IL2RA-RBM17基因區(qū)域單核苷酸多態(tài)性與中國蒙古族白癜風(fēng)關(guān)聯(lián)研究

烏日娜 韓建文 劉佳 布和其其格 格日勒 白云花

010050呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科（烏日娜、韓建文、劉佳、布和其其格）；呼倫貝爾市人民醫(yī)院皮膚科（白云花）；錫林郭勒盟蒙醫(yī)醫(yī)院皮膚科（格日勒）

·論著·

IL2RA-RBM17基因區(qū)域單核苷酸多態(tài)性與中國蒙古族白癜風(fēng)關(guān)聯(lián)研究

烏日娜 韓建文 劉佳 布和其其格 格日勒 白云花

010050呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科（烏日娜、韓建文、劉佳、布和其其格）；呼倫貝爾市人民醫(yī)院皮膚科（白云花）；錫林郭勒盟蒙醫(yī)醫(yī)院皮膚科（格日勒）

目的 探討IL2RA-RBM17基因區(qū)域單核苷酸多態(tài)性與中國蒙古族白癜風(fēng)的遺傳關(guān)聯(lián)性。方法收集白癜風(fēng)患者425例，健康對(duì)照503例。用AxyPrep（AP-MX-BL-GDNA-25）基因組DNA抽提試劑盒抽提基因組 DNA。選擇位于 IL2RA-RBM17基因區(qū)域的 9個(gè)單核苷酸多態(tài)性（rs706779、rs3134883、rs7090530、rs12251307、rs4750005、rs3920615、rs4747887、rs4750012、rs7099083）， 用 連 接 酶 鏈 反 應(yīng) 進(jìn) 行 基 因 分 型 。 用PLINK1.07及SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，χ2檢驗(yàn)比較白癜風(fēng)組及健康對(duì)照組等位基因頻率及基因型頻率。對(duì)5個(gè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的SNP間進(jìn)行連鎖不平衡檢驗(yàn)，計(jì)算兩兩間的r2和D′值。用5個(gè)具有相關(guān)性的SNP構(gòu)建單倍型，分析每個(gè)單倍型頻率在白癜風(fēng)組和健康對(duì)照組中的分布。結(jié)果 5個(gè)SNP（rs4750005、rs3920615、rs4747887、rs4750012、rs7099083）的等位基因頻率與健康對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。5個(gè)SNP在顯性遺傳模式下，白癜風(fēng)組中的基因型頻率均顯著低于健康對(duì)照組（P＜0.005 6）。5個(gè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的SNP間存在中等至強(qiáng)的連鎖不平衡（D′=0.424～1，r2=0.137～0.985）。用5個(gè)具有相關(guān)性的SNP構(gòu)建單倍型，分析每個(gè)單倍型頻率的分布，發(fā)現(xiàn)1個(gè)單倍型（H2：CGCTA）在白癜風(fēng)組頻率明顯低于健康對(duì)照組，并達(dá)到Bonferroni校正水平（P=0.001 6，OR=0.674）。結(jié)論 IL2RA-RBM17區(qū)域基因多態(tài)性與蒙古族白癜風(fēng)具有相關(guān)性。

白癜風(fēng)；多態(tài)性，單核苷酸；蒙古；遺傳關(guān)聯(lián)研究；基因，IL2RA-RBM17；中國

白癜風(fēng)是一種色素脫失性皮膚病，是皮膚和毛發(fā)內(nèi)的黑素細(xì)胞選擇性毀損所致。全球白癜風(fēng)發(fā)病率為0.2%～1%［1］，其中中國漢族的發(fā)病率為0.1%～1%［2］，在不同種族和地域之間存在顯著的差異。近年遺傳關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，一大批白癜風(fēng)相關(guān)的易感基因中IL2RA-RBM17基因在歐洲及中國漢族人群的研究中均有報(bào)道［3-4］。為研究IL2RA-RBM17基因區(qū)域多態(tài)性與中國蒙古族人群白癜風(fēng)相關(guān)性，本研究選擇位于IL2RA-RBM17基因區(qū)域的9個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP），用連接酶鏈反應(yīng)（LDR）對(duì)其進(jìn)行基因分型，探討與蒙古族白癜風(fēng)的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

1.收集內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科蒙古族白癜風(fēng)患者425例，年齡（34.98±15.37）歲，發(fā)病年齡（25.60±14.23）歲；男 ∶女為 1.20∶1；蒙古族健康對(duì)照 503例，年齡（34.20±11.64）歲；男 ∶女為1.19∶1。經(jīng)知情同意并簽字后抽取外周靜脈5 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有患者?jīng)臨床及病理證實(shí)。所有患者均為散發(fā)性白癜風(fēng)，白斑數(shù)量大于3處，面積占體表面積8%～20%。健康對(duì)照組排除白癜風(fēng)及其他自身免疫疾病，排除白癜風(fēng)家族史。本研究通過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選者均簽署知情同意書。

2.SNP選擇：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［3-4］，在IL2RARBM17基因區(qū)域選擇9個(gè)亞洲及漢族人白癜風(fēng)相關(guān) SNP， 包 括 rs706779、rs3134883、rs7090530、rs12251307、rs4750005、rs3920615、rs4747887、rs4750012、rs7099083。

二、方法

1.基因組DNA提?。豪没蚪MDNA提取試劑盒（AxyPrep，APMX-BL-GDNA-25，蘇州）提取患者及健康對(duì)照組DNA，用分光光度儀檢測(cè)吸光度260 nm和280 nm，計(jì)算DNA濃度。并利用凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，所有DNA樣本均合格。

2.引物及探針的合成：用Primer 3 online（Version 0.4.0）軟件和 Oligo（Version 6.31）軟件設(shè)計(jì)特異性引物和LDR探針，針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，盡量保證所有SNP位點(diǎn)的引物的T值相同，PCR引物序列見表1。根據(jù)LDR探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)LDR的上下游探針［5-6］，上游探針5′端用磷酸化修，LDR探針序列見表2。PCR引物及LDR探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

3.多重 PCR：PCR 反應(yīng)體系：1 μl模板，2 μl緩沖液，0.6 μl Mg2+，2 μl dNTP，0.2 μl TaqDNA 聚合酶，2 μl引物混合液，加水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；94℃ 30 s。56℃退火1.5 min。65℃30 s，35個(gè)循環(huán)。最后65℃延伸10 min。

4.多重 LDR：LDR 反應(yīng)體系：1 μl緩沖液，1 μl探針混合液，0.05 μl Taq DNA 連接酶，4 μl PCR 產(chǎn)物，加水補(bǔ)足 10 μl。探針混合液濃度為 2 pmol/μl。LDR反應(yīng)條件：95℃2 min預(yù)變性，94℃15 s，50℃25 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

5.測(cè)序與基因分型：反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過ABI3730測(cè)序儀測(cè)序分析，最后用Genemapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，判讀各位點(diǎn)上各樣本的基因分型（測(cè)序工作由上海翼和科技公司完成）。

表1 PCR引物序列

6.統(tǒng)計(jì)分析：所有SNP分型數(shù)據(jù)質(zhì)控、等位基因及基因型頻率比較利用PLINK 1.07軟件（http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/）［7］。 計(jì) 算 9 個(gè)SNP的等位基因頻率，白癜風(fēng)組及健康對(duì)照組分別進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。χ2檢驗(yàn)比較白癜風(fēng)組及健康對(duì)照組等位基因頻率及基因型頻率，并計(jì)算等位基因的相對(duì)危險(xiǎn)度比值比OR及其95%可信區(qū)間（95%CI）。對(duì)9個(gè)SNP間進(jìn)行連鎖不平衡檢驗(yàn)，計(jì)算兩兩間的r2和D′值。單倍型分析利用Haploview軟件完成。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，根據(jù)Bonferroni多重檢驗(yàn)校正原理，P＜0.0056（0.05/9）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 連接酶鏈反應(yīng)探針序列

結(jié) 果

1.樣本及SNP質(zhì)控白癜風(fēng)及健康對(duì)照樣本在性別及年齡之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。9個(gè)SNP在白癜風(fēng)及健康對(duì)照中均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P＞0.05）。

2.等位基因頻率比較5個(gè)SNP的等位基因頻率與健康對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但rs3920615、rs4747887、rs4750012 和 rs7099083 未達(dá)到Bonferroni校正水平（表3）。差異最為顯著的是rs3920615，其的等位基因C在白癜風(fēng)組的頻率（0.250 0）明顯低于健康對(duì)照組中頻率（0.311 8）（P=0.003 4，OR=0.74）。經(jīng)過連鎖不平衡分析，計(jì)算兩兩間的D′和r2，發(fā)現(xiàn)這5個(gè)等位基因頻率有差異的SNP間存在中等至強(qiáng)的連鎖不平衡（D′=0.42～1，r2=0.14～ 0.99）。

3.基因型分析：分別在顯性模式和隱性模式下對(duì)5個(gè)SNP進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在顯性遺傳模式下，白癜風(fēng)組中的基因型頻率均顯著低于健康對(duì)照組（P＜0.005 6，表4），而在隱性模式下基因型分布無差異（P＞0.05）。

4.單倍型分析：利用5個(gè)具有相關(guān)性的SNP構(gòu)建單倍型，分析每個(gè)單倍型頻率在白癜風(fēng)組和健康對(duì)照組中的分布（表5），發(fā)現(xiàn)1個(gè)單倍型（H2:CGCTA）在白癜風(fēng)組頻率（0.146）明顯低于健康對(duì)照組（0.203），并達(dá)到 Bonferroni校正水平（P=0.001 6，OR=0.67）。

表3 白癜風(fēng)組和健康對(duì)照組中9個(gè)單核苷酸多態(tài)性等位基因頻率分布

表4 5個(gè)單核苷酸多態(tài)性基因型在白癜風(fēng)組和健康對(duì)照組中分布及分析

表5 單倍型分析結(jié)果

討 論

白癜風(fēng)皮損可以發(fā)生于身體任何部位，可沿神經(jīng)皮節(jié)呈帶狀分布或泛發(fā)全身。白癜風(fēng)的皮損初期多為錢幣大小，或點(diǎn)狀色素減退斑，圓形或不規(guī)則形，境界較明顯。白斑可局限于一個(gè)部位不變或逐漸自行消失，亦可逐漸擴(kuò)大、增多，相鄰白斑互相融合形成大片白斑，可泛發(fā)全身。白斑處除色素脫失外，沒有萎縮或脫屑［2］。白癜風(fēng)的皮損嚴(yán)重影響患者美觀，給患者帶來較大的心理負(fù)擔(dān)和精神壓力。白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，可能包括自身免疫學(xué)說、遺傳學(xué)說、神經(jīng)化學(xué)因子學(xué)說、黑素細(xì)胞自身破壞學(xué)說及角質(zhì)形成細(xì)胞學(xué)說等，但任何一種學(xué)說都不能完全解釋白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制［8］。隨著認(rèn)識(shí)的深入，越來越多的學(xué)者認(rèn)同多個(gè)遺傳變異位點(diǎn)累積效應(yīng)與環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致黑素細(xì)胞的自身免疫性損傷是其發(fā)病的主要假說［8］。同時(shí)，研究證實(shí)白癜風(fēng)是一種與自身免疫相關(guān)的疾病，臨床可見白癜風(fēng)患者及其親屬常伴發(fā)各種自身免疫疾病，同時(shí)自身免疫疾病的患者發(fā)生白癜風(fēng)的概率也比正常人高［9］。研究發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)患者中存在著體液免疫細(xì)胞免疫功能的異常［10］。有學(xué)者嘗試?yán)肅D20單克隆抗體治療泛發(fā)性活動(dòng)期白癜風(fēng)，部分患者皮損得到改善［11］。

2010 年，Jin 等［3］在歐洲人群中進(jìn)行了一項(xiàng)大樣本量白癜風(fēng)全基因組關(guān)聯(lián)研究，并在另外獨(dú)立人群驗(yàn)證，報(bào)道了IL2RA-RBM17區(qū)域SNP與尋常型白癜風(fēng)易感性相關(guān)，2013年，Tang 等［4］再次驗(yàn)證 IL2RA、RBM17 與漢族人白癜風(fēng)易感性的相關(guān)性。在本研究中，5個(gè)SNP的等位基因頻率在蒙古族白癜風(fēng)和蒙古族健康對(duì)照間存在差異，并在顯性模式下達(dá)到Bonferroni校正水平（P＜0.005 6）。證實(shí)該區(qū)域的基因多態(tài)性與白癜風(fēng)具有關(guān)聯(lián)性。單倍型分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個(gè)保護(hù)性單倍型（H2：CGCTA）與白癜風(fēng)易感性相關(guān)（P=0.001 6，OR=0.67），更加證實(shí)了該區(qū)域與蒙古族白癜風(fēng)相關(guān)性，存在不同人種白癜風(fēng)的共同易感基因。

本研究通過對(duì)IL2RA-RBM17基因區(qū)域9個(gè)SNP進(jìn)行分型研究，證實(shí)了其與中國蒙古族白癜風(fēng)的相關(guān)性，更進(jìn)一步提示IL2RA-RBM17基因在白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。但是本區(qū)域覆蓋范圍較大，約80 kb。具體的易感基因需要進(jìn)一步精細(xì)定位。該區(qū)域有2個(gè)已知的基因：IL2RA和RBM17。究其基因功能，IL-2及其受體在調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化過程中起重要作用。IL2基因變異小鼠表現(xiàn)為調(diào)節(jié)T細(xì)胞改變，有自身免疫異常傾向。

總之，本研究以蒙古族白癜風(fēng)為研究對(duì)象，對(duì)IL2RA-RBM17區(qū)域的SNP分型研究，發(fā)現(xiàn)IL2RARBM17區(qū)域基因多態(tài)性與蒙古族白癜風(fēng)具有相關(guān)性。但本研究尚有一些不足之處：由于樣本量有限，對(duì)于陰性結(jié)果的SNP與蒙古族白癜風(fēng)的相關(guān)性不能完全除外。本研究基于單個(gè)基因的多態(tài)性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，基因-基因間復(fù)雜交互作用未能明確，而龐大的基因網(wǎng)絡(luò)中相互作用非常廣泛和復(fù)雜，遺傳變異與疾病易感性的相關(guān)性是否會(huì)受到其他基因的影響尚不能確定。這9個(gè)SNP并非影響基因功能和表達(dá)的功能變異，IL2RA-RBM17基因區(qū)域的白癜風(fēng)易感基因仍未能明確，需進(jìn)一步研究。

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Association of single nucleotide polymorphisms in the IL2RA-RBM17 region with vitiligo in the Chinese Mongolian population

Wurina,Han Jianwen,Liu Jia,Buheqiqige,Gerile,Bai Yunhua

Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010050,China（WRN,Han JW,Liu J,BHQQG）;Department of Dermatology,Hulunbeier People′s Hospital,Hulunbeier 021000,Inner Mongolia,China（BaiYH）;DepartmentofDermatology,XilinGolLeagueMongolianHospital,Xilinhot026000,InnerMongolia,China（GRL）

Objective To investigate the association between single nucleotide polymorphisms （SNPs）in the IL2RA-RBM17 region and vitiligo in the Chinese Mongolian population.Methods Five milliliters of venous blood samples were collected from 425 patients with vitiligo（patient group）and 503 healthy human controls（control group）of Mongolian nationality after informed consent,and genomic DNA was extracted with the AxyPrep DNA extraction kit（APMX-BL-GDNA-25）.Nine SNPs were selected across the IL2RA-RBM17 region,including rs706779,rs3134883,rs7090530,rs12251307,rs4750005,rs3920615,rs4747887,rs4750012 and rs7099083.Ligase detection reaction（LDR）was performed for SNP genotyping.With the PLINK 1.07 and SPSS 11.0 packages,statistical analysis was carried out by the chi-square test for comparisons of allele and genotype frequencies between the patient group and control group.Linkage disequilibrium analysis was performed for 5 SNPs by calculating ther2andD′values.Haplotype analysis of 5 related SNPs was conducted to investigate differences in haplotype frequencies between the patient group and control group.Results There were significant differences in allele frequencies of 5 SNPs,including rs4750005,rs3920615,rs4747887,rs4750012 and rs7099083,between the patient group and control group （allP＜0.05）.Under a dominant mode of inheritance,a significant decrease was observed in the frequencies of GG/GC genotypes of rs3920615,CT/CC genotypes of rs4747887,CT/CC genotypes of rs4750005,TC/TT genotypes of rs4750012 and AG/AA genotypes of rs7099083 in the patient group compared with the control group （allP ＜ 0.005 6）.Moderate to strong linkage disequilibrium was observed between the 5 SNPs （D′=0.424-1,r2=0.137-0.985）.Haplotype analysis showed that the frequency of a haplotype（H2:CGCTA）was significantly lower in the patient group than in the control group,and the difference reached statistical significance after Bonferroni adjustment（P=0.001 6,OR=0.674）.Conclusion SNPs in the IL2RA-RBM17 region are associated with vitiligo in the Chinese Mongolian population.

Vitiligo;Polymorphism,single nucleotide;Mongolia;Genetic association studies;Genes,IL2RARBM17;China

Wu Rina,Email:wurinawu506@hotmail.com

烏日娜，Email：wurinawu506@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.06.010

國家自然科學(xué)基金（81160189）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81160189）

2016-01-05）

（本文編輯：吳曉初）