤腫瘤之一，近年來發病率呈上升趨勢。目前，化療仍是結直腸癌治療的重要手段之一。近年來，分子靶向治療藥物西妥昔單抗的應用大大提高了結直腸癌的化療效果，但有部分患者對西妥昔單抗耐藥，給治療帶來了困難[1]。k-ras基因是腫瘤細胞表皮生長因子受體（EGFR）通路上的關鍵因子，該基因突變可以導致EGFR通路異常激活，干擾治療效果[2]。而切除修復交叉互補基因（ERCC1）是DNA損傷修復中的關鍵基因[3]。多項研究表明[4,5]，ERCC1表達水平與化療藥物耐藥有密切關系。本研究對我院92例結直腸癌患者腫瘤組織k-ras基因突變狀態和ERCC1基因表達水平進行了檢測，旨在為結直腸化療敏感性預測提供參考：

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2012年1月～2014年6月間我院病理科送檢基因檢測的結直腸癌病例92例的腫瘤組織石蠟標本，所有標本均經病理醫師確診。其中男性59例，女性33例；年齡38～83歲，平均年齡（58.7±12.4）歲；低分化16例，中分化48例，高分化28例；浸潤至肌層24例，浸潤至纖維膜層68例；腫瘤長度：≤3cm 21例，＜3cm且≤6cm 58例，＞6cm13例；淋巴結轉移陰性42例，陽性50例；根據國際抗癌聯盟分期標準：II期45例，III期47例。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤組織k-ras基因突變分析

切取10um厚石蠟包埋切片5張，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后取腫瘤組織，應用DNA提取試劑盒（美國OMEGA公司生產）提取DNA，應用直接測序法檢測k-ras基因第2外顯子第12、13密碼子基因序列，根據NCBI提供k-ras基因序列設計PCR引物，反應體系：PCR Buffer 2uL，Taq DNA polymerase 0.2uL，Mg2+ Solution 0.75uL，Dntp 2uL，Primer 1uL，模板DNA 1uL，去離子水12uL，95°C變性15min，94°C變性50s，57°C退火1min，72°C延伸1min，循環35次，72°C延伸10min。上樣至ABI3100-Avant遺傳分析儀進行測序，Data collection 2.0軟件進行數據處理分析，Sequencing analysis 5.1軟件進行序列分析。

1.2.2 ERCC1 mRNA測定

應用RT-Q PCR試劑盒（美國QIAGEN公司生產），按照試劑盒說明書進行操作。RT-Q PCR反應體系：Master Mix 2.5uL，模板cDNA1uL，ERCC1上、下游引物各0.25uL，去離子水1uL。反應條件：95°C變性10min，60°C變性1min，上熒光PCR擴增50個循環，溶解曲線溫度設定為95°C 15s，60°C 15s，95°C 15s。實時定量分析PCR數據，設定基線，以管家基因β-actin設為內參，將循環數CT值相對于β-actin的相對表達量作為ERCC1 mRNA表達量。

1.3 統計學方法

應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，數據以中位數 (最小值，最大值)形式表示，組間顯著性檢驗采用Wilcoxon test秩和檢驗，相關性分析應用Pearson相關分析， P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌患者k-ras突變情況

92例結直腸癌患者腫瘤組織中，共有29例發生了k-ras突變，占31.5%，其中G12D12例，G13D7例，G12V4例，G12C3例，G13C1例，G12S2例。

2.2 k-ras突變患者ERCC1mRNA表達情況

92例患者腫瘤組織ERCC1mRNA表達（△CT）為4.532（0.183,9.872），k-ras突變型患者ERCC1mRNA表達水平顯著高于k-ras野生型患者（P＜0.05）。

表1 k-ras突變型患者與k-ras野生型患者ERCC1mRNA表達情況比較(x±s)

2.3 不同臨床病理特征患者ERCC1mRNA表達情況

不同腫瘤長度、浸潤深度、分化程度、臨床分期及淋巴結轉移患者ERCC1mRNA表達水平（△CT）無統計學差異（P＞0.05）。

臨床病理特征 n ERCC1mRNA表達（△CT） U P

2.4 ERCC1mRNA表達的相關性分析

Pearson相關分析顯示ERCC1mRNA表達水平與腫瘤長度、浸潤深度、分化程度、臨床分期及淋巴結轉移無相關性（P＞0.05），與k-ras突變發生呈正相關（r=0.667, P＜0.05）。

3 討論

近年來，分子靶向治療藥物西妥昔單抗聯合化療的應用使結直腸癌的臨床療效大大提高。但仍有部分患者對西妥昔單抗和化療藥物產生原發性和繼發性耐藥，因此篩選獲益人群并合理應用分子靶向治療對于結直腸癌尤為重要。國外有研究報道[6]，對于k-ras野生型結直腸癌患者應用西妥昔單抗聯合奧沙利鉑為基礎的一線化療方案療效顯著提高，而該

方案k-ras突變型結直腸癌患者療效不佳。k-ras基因是一原癌基因，位于人類第12染色體上，其所編碼的k-ras蛋白是細胞膜酪氨酸激酶相關受體（如EGFR）信號轉導的“開關”分子，在細胞增殖、分化、運動和凋亡中起到重要的作用[7,8]。當k-ras基因發生突變時可以導致k-ras蛋白持續激活，并加快細胞惡變。目前，關于結直腸癌k-ras基因突變發生率的報道不盡相同，一般為40%～50%，西方國家發生率高于東方[9]。本研究中92例結直腸癌患者腫瘤組織中，共有29例發生了k-ras突變，占31.5%，其中G12D12例，G13D7例，G12V4例，G12C3例，G13C1例，G12S2例，符合相關報道[10]。

鉑類藥物是臨床上治療結直腸癌最常用的化療藥物，但該藥易產生耐藥性[11]。有研究報道，ERCC1mRNA表達水平與患者對鉑類藥物的敏感性呈負相關，其表達水平越高患者對鉑類藥物的敏感性越低[12]。ERCC1在核苷酸修復系統中起到限速和調節作用，當ERCC1mRNA高表達時，可以使停滯在G2/M期的損傷DNA迅速修復，從而導致腫瘤細胞對鉑類藥物耐藥，影響治療效果[13]。本研究結果顯示，不同腫瘤長度、浸潤深度、分化程度、臨床分期及淋巴結轉移患者ERCC1mRNA表達水平（△CT）無統計學差異，k-ras突變型患者ERCC1mRNA表達水平顯著高于k-ras野生型患者，Pearson相關分析顯示ERCC1mRNA表達水平與腫瘤長度、浸潤深度、分化程度、臨床分期及淋巴結轉移無相關性，與k-ras突變發生呈正相關。提示ERCC1與k-ras基因突變在結直腸癌耐藥機制中可能起到協同作用。這對結直腸癌分子靶向治療對象篩選有一定意義。由于西妥昔單抗主要通過與EGFR競爭性結合起到抑制腫瘤增殖、轉移的作用，而k-ras蛋白是EGFR信號轉導的“開關”分子，該基因突變可以導致EGFR通路異常激活，干擾治療效果[14]。通過檢測腫瘤組織中k-ras突變情況和ERCC1mRNA表達，有助于了解患者對分子靶向治療的敏感性，為聯合西妥昔單抗化療提供增效依據。

綜上所述，結直腸癌k-ras突變與ERCC1mRNA表達密切相關，二者可能與結直腸癌化療聯合西妥昔單抗治療耐藥有一定關系。

（作者單位：貴航集團三0二醫院）

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