五倍體草莓及其十倍體的葉片差異表達蛋白分析

寧傳麗，蔡斌華，王　濤，喬玉山

(南京農業大學 園藝學院， 南京210095)

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五倍體草莓及其十倍體的葉片差異表達蛋白分析

寧傳麗，蔡斌華，王濤，喬玉山*

(南京農業大學 園藝學院， 南京210095)

以二倍體綠色草莓(FragariaviridisDuch.)為父本、八倍體栽培草莓‘房香’(F. ×ananassa‘Fusanoka’)為母本雜交所得的五倍體草莓(株系代號：FxLs-11-37，2n=5x=35)及其染色體加倍而成的十倍體(株系代號：A3，2n=10x=70)草莓為試材，觀察記載其部分農藝性狀、SPAD值以及凈光合速率，利用雙向凝膠電泳技術對草莓染色體加倍后葉片蛋白質進行了分析，獲得了分辨率高、重復性好的電泳圖譜。結果表明：(1)與五倍體FxLs-11-37相比，十倍體A3的株型明顯矮化、植株冠徑變大、葉長葉寬增大、葉片增厚以及葉色濃綠，其葉片的SPAD值與凈光合速率顯著高于FxLs-11-37。(2)通過PDQuest軟件對圖譜分析表明，兩者在等電點4～7、分子量14.4～66.2 kD范圍內蛋白質斑點分布最多，可識別的總蛋白質斑點數超過700個，其中蛋白質表達差異水平在1.5倍以上的有18個，2.0倍以上的有4個。利用MALDI-TOF-MS/MS質譜技術鑒定了這4個差異蛋白質，分別是草莓主要過敏原a 1-E、核內不均一核糖核蛋白1、葉綠體硫辛酰基合酶1、NAD(P)H 脫氫酶(醌)FQR1類似蛋白質。這些差異蛋白質主要與抗逆、mRNA轉運、物質與能量代謝相關。熒光定量PCR對上述4個蛋白編碼基因的轉錄表達水平檢測表明，與蛋白質表達差異的趨勢一致。該研究獲得了草莓染色體加倍后差異表達的蛋白質，為深入研究提供了線索。

草莓；五倍體；染色體加倍；差異蛋白質

草莓屬(FragariaDuch.)植物染色體基數x=7，倍性水平豐富，主要有二倍體(2x=14)、四倍體(4x=28)、八倍體(8x=56)等類型。人工雜交獲得的草莓屬多樣性倍性資源[1-2]，為草莓倍性育種奠定了基礎，也為多倍體形成機制研究提供了寶貴資源。隨著倍性的改變，植物基因組的結構和基因的表達會發生一系列的變化，如染色體重組、基因沉默、基因的非加性表達等[3-4]。植物多倍體的表型常表現出植株粗壯、節間變短、葉色更深[5]、生長緩慢、開花推遲[6-7]及抗性增強[8]等特征，這些變化歸根結底是蛋白質表達的結果[9-10]。

蛋白質組學為蛋白水平上的差異研究提供了新技術，在植物研究中的應用越來越廣泛，如雄性不育[11]、抗病抗逆研究[12]等。植物多倍化的蛋白質組學方面的研究已有不少報道，涉及木薯[13]、擬南芥[14]、香蕉[15]、甘藍[16]、棉花[17]、馬鈴薯[18]和小麥[19-20]等。雖然草莓是較早開展蛋白質表達譜研究的果樹種類之一[21]，但有關草莓屬植物多倍體蛋白質組學的相關研究尚屬空白。本研究采用雙向電泳技術進行蛋白質組學分析，探尋草莓五倍體種間雜種與染色體加倍后蛋白質表達譜的差異，并對差異蛋白點進行基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS/MS)鑒定，進一步豐富草莓染色體加倍的分子生物學機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料

以二倍體綠色草莓(FragariaviridisDuch.)為父本、八倍體栽培草莓‘房香’(F. ×ananassa‘Fusanoka’)為母本種間雜交獲得草莓實生苗，經染色體計數確認為五倍體的株系FxLs-11-37(2n=5x=35)為試材，用1.0 mg·L-1秋水仙素溶液浸泡莖尖48 h，獲得經染色體基數確定為十倍體的株系A3(2n=10x=70)[22]。上述試材盆栽于南京農業大學牌樓實驗基地，于6月上旬，選取長勢整齊的植株，剪取靠近頂端生長點往外數第一張展開葉(復葉)的中心葉，液氮速凍后存于-70 ℃冰箱備用。

1.2 1農藝性狀及SPAD(Soil plant analysis development)值測定隨機選取長勢旺盛且一致的FxLs-11-37與A3各10株，按照趙密珍等[23]的描述測量其株高、中心葉的葉長及葉寬以及植株冠徑。采用SPAD-502 Plus便攜式葉綠素測定儀分別測量成熟葉片和幼葉的SPAD值，測定標準為：幼葉測定靠近頂端生長點往外數第一張展開葉(復葉)的中心葉，成熟葉片測定靠近頂端生長點往外數第三張展開葉(復葉)的中心葉，計算平均值，方差分析采用SPSS 19.0。

1.2 2凈光合速率的測定分別選取5株長勢旺盛且一致的FxLs-11-37與A3，在陽光較好的天氣，利用LP-6400型便攜式光合儀測定靠近頂端生長點第三張展開葉(復葉)的中心葉在7：30、9：00、10:30、12:00、15:00、16:30與18:00等7個時間點的凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)，計算平均值，方差分析采用SPSS 19.0。

1.3蛋白質提取

采用TCA-丙酮沉淀法提取草莓葉片總蛋白質。分別稱取約0.6 g樣品液氮中研磨成粉，轉至10 mL離心管，加入7 mL -20 ℃預冷的質量濃度為100 g·L-1TCA/丙酮(含0.07% DTT)，-20 ℃沉淀1.5 h后于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，棄上清；將沉淀重懸浮于-20 ℃預冷丙酮溶液(含0.07% DTT)，-20 ℃過夜，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，棄上清，重復此步驟直至上清液無色。將盛有沉淀的離心管用封口膜封口，扎孔，置于4 ℃冰箱干燥成蛋白質干粉。每1 mg蛋白質干粉加入10 μL的蛋白質裂解緩沖液4 ℃裂解3.5 h后于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，重復該步驟1～2次至裂解緩沖液中無雜質。

表1　熒光定量PCR引物Table 1　Specific primers used in qPCR

1.4蛋白質質量濃度測定

草莓葉片總蛋白質量濃度測定采用Bradford[24]法：以牛血清蛋白(BSA)為標準蛋白，測定其在595 nm波長下的吸光度A595，以不同質量濃度的BSA為橫坐標，測得的吸光度A595為縱坐標，繪制標準曲線(R2≥0.99)，計算樣品中蛋白質的含量。

1.5雙向凝膠電泳

阿里衣服沒穿，爬起來，先到桌前按了一下錄音機的鍵，哀樂轟一聲響起。阿里打開窗子，哀樂便如同被釋放，從窗口涌了出去。

通過計算，取一定量含1.5 mg蛋白質的溶液加入裂解液至總體積為350 μL，沿IPG膠條槽緩慢均勻加入，將17 cm pH 4～7的IPG預制膠條膠面朝下覆蓋在樣品上，在膠面上覆蓋少許礦物油，蓋上蓋子。將膠條槽放在IPGphor等電聚焦電泳儀中，設置等電聚焦程序：50 V水化13 h，250 V慢速升壓1 h，500 V慢速升壓1 h，1 000 V線性升壓1 h，2 000 V線性升壓1 h，10 000 V線性升壓4 h，10 000 V快速聚焦使運行電壓與時間的乘積達65 000 VH，完成蛋白等電聚焦分離，等電聚焦過程溫度設為19 ℃。

等電聚焦結束后，立即進行膠條的平衡。將IPG膠條放于10 mL平衡緩沖液1中，在水平搖床上振蕩15 min，取出IPG膠條沖洗，放入10 mL平衡緩沖液2中，水平搖床上振蕩15 min。平衡結束后，將浸洗后的膠條轉入體積濃度為12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)板中進行第二向垂直電泳。電泳結束后，采用G-250膠體考染法染色8 h，超純水脫色至背景清晰。上述電泳分析重復3次。

1.6凝膠掃描及質譜分析

使用Image Scanner掃描儀對染色后的凝膠進行掃描，獲得蛋白質點圖像，掃描模式為灰度模式，光密度值為300 dpi。采用PDQuest 8.0分析軟件對掃描圖像進行分析。與參考膠的蛋白質點表達量相比，選取1.5倍以上差異且統計學測驗具有顯著性差異的蛋白質點做為差異表達蛋白質點。

取2倍以上差異表達蛋白質點進行酶解，酶解方法參照Katayama等[25]的方法：將含有差異蛋白質點的膠塊切下，重新溶解于5 μL含0.1% TFA的溶液中，然后按照1∶1的比例與含50% ACN和1% TFA的α-氰基-4-羥基肉桂酸飽和溶液混合后，取1 μL樣品用ABI5800串聯飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-TOF)(Applied Biosystems)進行質譜點靶鑒定。

1.7差異蛋白質相關基因的qRT-PCR分析

采用CTAB法分別提取FxLs-11-37及A3的幼嫩葉片樣品總RNA，用核酸蛋白分析儀測量體積濃度并以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。總RNA為模板按照反轉錄試劑盒PrimescriptTMreagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)說明書反轉錄得到cDNA第一鏈。根據差異蛋白質對應的核苷酸序列，采用Beacon Designer 8.13軟件設計實時熒光定量PCR引物(表1)。采用草莓Actin基因作為內標，以cDNA為模板對4種差異蛋白質的相關基因進行qPCR分析：20 μL反應體系包括SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)10 μL，正、反向引物分別為0.3 μL，稀釋10×cDNA模板1 μL，超純水8.4 μL；反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，40個循環，重復3次，儀器為7300 Real Time PCR System實時熒光定量PCR儀。利用Excel 2007軟件進行數據錄入，使用2-ΔΔCt法，以FxLs-11-37為對照，進行差異蛋白質相關基因相對表達量分析。

2　結果與分析

2.1五倍體草莓染色體加倍后農藝性狀、SPAD值和凈光合速率的變化

與五倍體草莓株系FxLs-11-37比較，染色體加倍的株系A3農藝性狀、SPAD值和凈光合速率均發生了顯著的變化。其中，十倍體株系A3表現出明顯的株型矮化、植株冠徑變大，葉寬增大以及葉長略增大、葉片略增厚以及葉色濃綠等性狀特征(表2)；成熟葉片的SPAD值(48.29)明顯高于FxLs-11-37(39.81)，其幼葉的SPAD值(33.83)略高于FxLs-11-37(30.53)(表3)；除18：00外，其余時段A3葉片的凈光合速率比FxLs-11-37高(表3)。

2.2五倍體草莓與其十倍體草莓的差異蛋白分析

經PDQuestTM 2-D Analysis軟件分析，3個重復都具有的點才被認為是確定的點，結果顯示重復組的相似系數平均為73.5%，表明重復性較好。獲得的染色體加倍前后葉片清晰且重復性較好的2-DE圖譜(圖1)，FxLs-11-37與A3蛋白質的分布模式圖相似，總蛋白質點數均超過700個，集中分布在等電點4～7和分子量14.4～66.2 kD范圍內。以表達量大于1.5倍為差異點，獲得差異表達蛋白質點18個，A3表達上調的2個、下調的16個，其中表達量超過2倍的差異點有4個，編號依次為 8106、8515、8006、5121。經MALDI-TOF-MS/MS技術進行鑒定，這4個差異蛋白質是：草莓主要過敏原a1-E(major strawberry allergen Fra a1-E，8106)、核內不均一核糖核蛋白1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein 1，8515)、葉綠體硫辛酰基合酶1(lipoyl synthase 1，chloroplastic，8006)、NAD(P)H脫氫酶(醌)FQR1類似蛋白質(NAD(P)H dehydrogenase (quinone)FQR1-like，5121，表4)，這些差異蛋白質(點)是下一步需要分析的對象。

表2　五倍體草莓與其十倍體草莓的部分農藝性狀Table 2　Some agronomic traits of FxLs-11-37 and A3

注：表中同列數據后不同的小寫字母表示FxLs-11-37與A3間差異顯著(P<0.05)，下同

Note: Different normal letters at the end of figure on the same column indicate significant differences (P<0.05). The same as below

表3　五倍體草莓與其十倍體草莓的SPAD值和凈光合速率Table 3　SPAD reading and net photosynthetic rate of FxLs-11-37 and A3

黑色數字表示蛋白質表達差異水平在1.5～2.0倍的14個蛋白點；白色數字表示蛋白質表達差異水平在2.0倍以上的4個蛋白點；Mr為分子量Marker圖1　五倍體草莓與其十倍體的葉片雙向凝膠電泳圖譜The 14 proteins whose expression levels had a 1.5-2.0 times change were marked in dark numbers, and the 4 proteins whose expression levels had more than 2.0 times change were marked in white numbers. Mr. Molecular weight markerFig.1　Two dimensional electrophoresis maps of FxLs-11-37 and A3 strawberry leaves表4　五倍體草莓與其十倍體的葉片差異蛋白質MALDI-TOF-TOF-MS-MS鑒定Table 4　Identification of differentially expressed proteins between the FxLs-11-37 and A3 strawberry leaves by MALDI-TOF-TOF-MS-MS

編號Spot理論分子量Molecularweight/kD等電點Isoelectricpoint得分Score肽片段覆蓋率SC/%登錄號Accessionno蛋白質名稱Proteinname物種來源Sourceorganism8106177666.1352862CAJ85645.1草莓主要過敏原a1-EMajorstrawberryallergenFraa1-E栽培草莓F.×ananassa8515423536.5435325XP_004296398.1核內不均一核糖核蛋白1Heterogeneousnuclearribonucleo-protein1森林草莓F.vescasubsp.vesca8006399408.82411XP_011463424.1葉綠體硫辛酰基合酶1Lipoylsynthase1,chloroplasticc森林草莓F.vescasubsp.vesca5121217965.8036940XP_004293489.1NAD(P)H脫氫酶(醌)FQR1類似蛋白質NAD(P)Hdehydrogenase(quinone)FQR1-like森林草莓F.vescasubsp.vesca

圖柱表示蛋白質豐度；線段表示基因表達量圖2　五倍體草莓與其十倍體的差異表達蛋白質及其相應基因轉錄表達量Block diagram. Protein abundance; Line segment. Gene expression levelFig.2　Differentially expressed proteins and their corresponding gene expression levels in FxLs-11-37 and A3 leaves

2.3差異蛋白質相關基因的表達分析

對A3與FxLs-11-37差異蛋白質相應基因進行qPCR表達分析，A3與FxLs-11-37相比，草莓主要過敏原a 1-E蛋白質表達量下降230%，基因相對表達量下降940%；不均一核糖核蛋白1蛋白質表達量下降410%，基因相對表達量下降350%；葉綠體硫辛酰基合酶1蛋白質表達量下降410%，基因相對表達量下降120%；NAD(P)H脫氫酶(醌)FQR1類似蛋白質(簡稱FQR1)表達量下降280%，基因相對表達量下降140%。4個差異蛋白表達量下降，其相應基因轉錄表達量也下降，兩者趨勢相同(圖2)。

3　討　論

多倍體植物因其具有更強的抗逆性，使多倍體育種成為提高植物抗逆性的有效途徑[26]。由于雜交及倍性水平的影響，特別是異源多倍體會發生非隨機的序列消除現象、偏向性表達以及基因沉默等基因組印記，從而維持新生基因組的穩定和進化[27]。基因組印記的產生，與多倍體形成后的遺傳及表觀變化有關。在表觀遺傳上，常通過DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA干擾以及劑量補償等方式來影響基因表達并產生顯著的表型效應[28]。本研究發現，十倍體草莓株系在植株冠徑，葉寬葉長、葉片厚度以及葉色等皆超過五倍體草莓株系，葉綠素含量(SPAD值)也較高且具更高的凈光合速率，這可能賦予十倍體草莓株系更強的適應性或抗逆性。

植物染色體加倍后，基因的劑量效應和基因互作效應使多倍體植株發生一系列變化，增強多倍體的適應性[26]。草莓主要過敏原a 1-E，作為發育調控防御系統的一部分，參與植物防御反應，是病程相關生物刺激應激反應蛋白質，在正常情況下，植物體內過敏原含量低，在受到病原菌侵染時，過敏原含量會升高；葉綠體硫辛酰合酶1基因可能參與植物抗逆反應，逆境條件下，鹽地堿蓬種子內硫辛酰基含量會升高，而在正常狀態下，硫辛酰合酶表達量很少[29]，上述這兩種蛋白表達量降低可能與十倍體草莓株系抗性或適應性強相關。Avery和Pottorf[30]指出多倍體植株生長發育緩慢可能與生長素含量低導致細胞分裂緩慢有關，FQR1基因受生長素的誘導[31]，當生長素含量低時，FOR1表達量也低，這可能是五倍體草莓加倍而成的十倍體草莓植株生長緩慢的原因之一。

由于雙向凝膠電泳本身的局限性，本實驗未能檢測到更多的差異蛋白質，實際上在其他植物染色體加倍過程中所產生的參與信號傳導[32-33]、轉錄因子[34]和激素代謝[35]等差異蛋白質是廣泛存在的，下一步我們將利用新的高通量手段如iTRAQ等技術對草莓染色體加倍前后蛋白質表達的差異進行全面分析，以期更全面了解植物染色體加倍后影響植物表型的相關因素。

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(編輯:宋亞珍)

Differentially Expressed Proteins in Strawberry Leaves between Pentaploid and Its Corresponding Allodecaploid

NING Chuanli, CAI Binhua, WANG Tao, QIAO Yushan*

(College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Pentaploid strawberry (FxLs-11-37, 2n=5x=35) derived from the hybridization between diploidFragariaviridis(male) and octaploidF. ×ananassa‘Fusanoka’ (female), and its allodecaploid (A3, 2n=10x=70) were employed for conducting proteomic analysis with two dimensional gel electrophoresis technology under observation of agronomic traits, soil and plant analyzer development (SPAD) readings, and the net photosynthetic rate. (1) Compared with FxLs-11-37, A3 showed a significant dwarf type, larger crown, increased leaf length and leaf width, much thicker in leaf, more dark green leaves, and it also has a bigger SPAD for leaf and net photosynthetic rate; (2) Protein spots of FxLs-11-37 and A3 analyzed using PDQuest software were mainly scattered in the isoelectric point ranging from pH 4 to 7, and molecular weight ranging from 14.4 to 66.2 kD. More than 700 expressed protein spots in FxLs-11-37 and A3 were detected. Expression levels of 18 protein spots changed over 1.5 fold after chromosome doubling, and 4 protein spots changed over 2.0 fold. We identified these 4 protein spots with MALDI-TOF-MS/MS mass spectrometry technology, and results showed that the 4 proteins are major strawberry allergen Fra a 1-E, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein 1, lipoyl synthase 1, chloroplastic, and NAD(P)H dehydrogenase (quinine) FQR1-like. These proteins are involved in stress resistant, mRNA transport, material and energy metabolism. Results of real-time quantitative PCR of gene encoding the above four proteins demonstrated that the difference tendency of gene transcriptional expression was consistent with the proteins levels. We obtained the differentially expressed proteins in strawberry chromosome doubling, which provided tracks for further research.

strawberry; pentaploid; chromosome doubling; differential protein

1000-4025(2016)09-1794-07doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1794

2016-05-23;修改稿收到日期:2016-09-01

江蘇省農業科技自主創新資金(CX(15)1029)

寧傳麗(1985-)，女，在讀碩士研究生，主要從事草莓生物技術研究。E-mail:2013104032@njau.edu.cn

喬玉山，教授，博士生導師，主要從事果樹育種與生物技術研究。E-mail：qiaoyushan@ njau.edu.cn

Q343.2+44; Q591.2; Q753

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