CD40基因多態性及血清水平與系統性紅斑狼瘡發病機制的相關研究

吳成將 袁秋然 莫益姣 梁麗群 王春芳 蔣遠文 藍艷

533000廣西百色市，右江民族醫學院附屬醫院檢驗科（吳成將、袁秋然、莫益姣、梁麗群、王春芳），皮膚科（蔣遠文、藍艷）

CD40基因多態性及血清水平與系統性紅斑狼瘡發病機制的相關研究

吳成將 袁秋然 莫益姣 梁麗群 王春芳 蔣遠文 藍艷

533000廣西百色市，右江民族醫學院附屬醫院檢驗科（吳成將、袁秋然、莫益姣、梁麗群、王春芳），皮膚科（蔣遠文、藍艷）

目的 探討CD40基因單核苷酸多態性（SNP）及其單倍型與SLE易感性的相關性，分析CD40基因型及血清水平與系統性紅斑狼瘡（SLE）的相關性。方法 單堿基延伸的PCR技術（PCR-SBE）和DNA測序法分析 205例 SLE患者和 220例健康對照 CD40基因 rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T和rs3765459 G/A的多態性，同時用ELISA檢測血清CD40水平。結果 與健康對照組相比，SLE組血清CD40水平顯著增高（P＜0.05）。SLE組與健康對照組CD40基因rs1883832 C/T位點基因型和等位基因頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。等位基因頻率的相對風險分析后發現，攜帶有rs1883832 T等位基因的受試者患有SLE的風險是 rs1883832 C等位基因的 1.517倍（OR=1.517，95%CI1.157～1.990，P=0.003）；攜帶 rs1883832 T等位基因的SLE患者血清CD40水平與不攜帶者相比，結果顯著增高（P＜0.01）。通過聯合基因型分析發現，SLE組中攜帶單倍型TCCA的患者較健康對照組顯著增加了發病的風險（OR=2.322，95%CI1.181～4.564，P=0.012）。結論 CD40基因rs1883832 C/T多態性和TCCA單倍型與SLE的發病有相關性，其中rs1883832 T等位基因可能是SLE的遺傳易感基因。

紅斑狼瘡，系統性；抗原，CD40；多態性，單核苷酸；單倍型；基因型；等位基因

系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種好發于青年女性的累及多臟器的自身免疫性疾病。本病病因至今尚未肯定，普遍認為與遺傳、內分泌、感染、免疫異常和環境等多種因素有關。研究表明，遺傳因素在SLE的易感性中起著重要的作用［1-3］。CD40是一種腫瘤壞死因子受體超家族成員，在上皮細胞、平滑肌細胞等非免疫細胞以及B細胞、巨噬細胞和樹突細胞等免疫細胞上均有表達。已有研究表明，CD40基因多態性與類風濕性關節炎［4］、Graves 病［5］等多種自身免疫疾病遺傳易感性有關聯。因此，我們對CD40基因 rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T 和rs3765459 G/A多態性及單倍性與SLE疾病遺傳易感性的關系進行了研究。

對象與方法

一、對象

收集2013年10月至2014年11月在本院風濕免疫科就診的SLE患者205例，其中男36例，女169例，年齡30～82歲；SLE的診斷標準符合1997年美國風濕病學會修訂的SLE分類診斷標準。本院健康體檢者220例，其中男42例，女178例，年齡29～78歲。以上研究對象均來自廣西，彼此無血緣關系。本研究通過醫院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

二、方法

1.基因組DNA提取：用EDTA-K2抗凝管采集受試對象的靜脈血2 ml，白細胞基因組DNA的提取方法，參照已建立的改良碘化鈉法［6-7］。

2.引物設計與合成：根據CD40基因rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T 和 rs3765459 G/A位點多態性和已知的DNA序列設計PCR引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特異擴增CD40基因包含rs13040307 C/T位點的上下游引物序列分別是：5′-GGCTGGATGACCCTGTGAGAGA-3′，5′-AGCCAGGACCCTGCCTGCTA-3′，其延伸引物序列是：5′-AGCCAGGACCCTGCCTGCTA-3′；用于特異擴增CD40基因包含rs3765459 G/A位點的上下游引物序列：5′-CCACTGGC TCCCACTCTGGA-3′，5′-GGTGGGTGCAGCCTCACTGT-3′，其延伸引物序列：5′-TCCCCCCTTTCCCAGACGG-3′；用于特異擴增CD40基因包含rs1883832 C/T位點的上下游引物序列：5′-GGACCTGGGGGCAAAGAAGA-3′，5′-CCCACTCCCAACTCCCGTCT-3′，其延伸引物序列：5′-TTTTTTTTTTTTGCAGAGGCAGACGAACCAT-3′；用于特異CD40基因包含rs752118 C/T位點的上下游引物序列與用于擴增包含rs1883832 C/T位點的上下游引物序列相同但延伸引物不一樣，其延伸引物序列：5′-TTTTGTGTACGGGAGGAGG CATG-3′。

3.PCR擴增：CD40的PCR擴增反應體系共為20 μl，其中包含了 10 × PCR 緩沖液 2 μl，0.3 mmol/L dNTP 2 μl，上、下游引物均為 1 μl，模板 DNA 1 μl，TaqDNA聚合酶1 U，體積若不足，則用滅菌雙蒸水補足至 20 μl。PCR產物用德國 Qiagen公司的HotStarTaq進行多重PCR來獲得，PCR產物通過蝦堿酶（美國Promega公司）和外切酶Ⅰ（美國Epicentre公司）純化后用美國ABI公司的SNaPshot Multiplex試劑盒進行延伸反應。延伸的產物用蝦堿酶純化后在ABI3730XL上樣。用GeneMapper4.1來分析SNP分型。

4.血清CD40水平的檢測：用ELISA測定CD40血清水平，按照試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）說明書操作。

5.統計學處理：用SPSS11.5軟件包進行統計分析。SLE組與健康對照組各基因型間血清CD40水平的比較用±s表示，組間比較采用獨立樣本的t檢驗。各等位基因和基因型分布頻率均采用直接計數法計算，各組間等位基因和基因型分布頻率比較均采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、CD40基因多肽性檢測結果

CD40基因 rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T和rs3765459 G/A多態性，經PCR擴增后的產物片段分別為 374、183、374、372 bp。SNP 分型結果顯示 rs1883832 C/T、rs13040307 C/T和rs752118 C/T位點均存在CC、CT和TT 3種基因型；rs3765459 G/A位點存在GG、GA和AA 3種基因型。基因測序再一次驗證了我們的檢測結果（圖1～4）。

二、SLE組和健康對照組CD40基因多態性的比較

在兩組人群中，CD40基因型分布頻率，均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明所選對象具有一定的群體代表性。SLE組與健康對照組CD40基因rs1883832 C/T位點基因型和等位基因頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。CD40基因rs13040307 C/T、rs752118 C/T和 rs3765459 G/A多態性在 SLE組和健康對照組中分布比較，差異無統計學意義（均P＞0.05，表1）。此外，我們分析了SLE組中CD40基因rs1883832 C/T位點基因型和臨床表型之間的相關性，發現SLE組中，rs1883832 C/T多態性TT和CT基因型攜帶者中患有腎炎和白細胞減少癥的人數比CC基因型攜帶者明顯增加（P＜0.05，表 2）。

圖1 CD40基因rs1883832 C/T測序圖 1A～1C：分別表示CC、CT和TT基因型；箭頭所示為基因突變位點 圖2 CD40基因rs13040307 C/T測序圖 2A～2C：分別表示CC、CT和TT基因型；箭頭所示為基因突變位點 圖3 CD40基因rs752118 C/T測序圖 3A～3C：分別表示CC、CT和TT基因型；箭頭所示為基因突變位點 圖4 CD40基因rs3765459 G/A測序圖 4A～4C：分別表示GG、GA和AA基因型；箭頭所示為基因突變位點

表1 系統性紅斑狼瘡（SLE）組與健康對照組CD40基因多態性分布頻率的比較［例（%）］

三、SLE組與健康對照組CD40基因的單倍型分析

CD40 （rs1883832 C/T/rs13040307 C/T/rs752118 C/T/rs3765459 G/A）基因單倍型分布頻率的比較見表3。除SLE組TCCA基因單倍型攜帶者較健康對照組明顯增加了發病風險（OR=2.322，95%CI1.181 ～ 4.564，P=0.012）外，其余差異無統計學意義（均P＞0.05）。

四、SLE組與健康對照組各基因型間血清CD40水平的比較

SLE組中血清CD40水平顯著高于健康對照組，［（58.5 ± 22.8）pg/ml，n=205］比［（41.7 ± 13.2）pg/ml，n=220］；P ＜ 0.001，圖 5。SLE組中CD40基因rs1883832 C/T多態性TT和CT基因型血清CD40水平較CC基因型明顯升高，差異有統計學意義［（62.6±23.3）pg/ml，n=53］或［（59.9 ± 22.6）pg/ml，n=105］比［（50.7 ±20.4）pg/ml，n=47］，P ＜ 0.01，而 CT 基因型和 TT基因型攜帶者血清CD40水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05，圖6）。

表2 CD40基因rs1883832 C/T基因型分布頻率和臨床表型的相關性［例（%）］

表3 系統性紅斑狼瘡（SLE）組與健康對照組CD40基因單倍型分布頻率的比較［例（%）］

圖5 系統性紅斑狼瘡組血清CD40水平顯著高于健康對照組a：與健康對照組比較，P＜0.01

圖6 系統性紅斑狼瘡組中CD40基因rs1883832 C/T多態性TT和CT基因型血清CD40水平較CC基因型明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01），CT基因型和TT基因型攜帶者血清CD40水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05） a：分別與CC基因組比較，P＜0.01

討 論

Duffau等［8］發現，SLE患者中血小板源性CD40L與漿細胞樣樹突細胞上表達的CD40相互作用分泌干擾素 α。Koshy 等［9］證明 CD40-CD40L 共刺激分子通路在SLE的發病機制中具有重要作用。此外，Boumpas等［10］發現，使用人源化抗 CD40L 抗體治療彌漫增生性狼瘡性腎炎能夠降低患者體內抗dsDNA抗體水平，增加C3濃度并且降低血尿等癥狀。本研究顯示，SLE組血漿sCD40水平明顯高于健康對照組，結果表明，CD40可能與SLE患者發病有關。

已有學者對CD40基因和SLE相關性進行了研究，但這些研究結果并不一致。Vazgiourakis等［11］研究表明，CD40中rs4810485 G/T和T/T基因型與希臘和土耳其人SLE遺傳易感性有相關性。Piotrowski等［12］報道，在波蘭人群中，CD40 基因 rs4810485G/T多態性和SLE之間無顯著相關性。但是，Lee等［13］發現，CD40基因rs4810485G/T多態性的基因型以及等位基因頻率在歐洲人群SLE組和健康對照組間差異有統計學意義。Joo等［14］證明，韓國人中CD40基因rs1883832C/T和SLE差異無統計學意義。我們研究結果顯示，在中國人群中CD40基因rs1883832C/T和SLE的發病有顯著的聯系。等位基因頻率的相對風險分析發現，rs1883832T等位基因攜帶者患SLE的風險是C等位基因的1.517倍（OR=1.517，95%CI1.157 ～ 1.990，P=0.003），提示rs1883832T等位基因也許是SLE的又一個遺傳易感基因。進行聯合基因型分析，我們進一步發現，SLE組中攜帶單倍型TCCA的患者攜帶較健康對照組明顯增加了發病的風險（OR=2.322，95%CI1.181 ～ 4.564；P=0.012）。結果提示，CD40 基因rs1883832 C/T多態性和單倍型TCCA同SLE的發病具有相關性。然而，我們并沒有發現rs13040307 C/T，rs752118 C/T，rs3765459 G/A 多態性和 SLE 的遺傳易感性有關。此外，我們還檢測了SLE組和健康對照組血清CD40水平，結果顯示，SLE組血清CD40水平顯著高于健康對照組，表明CD40可能參與SLE的發病。通過分析CD40基因多態性和血清CD40水平之間的關系，我們發現，攜帶rs1883832T等位基因的SLE患者血清CD40水平顯著高于不攜帶者，另外，我們分析了SLE組中CD40基因rs1883832 C/T位點基因型和臨床表型之間的相關性，發現SLE組中，rs1883832 C/T多態性TT和CT基因型攜帶者中患有腎炎和白細胞減少癥的人數較CC基因型攜帶者明顯增加，故認為病理狀態下，攜帶rs1883832T等位基因的患者可提高血清sCD40的表達，從而增加SLE的發病風險。

綜上所述，多種因素參與SLE的發病機制，遺傳易感基因在其中起著重要作用。我們的研究已經證明CD40基因rs1883832 C/T多態性和TCCA單倍型與SLE具有相關性，其中，T等位基因可能是SLE的遺傳易感基因。CD40基因多態性與SLE的確切分子機制尚未闡明，需要進一步研究。

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（本文編輯：吳曉初）

第六屆全國激光美容與面部年輕化學術大會暨第五屆全國微創美容學術大會征文通知

由中國醫師協會美容與整形醫師分會主辦的第六屆全國激光美容與面部年輕化學術大會及第五屆全國微創美容學術大會定于2016年5月5-8日在上海跨國采購會展中心召開，現就激光與微創美容的內容進行征文，熱忱歡迎各位同道和專家積極參與，將最新的工作經驗及科研成果展示給大家，以促進同行間的學習、交流與進步。

征文內容：各類損容性問題皮膚的光電治療技術；瘢痕的激光與非手術治療技術；光電技術與注射美容技術在面部年輕化中的聯合應用；眼周、口周、鼻周、頸部皮膚的精細化美容；光電設備在溶脂塑身中的應用；私密部位的精細化美容技術；光動力醫學美容的臨床與進展；色素性血管性皮膚病的治療進展；皮膚無創檢測技術；干細胞美容技術等抗衰老醫學新進展；疑難病例討論與典型病例展示；人體美學及美容心理學的相關內容；國際激光美容行業發展現狀與趨勢；激光美容技術的行業應用與融合發展；肉毒毒素注射的臨床與解剖；玻尿酸注射的臨床與并發癥；其他注射類產品的注射美容；脂肪注射美容；微針注射美容；美容護理與咨詢管理；互聯網與醫美等相關內容。

征文要求：①論文應具有較高的科學性、先進性和實用性，且未在任何刊物上正式發表；②文體形式不限，論著、綜述、述評、個案等。請提交500字左右的中文摘要，論文格式請按文題、單位地址、郵編、作者姓名、電話號碼或電子郵箱、摘要的順序排列；③稿件格式要求office2000以上word形式，視頻以AVI、mp4、MOV等常見格式為主。

投稿郵箱：zhengwen2016cmda@163.com，截稿日期：2016年2月28日，聯系人：王玉芝，13268260567。

Association of CD40 gene polymorphisms and serum CD40 levels with the pathogenesis of systemic lupus erythematosus

Wu Chengjiang,Yuan Qiuran,Mo Yijiao,Liang Liqun,Wang Chunfang,Jiang Yuanwen,Lan Yan
Department of Clinical Laboratory,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,Guangxi,China （Wu CJ,Yuan QR,Mo YJ,Liang LQ,Wang CF）;Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,Guangxi,China（Jiang YW,Lan Y）

ObjectiveTo explore the association of CD40 gene single nucleotide polymorphisms （SNPs）and haplotypes with the susceptibility to systemic lupus erythematosus（SLE）,as well as the association of serum levels and genotypes of CD40 with the occurrence of SLE.MethodsA multiplex PCR single-base extension assay（PCR-SBE）and DNA sequencing were performed to analyze 4 SNPs of the CD40 gene,including rs1883832 C/T,rs13040307 C/T,rs752118 C/T and rs3765459 G/A,in 205 patients with SLE （SLE group）and 220 healthy human controls（control group）.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to measure serum levels of CD40 in these subjects.ResultsCompared with the control group,the SLE group showed significantly increased serum levels of CD40（P＜0.05）.There were significant differences in genotype and allele frequencies of the SNP rs1883832 C/T in the CD40 gene between the SLE group and control group （allP＜0.01）.Relative risk analysis showed that the risk of developing SLE in rs1883832 T allele carriers was 1.517 times that in rs1883832 C allele carriers（OR=1.517,95%CI:1.157-1.990,P=0.003）.Moreover,serum levels of CD40 were significantly higher in rs1883832 T allele carriers than in rs1883832 C allele carriers（P＜0.01）.The risk of developing SLE was significantly increased in TCCA haplotype carriers compared with the healthy controls（OR=2.322,95%CI:1.181-4.564,P=0.012）.ConclusionThe CD40 gene rs1883832 C/T polymorphism and its TCCA haplotype were both associated with the occurrence of SLE,and the rs1883832 T allele may be a gene predisposing to SLE.

Lupus erythematosus,systemic;Antigens,CD40;Polymorphism,single nucleotide;Haplotypes;Genotype;Alleles

Lan Yan,Email:yylanyan@163.com

2015-06-04）

藍艷，Email：yylanyan@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.01.003

國家自然科學基金（81260234）；廣西醫療衛生重點科研課題（Z2012086）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81260234）;Key Program for Medical and Health Research in Guangxi Zhuang Autonomous Region（Z2012086）