普萘洛爾及異丙腎上腺素對(duì)體外培養(yǎng)嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響

朱雅琳 侯巍 帕麗達(dá)·阿布利孜

830054烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科

·論著·

普萘洛爾及異丙腎上腺素對(duì)體外培養(yǎng)嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響

朱雅琳 侯巍 帕麗達(dá)·阿布利孜

830054烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科

目的 探討普萘洛爾及異丙腎上腺素在體外對(duì)嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF、VEGF-2）、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）表達(dá)的影響。方法 將體外培養(yǎng)的2～3代增殖期嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞分為普萘洛爾組和異丙腎上腺素組，其中普萘洛爾組分別換濃度為10、15、20 mg/L普萘洛爾工作液（10、15、20 mg/L普萘洛爾組）、空白EGM-2培養(yǎng)基（空白組）和含0.16%DMSO EGM-2培養(yǎng)基（DMSO組）培養(yǎng)，而異丙腎上腺素組分別換5、10、20 mg/L異丙腎上腺素工作液（5、10、20 mg/L異丙腎上腺素組）和空白EGM-2培養(yǎng)基（空白組）培養(yǎng)。采用MTT法測(cè)定24、48、72、96 h時(shí)各組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖情況，ELISA法測(cè)定培養(yǎng)24、48 h時(shí)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF、VEGF-2、bFGF的濃度。 結(jié)果 培養(yǎng)24、48 h時(shí)，10、15、20 mg/L普萘洛爾組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H值分別為1.152、2.643，均P＞0.05）；72、96 h時(shí)，20 mg/L普萘洛爾組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖明顯低于空白組（P＜0.05），而空白組、DMSO組及10、15 mg/L普萘洛爾組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各濃度普萘洛爾、異丙腎上腺素作用24 h時(shí)均對(duì)VEGF、VEGF-2、bFGF水平有一定影響。48 h時(shí)，15、20 mg/L普萘洛爾組VEGF水平均較空白組顯著下降，同時(shí)10、15、20 mg/L普萘洛爾組VEGF-2、bFGF水平也均較空白組顯著下降（P＜0.05）；而5、10、20 mg/L異丙腎上腺素組VEGF水平均較空白組顯著升高（P＜0.05），20 mg/L異丙腎上腺素組VEGF-2、bFGF水平均顯著高于空白組及5、10 mg/L異丙腎上腺素組（P＜0.05）。結(jié)論 一定濃度普萘洛爾作用于增殖期嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞一定時(shí)間后能夠抑制細(xì)胞生長，而異丙腎上腺素反之，兩者對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的影響作用也相反，因此推斷普萘洛爾治療嬰兒血管瘤的機(jī)制可能與β腎上腺素能受體及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)。

血管瘤；內(nèi)皮細(xì)胞；普萘洛爾；異丙腎上腺素；成纖維細(xì)胞生長因子2；內(nèi)皮生長因子

目前血管瘤的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主要有遺傳和基因突變學(xué)說、胎盤絨毛膜細(xì)胞異位學(xué)說、內(nèi)皮祖細(xì)胞或干細(xì)胞學(xué)說、血管發(fā)生失衡理論等［1-7］。自2008年始，大量研究和臨床資料顯示，普萘洛爾對(duì)血管瘤有明顯療效［8-11］。近期有報(bào)道認(rèn)為，異丙腎上腺素在體外能促進(jìn)血管生成［12］，但機(jī)制不清。普萘洛爾和異丙腎上腺素均作用于β腎上腺素受體，前者為受體阻斷劑，后者為受體激動(dòng)劑。β腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到人們重視。此外，內(nèi)皮細(xì)胞增殖失控已成為血管瘤發(fā)病機(jī)制研究的一個(gè)重要方面，其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等促血管生成因子在患兒體內(nèi)及組織中高表達(dá)，是增生期血管瘤的主要發(fā)病機(jī)制［13-15］，而VEGF是作用最強(qiáng)的一種［16-18］。本研究使用一定濃度的普萘洛爾及異丙腎上腺素作用于體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，比較二者對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境下的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)用ELISA分別測(cè)定兩種藥物作用前后VEGF、VEGF-2、bFGF的變化，研究普萘洛爾治療嬰兒血管瘤的機(jī)制以及β受體在嬰兒血管瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

材料和方法

1.樣本來源：血管瘤標(biāo)本來自臨床手術(shù)切除的額部增殖期血管瘤，患兒女，9個(gè)月?；純焊改妇橥?。

2.主要試劑與儀器：EBM-2培養(yǎng)基、EGMTM-2MV BulletKitTM（瑞士Lonza公司），0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、含雙抗 PBS（美國 HyClone公司），20%胎牛血清（美國Gibco公司），兔抗人血漿血管性血友病因子（vwf）多克隆抗體、聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG、兔抗人VEGFR-2抗體（武漢博士德生物工程有限公司），抗人CD31 FITC、鼠IgG1 K同型對(duì)照FITC（美國 eBioscience公司），MTT、DMSO（美國Sigma公司），AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海貝博生物）。酶標(biāo)儀、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），MACSQuant流式細(xì)胞儀（德國MiltenyiBiotec公司）。VEGF、VEGF-2、bFGF的ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。

3.普萘洛爾對(duì)細(xì)胞生長曲線的影響：首先配制含普萘洛爾的培養(yǎng)基，用DMSO溶解普萘洛爾，用EGM-2培養(yǎng)基稀釋成 10、15、20 mg/L工作液，DMSO終濃度為0.16%，0.22 μm濾器過濾分裝。血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定見文獻(xiàn)［19］。取2代細(xì)胞消化離心并計(jì)數(shù)，均勻鋪入96孔板，每孔2×104個(gè)，加入 EGM-2 培養(yǎng)基 200 μl，孵育 24 h，待細(xì)胞貼壁后換液。將細(xì)胞隨機(jī)分為5組，分別換濃度為10、15、20 mg/L普萘洛爾工作液，空白EGM-2培養(yǎng)基（空白組）和含0.16%DMSO EGM-2培養(yǎng)基（DMSO組），每組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于 24、48、72、96 h 用 MTT 法［19］測(cè)定其吸光度（A值），觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。以時(shí)間做橫坐標(biāo)，平均A值為縱坐標(biāo)，分別做每個(gè)濃度的細(xì)胞平均A值折線圖。

4.普萘洛爾及異丙腎上腺素對(duì)體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF、VEGF-2、bFGF的影響：取2～3代增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，在6孔板中調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/ml，每孔2 ml。隨后將6孔板放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后換液。將細(xì)胞分為普萘洛爾組和異丙腎上腺素組，其中普萘洛爾組又分為5組，分別換濃度為10、15、20 mg/L普萘洛爾工作液、空白EGM-2培養(yǎng)基（空白組）和含0.16%DMSOEGM-2培養(yǎng)基（DMSO組），每組8個(gè)復(fù)孔。異丙腎上腺素組分為4組，分別換EGM-2培養(yǎng)基稀釋而成的5、10、20 mg/L異丙腎上腺素工作液和空白EGM-2培養(yǎng)基（空白組），每組8個(gè)復(fù)孔。各組在作用24、48 h時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用 ELISA法分別檢測(cè)各組 VEGF、VEGF-2、bFGF的水平。

5.統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS17.0軟件，由于A值數(shù)據(jù)非正態(tài)，多組A值的比較采用多組獨(dú)立樣本的Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。細(xì)胞因子濃度計(jì)量資料采用±s表示，計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，方差齊使用單因素方差分析，兩兩比較為SNK法，方差不齊則使用Dunnett方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.普萘洛爾對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的影響：普萘洛爾作用前，各孔細(xì)胞貼壁生長良好，20 mg/L普萘洛爾作用96 h后，細(xì)胞形態(tài)呈圓形及類圓形，細(xì)胞間距增大，細(xì)胞變稀疏（圖1）。10、15、20mg/L普萘洛爾分別作用24～96h（圖2），24～48h時(shí)，空白組、DMSO 組及 10、15、20 mg/L普萘洛爾組間血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H值分別為1.152、2.643，均 P ＞ 0.05）；72、96 h 時(shí)，各組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況不全相同（H值分別為13.521、11.329，均P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，72 h時(shí)空白組與DMSO組細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各濃度普萘洛爾組細(xì)胞增殖活性隨普萘洛爾濃度的升高而下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；96 h時(shí)空白組與DMSO組細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），10、15 mg/L普萘洛爾組較空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而20 mg/L組細(xì)胞增殖活性明顯低于空白組（P＜0.05）。

2.不同濃度普萘洛爾對(duì)體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞 VEGF、VEGF-2、bFGF 水平的影響（表 1）：空白組和DMSO組VEGF、VEGF-2、bFGF水平在24、48 h時(shí)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；10、15、20 mg/L 普萘洛爾作用24 h時(shí)，各組VEGF含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；15、20 mg/L普萘洛爾組均較空白組和10 mg/L普萘洛爾組VEGF-2水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而 15、20 mg/L普萘洛爾組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；10、15、20 mg/L 普萘洛爾組bFGF水平均明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而這3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 10、15、20 mg/L普萘洛爾作用24～96 h對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響24、48 h時(shí)，空白組、二甲基亞砜（DMSO）組與 10、15、20 mg/L 普萘洛爾組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖無明顯差別，但在72、96 h時(shí)各組A值不全相同

表1 普萘洛爾作用血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24、48 h后細(xì)胞培養(yǎng)上清液血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF、VEGF-2）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）含量（±s，ng/L）

表1 普萘洛爾作用血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24、48 h后細(xì)胞培養(yǎng)上清液血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF、VEGF-2）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）含量（±s，ng/L）

注：n=8。a：與空白組比較，P ＜ 0.05；b：與 10 mg/L 普萘洛爾組比較，P ＜ 0.05

組別24 h 48 h VEGF VEGF-2 bFGF VEGF VEGF-2 bFGF空白組 251.00±44.34 83.82±1.21 10.27±0.34 702.40±91.79 110.50±3.88 14.46±0.30二甲基亞砜組 228.70±12.75 85.14±2.55 11.59±0.49 659.60±95.88 100.60±3.59 14.58±0.32 10 mg/L普萘洛爾組 212.00±38.81 81.90±1.96 5.43±0.63a 621.20±32.08 81.83±3.16a 8.01±0.59a 15 mg/L普萘洛爾組 262.50±134.90 73.65±0.60ab 5.70±0.34a 484.30±53.17a 71.21±0.83ab 7.97±0.61a 20 mg/L普萘洛爾組 211.70±23.79 71.21±2.32ab 5.07±0.22a 535.90±5.36a 69.42±1.37ab 8.02±0.33a F值 1 236.23 872.23 182.11 8 922.34 2 251.22 159.21 P值 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

作用48 h時(shí)，15、20 mg/L普萘洛爾組VEGF水平均較空白組顯著下降（P＜0.05），而10 mg/L普萘洛爾組VEGF水平與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；10、15、20 mg/L 普萘洛爾組 VEGF-2、bFGF水平均較空白組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中15、20 mg/L普萘洛爾組較10 mg/L組VEGF-2水平低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3.不同濃度異丙腎上腺素對(duì)體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞 VEGF、VEGF-2、bFGF 水平的影響（表 2）：5、10、20 mg/L異丙腎上腺素作用于體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24 h時(shí)，20 mg/L異丙腎上腺素組較空白組、5 mg/L異丙腎上腺素組VEGF水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與10 mg/L異丙腎上腺素組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），空白組與5 mg/L組差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；5、10、20 mg/L 異丙腎上腺素組VEGF-2水平均較空白組顯著升高（P＜0.05），且VEGF-2水平隨異丙腎上腺素濃度的增加而顯著增加（P＜0.05）；20 mg/L異丙腎上腺素組bFGF水平較空白組、5、10 mg/L異丙腎上腺素組顯著升高（P＜0.05），而后3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

作用 48 h 時(shí)，5、10、20 mg/L 異丙腎上腺素組VEGF水平均較空白組顯著升高（P＜0.05），而前3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；20 mg/L異丙腎上腺素組VEGF-2、bFGF水平均顯著高于空白組、5、10 mg/L異丙腎上腺素組（P＜0.05），而后3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

討 論

普萘洛爾是一種β腎上腺素受體阻斷劑，能夠特異性地阻斷β1和β2腎上腺素受體。臨床上，普萘洛爾常被用于兒童偏頭痛、心律失常、甲狀腺功能亢進(jìn)以及法洛四聯(lián)癥等疾病的治療。2008年，Léauté-Labrèze發(fā)現(xiàn)普萘洛爾可以治療嬰幼兒血管瘤［8］，但其機(jī)制不清。血管瘤中血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖及消退期凋亡主要認(rèn)為與局部微環(huán)境的變化（血管形成因子與血管形成抑制因子失衡等）及內(nèi)皮細(xì)胞自身的轉(zhuǎn)化有關(guān)，其中內(nèi)皮細(xì)胞增殖失控的機(jī)制成為血管瘤發(fā)病機(jī)制研究的一個(gè)重要方面，表現(xiàn)為增殖期促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管形成的因子過度表達(dá)，血管形成抑制因子低表達(dá)，而后者在消退期高表達(dá)。

本研究采用普萘洛爾處理體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，24～48 h各濃度普萘洛爾對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞無明顯影響，72～96 h低濃度（10、15 mg/L）普萘洛爾對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞仍無明顯影響，而高濃度（20 mg/L）普萘洛爾明顯抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察也顯示，20 mg/L普萘洛爾可抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長。我們前期的研究［19］顯示，β腎上腺素受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素作用血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24～72 h內(nèi)，對(duì)細(xì)胞增殖的影響不大，但在96 h后隨異丙腎上腺素濃度的增高，細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，提示異丙腎上腺素對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用，與普萘洛爾的作用恰恰相反，因此推斷β腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

表2 異丙腎上腺素作用血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24、48 h后細(xì)胞培養(yǎng)上清液血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF、VEGF-2）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）含量（±s，ng/L）

表2 異丙腎上腺素作用血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24、48 h后細(xì)胞培養(yǎng)上清液血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF、VEGF-2）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）含量（±s，ng/L）

注：n=8。a：與空白組比較，P ＜ 0.05；b：與 5 mg/L 異丙腎上腺素組比較，P ＜ 0.05；c：與 10 mg/L 異丙腎上腺素組比較，P ＜ 0.05

48 h VEGF VEGF-2 bFGF VEGF VEGF-2 bFGF空白組 228.70±12.75 95.82±1.51 11.59±0.49 384.20±98.70 110.50±3.88 14.58±0.32 5 mg/L異丙腎上腺素組 230.70±18.12 97.93±1.96a 11.48±0.25 439.10±87.95a 111.40±4.23 12.95±0.39 10 mg/L異丙腎上腺素組 323.60±19.88 105.40±1.92ab 11.81±0.23 537.30±108.90a 110.70±4.38 13.65±1.01 20 mg/L異丙腎上腺素組 383.70±84.93ab 117.80±2.11abc 19.33±0.33abc 609.60±95.88a 142.50±5.26abc 22.80±1.62abc F值 3 766.56 2 796.21 286.22 8 241.22 2 119.36 273.21 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 24 h組別

目前發(fā)現(xiàn)的一系列促血管生成因子中，VEGF是作用最強(qiáng)的一種。VEGF是一種能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、增加血管通透性的糖蛋白，可與特定的受體即內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（VEGFR）結(jié)合發(fā)揮作用。VEGFR-2與血管瘤的發(fā)生和發(fā)展有非常密切的關(guān)系［13］，主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞、巨核細(xì)胞、造血干細(xì)胞等。VEGFR-2與VEGF結(jié)合可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，抑制其凋亡，增加血管通透性。bFGF分布廣泛，是強(qiáng)烈的內(nèi)皮細(xì)胞和管壁結(jié)締組織的促生長因子，可能是參與血管瘤生長的主要因子，被認(rèn)為是血管瘤生長的重要標(biāo)志之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞是血管瘤組織中bFGF合成的主要細(xì)胞［14］。本研究中普萘洛爾和異丙腎上腺素對(duì)于VEGF、VEGF-2、bFGF這3種細(xì)胞因子的影響作用相反，即普萘洛爾抑制3種細(xì)胞因子的分泌，而異丙腎上腺素則相反，刺激3種細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)一步證明了β腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

綜上，兩種藥物是通過阻斷或激動(dòng)β腎上腺素受體，進(jìn)而影響下游的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞分泌 VEGF、VEGF-2、bFGF，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化，血管形成過程受到影響，呈現(xiàn)兩種藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制或促進(jìn)效應(yīng)，但是否還存在其他的作用途徑，例如是否對(duì)β腎上腺素受體的表達(dá)存在影響等，還有待進(jìn)一步研究。

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In vitroeffects of propranolol and isoproterenol on proliferation of cultured infantile hemangioma endothelial cells and expressions of vascular endothelial growth factors and basic fibroblast growth factor

Zhu Yalin,Hou Wei,Paride Abliz

Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China

Objective To evaluatein vitroeffects of propranolol and isoproterenol on proliferation of infantile hemangioma endothelial cells（IHECs）as well as expressions of vascular endothelial growth factors（VEGF and VEGF-2）and human basic fibroblast growth factor（bFGF）.Methods The second-third passage endothelial cells derived from the proliferative phase of infantile hemangioma were divided into propranolol and isoproterenol groups.The propranolol group was further classified into 5 groups to be treated with propranolol solutions at concentrations of 10,15,20 mg/L,EGM-2 medium （blank control group 1）,or EGM-2 medium containing 0.16%DMSO （DMSO group）,while the isoproterenol group was classified into 4 groups to be treated with isoproterenol solutions at concentrations of 5,10,20 mg/L or EGM-2 medium（blank control group 2）.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was performed to evaluate cellular proliferative activity in these propranolol groups at 24,48,72 and 96 hours separately,enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）to measure VEGF,VEGF-2 and bFGF levels in culture supernatants of IHECs at 24 and 48 hours separately.Results The proliferative activity of IHECs showed no significant differences between 10-,15-and 20-mg/L propranolol groups at either 24 or 48 hours（H=1.152,2.643,respectively,bothP＞0.05）,or between the blank control group 1,DMSO group,and 10-and 15-mg/L propranolol groups at either 72 or 96 hours,but significantly decreased in the 20-mg/L propranolol group compared with the blank control group 1 at 72 and 96 hours（bothP＜0.05）.The 24-hour treatments with propranolol or isoproterenol at the above concentrations all affected the expressions of VEGF,VEGF-2 and bFGF to different degrees.At 48 hours,there was a significant decrease in VEGF levels in 15-and 20-mg/L propranolol groups,as well as in VEGF-2 and bFGF levels in 10-,15-and 20-mg/L propranolol groups compared with the blank control group 1 （allP＜0.05）,but a significant increase in VEGF levels in 5-,10-and 20-mg/L isoproterenol groups compared with the blank control group 2 （allP ＜ 0.05）,as well as in VEGF-2 and bFGF levels in the 20-mg/L isoproterenol group compared with the blank control group 2,5-and 10-mg/L isoproterenol groups （allP ＜ 0.05）.Conclusions The treatment with propranolol at certain concentrations for certain durations can suppress the growth of,as well as expressions of VEGF,VEGF-2 and bFGF in,endothelial cells derived from the proliferative phase of infantile hemangioma,whereas that with isoproterenol has opposite effects.The therapeutic mechanism of propranolol in infantile hemangioma may be associated with expressions of β-adrenergic receptors and their downstream signal transductionrelated cytokines.

Hemangioma;Endothelial cells;Propranolol;Isoproterenol;Fibroblast growth factor 2;Endothelial growth factors

Paride Abliz,Email:palidae@aliyun.com

帕麗達(dá)·阿布利孜，Email：palidae@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.002

2015-05-25）

（本文編輯：周良佳 顏艷）