須癬毛癬菌的組織工程皮膚感染模型的構建

曹玉萍 沈永年 呂桂霞 王樂 曾榮 李玲珺 馬鵬程 劉維達

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所性病科（曹玉萍），真菌科（沈永年、呂桂霞、劉維達），醫務處（王樂、曾榮），藥物研究室（李玲珺、馬鵬程）

須癬毛癬菌的組織工程皮膚感染模型的構建

曹玉萍 沈永年 呂桂霞 王樂 曾榮 李玲珺 馬鵬程 劉維達

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所性病科（曹玉萍），真菌科（沈永年、呂桂霞、劉維達），醫務處（王樂、曾榮），藥物研究室（李玲珺、馬鵬程）

目的 體外構建須癬毛癬菌的組織工程皮膚感染模型。方法 用牛Ⅰ型膠原溶液復合原代成纖維細胞培養3 d后，在其表面利用氣液界面培養原代角質形成細胞和黑素細胞12 d得到組織工程皮膚，取新鮮的須癬毛癬菌懸液5 μl對其進行感染，分別在12、24、48、72 h進行HE染色和PAS染色觀察。結果 成纖維細胞復合膠原構建結構致密均勻的組織工程真皮，其上角質形成細胞和黑素細胞形成了層次清晰、結構良好的組織工程表皮。須癬毛癬菌感染該組織工程皮膚后，隨時間延長，HE染色和PAS染色顯示須癬毛癬菌對組織工程皮膚結構的破壞逐漸加重，至48 h，表皮破壞最明顯，至72 h，組織工程皮膚的整體結構被菌絲和孢子所替代。結論 初步建立了須癬毛癬菌的組織工程皮膚感染模型。

組織工程；皮膚；動物替代試驗；感染；須癬毛癬菌

皮膚癬菌感染是較為常見的一種皮膚淺部真菌感染性疾病，其中以手足癬、體股癬和甲癬最為常見，該類疾病最主要致病菌包括，須癬毛癬菌、紅色毛癬菌等，須癬毛癬菌的發病率由于調查樣本量和地區間的差異波動于3.36%～40.9%之間［1-2］，作為一種親動物的皮膚癬菌，須癬毛癬菌可引起局部嚴重的炎癥反應，應引起重視。為了建立抗須癬毛癬菌藥物篩選的體外模型，本研究擬利用須癬毛癬菌感染組織工程皮膚，通過觀察其對皮膚的破壞程度和入侵深度的變化，初步構建一種新型的須癬毛癬菌感染的體外模型。

資料和方法

一、資料

1.實驗標本來源：正常人成纖維細胞（Fb）、角質形成細胞（KC）、黑素細胞（MC）來源于5～25歲正常男性包皮環切術后的包皮（南京鼓樓醫院泌尿外科和南京市第一醫院泌尿科提供）。須癬毛癬菌［CMCC（F）T.5a］由衛生部醫學微生物菌（毒）種保藏管理中心真菌中心［簡稱CMCC（F）］提供。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

2.試劑和儀器：Fb培養基為DMEM完全培養基、KC培養基為DK-SFM、MC培養基為M254，加入HMGS（美國Invitrogen公司）；須癬毛癬菌培養基為PDA；Transwell 12孔板購自美國Corning公司；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；CO2孵箱（美國Thermo公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；隔水式恒溫培養箱（上海精密科學儀器有限公司）。

二、方法

1.含色素細胞的組織工程皮膚培養，參見文獻［3］。具體方法：將4×105ml-1Fb重懸于Ⅰ型牛膠原混合液中，取1 ml/孔至Transwell 12孔板上室中，放置于37℃，5%CO2下孵育至完全凝固，向其加入1.5 ml培養基培養3 d得組織工程真皮。向真皮表面滴加0.45 ml含4.5×104MC和9×104KC的細胞懸液，置于37℃，5%CO2孵箱培養2 d，第6天進行氣液界面培養，第15天結束培養。

2.須癬毛癬菌培養：用PDA培養基培養須癬毛癬菌［CMCC（F）T.5a］7～10d后形成新鮮成熟的菌落，取新鮮成熟的須癬毛癬菌菌落置于盛有1ml生理氯化鈉溶液碾磨器中，充分碾磨均勻。用生理氯化鈉溶液將其濃度調整至1個麥氏濃度（106個孢子/ml）。

3.構建體外須癬毛癬菌感染的組織工程皮膚模型：由牛膠原溶液復合培養成纖維細胞后與KC、MC共培養得到含色素的組織工程皮膚，在結束培養的第15天，取5 μl須癬毛癬菌滴加于Transwell上室內的皮膚表面。向Transwell下室加入培養基，置于35℃ 5%CO2培養，分別于 12、24、48、72 h 終止培養。

4.須癬毛癬菌感染的組織工程皮膚模型的組織結構觀察：中性福爾馬林固定培養的組織工程皮膚4 h以上，梯度乙醇脫水后用二甲苯透明，石蠟包埋切片，脫蠟、度乙醇水化后，HE染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。

5.過碘酸雪夫染色（PAS染色）：切片按常規脫蠟水洗，1%～2%淀粉酶消化25 min后充分水洗，0.5%～1%過碘酸水溶液氧化5 min，Schiff試劑染15 min后水洗，明礬蘇木精染核水洗，脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。

結 果

一、含色素的組織工程皮膚

利用膠原溶液、成纖維細胞、角質形成細胞及黑素細胞培養15 d后成功建立了含色素的組織工程皮膚。牛Ⅰ型膠原復合培養成纖維細胞形成的組織工程真皮結構致密均勻，可見縱橫交錯的膠原纖維間散在分布梭形的成纖維細胞，真表皮交界清晰可見，表皮細胞層次緊密、細胞分層較為清楚（圖1A），在維持培養72 h后，組織工程皮膚結構穩定（圖1B）。

二、須癬毛癬菌的組織工程皮膚感染模型

須癬毛癬菌作用于組織工程皮膚12 h后，表皮層結構完整，可見菌絲粘附現象，圖2A中可見數條長短不一的菌絲粘附于表皮上方；須癬毛癬菌感染24 h后，表皮層上方可見垂直方向的菌絲穿入表皮內，表皮上部可見局部菌絲密集分布，染色較深，表皮中部及基底層角質形成細胞結構欠清晰，其間可見縱向分布的菌絲及部分菌絲的橫切面（圖2B）；須癬毛癬菌感染組織工程皮膚48 h時，表皮層結構嚴重破壞，可見成團狀分布或散在分布的粗細不一的菌絲（圖2C）；組織工程皮膚感染后72 h，組織工程皮膚大部分被大量須癬毛癬菌的長短不一的菌絲和孢子所替代（圖2D）。

討 論

本研究利用課題組［3］已建立的含色素的組織工程皮膚感染須癬毛癬菌，在不同時間點對其結構變化進行觀察，初步建立了須癬毛癬菌的含色素的組織工程皮膚感染模型。結果發現，隨著須癬毛癬菌和組織工程皮膚共培養時間的延長，菌絲由最初的粘附于組織工程皮膚表面，逐漸侵入表皮及真皮，對表皮層結構的破壞在感染后48 h最為顯著，在感染72 h后，整個組織工程皮膚基本被須癬毛癬菌的菌絲和孢子所代替。

圖1 不同時間點未加菌的含色素的組織工程皮膚（HE×200） 1A：0 h時，真皮內可見縱橫交錯的膠原纖維，其間散在分布梭形成纖維細胞，表皮結構致密。層次清晰；1B：72 h時，表皮結構與0 h時基本相同，真表皮內細胞層次變化不明顯 圖2 須癬毛癬菌作用于含色素的組織工程皮膚（PAS×400） 2A：感染12 h后，表皮結構完整，其上可見菌絲粘附；2B：感染24 h后，表皮層內可見大量長短不一的菌絲，表皮層結構仍完整；2C：感染48 h后，表皮內充滿縱橫交錯的菌絲，表皮結構完全破壞；2D：感染72 h后，組織工程皮膚基本被成團的菌絲所替代，皮膚結構及細胞基本消失

須癬毛癬菌是皮膚癬菌病的最常見致病菌之一，在伊朗一項10年的13 469疑似淺部皮膚真菌病的流行病學調查中發現，須癬毛癬菌的感染率高達17.6%［4］。國內亦有多項流行病學研究發現，須癬毛癬菌在皮膚癬菌病中的感染率僅次于紅色毛癬菌［5-6］。作為一種親動物的嗜角質的表皮癬菌，須癬毛癬菌與其他皮膚癬菌相比，能引起的較重的炎癥反應，嚴重者可出現水皰、糜爛及滲液，這一臨床現象可以用須癬毛癬菌分泌角蛋白酶的能力遠高于紅色毛癬菌等其他同類真菌［7］來解釋。角蛋白酶可通過降解表皮的角蛋白，使局部角蛋白結構破壞，影響正常表皮的結構并激發局部炎癥反應，且分泌的持續時間和強度與作用底物直接相關［8］。因此在體外建立與在體感染最接近的須癬毛癬菌皮膚感染模型，對于須癬毛癬菌的角蛋白酶致病機制的研究有著重要的意義。我們成功建立了須癬毛癬菌感染的組織工程皮膚模型，組織工程皮膚具有分化良好的表皮層結構，其中有較為豐富的角蛋白，是角蛋白酶的良好的自然底物，對于研究須癬毛癬菌重要的角蛋白酶具有得天獨厚的條件。與國外報道的須癬毛癬菌體外皮膚模型類似［9］，本研究構建的含色素的組織工程皮膚可用于須癬毛癬菌的抗真菌新藥的篩選和評價，也可用來觀察須癬毛癬菌與皮膚內各種細胞的相互作用，為今后須癬毛癬菌毒力及體外藥效學的研究提供一定的依據。

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Construction of aTrichophyton mentagrophytes-infected tissue-engineered skin model

Cao Yuping,Shen Yongnian,Lyu Guixia,Wang Le,Zeng Rong,Li Lingjun,Ma Pengcheng,Liu Weida
Department of Sexually Transmitted Disease,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China （Cao YP）;Department of Mycology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Shen YN,Lyu GX,Liu WD）;Division of Medical Affairs,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Wang L,Zeng R）;Pharmacal Research Laboratory,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Li LJ,Ma PC）

ObjectiveTo establish aTrichophyton mentagrophytes-infected tissue-engineered skin modelin vitro.MethodsPrimary fibroblasts were cultured with the presence of typeⅠbovine collagen for 3 days to form tissueengineered dermis.Then,primary keratinocytes and melanocytes were co-cultured on the surface（namely air-liquid interface)of the artificial dermis for another 12 days to form a tissue-engineered skin model.Five microliters of freshTrichophyton mentagrophytessuspensions were used to infect the tissue-engineered skin model.Hematoxylin and eosin（HE)staining and periodic acid-Schiff（PAS）staining were conducted to observe the structure of the cultures at 12,24,48 and 72 hours separately after the infection.ResultsA tissue-engineered dermal equivalent with a compact and uniform structure was formed by the culture of fibroblasts with the presence of typeⅠbovine collagen,and a well-stratified and-structured epidermis was formed by cocultured keratinocytes and melanocytes on the surface of the dermis.After infection withTrichophyton mentagrophytes,the structure of tissue-engineered skin was gradually destroyed over time,and epidermal destruction was severest at 48 hours;the entire structure of the tissue-engineered skin was replaced by hyphae and spores at 72 hours.ConclusionATrichophyton mentagrophytes-infected tissue-engineered skin model has been preliminarily established.

Tissue engineering;Skin;Animal testing alternatives;Infection;Trichophyton mentagrophytes

s:Liu Weida,Email:liumyco@hotmail.com;Ma Pengcheng,Email:mpc815@163.com

2015-06-04）

（本文編輯：吳曉初）

劉維達，Email：liumyco@hotmail.com；馬鵬程，Email：mpc815@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.01.008

國家科技重大專項（2009ZX09303-005）；江蘇省自然科學基金（BK2008092）；江蘇省臨床醫學科技專項（BL2012003）；北京協和醫學院協和青年基金（33320140051）

Fund programs:National Science and Technology Major Project of China （2009ZX09303-005）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China （BK2008092）;Jiangsu Provincial Special Program of Medical Science（BL2012003）;Union Youth Foundation of Peking Union MedicalCollege in 2014（33320140051）