玉米酒糟為主要氮源的Nisin生產(chǎn)菌株的誘變選育

張拴力，扈士海，崔云，趙地順

(1.石家莊新宇三陽實業(yè)有限公司 總工辦，河北 石家莊　051430；2.石家莊新宇三陽實業(yè)有限公司 技術(shù)處，河北 石家莊　051430；3.河北科技大學 化學與制藥工程學院，河北 石家莊　050000)

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玉米酒糟為主要氮源的Nisin生產(chǎn)菌株的誘變選育

張拴力1，扈士海2，崔云3，趙地順3

(1.石家莊新宇三陽實業(yè)有限公司 總工辦，河北 石家莊051430；2.石家莊新宇三陽實業(yè)有限公司 技術(shù)處，河北 石家莊051430；3.河北科技大學 化學與制藥工程學院，河北 石家莊050000)

為使乳酸乳球菌適應(yīng)玉米酒糟作為發(fā)酵生產(chǎn)乳酸鏈球菌素(Nisin)的主要氮源，首先對培養(yǎng)基進行了初步優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在酒糟清液中加入蔗糖、酵母膏和磷酸氫二鉀明顯促進了乳酸乳球菌的生長.在此基礎(chǔ)上，使用等離子體對乳酸乳球菌進行誘變處理，利用24方孔深孔板技術(shù)可實現(xiàn)對高產(chǎn)Nisin突變菌株的選擇性篩選.結(jié)果表明，誘變菌株在只有5.0%存活率時，得到的正突變菌株可達26.2%.借助搖瓶發(fā)酵實驗對其生產(chǎn)Nisin的發(fā)酵水平進行研究，發(fā)現(xiàn)有1株誘變選育菌株發(fā)酵Nisin的活性高達6 520 U/mL，并且其發(fā)酵能力比誘變起始菌株能力更強.

乳酸鏈球菌素；乳酸乳球菌；常壓室溫等離子體誘變；玉米酒糟

乳酸鏈球菌素(Nisin)是從乳酸鏈球菌或乳酸乳球菌發(fā)酵產(chǎn)物中提制的一種多肽抗菌素類物質(zhì)，由34個氨基酸組成，不僅可抑制大多數(shù)革蘭氏陽性菌的生長和繁殖，且對革蘭氏陰性菌同樣也有較強的抑制作用[1-2].Nisin用作食品添加劑，可在一定程度上改善和提高食品的質(zhì)量，延長了食品的保存期[3-4].此外，其為一種多肽物質(zhì)，可被人體內(nèi)的胰凝乳蛋白酶快速分解成氨基酸，不會產(chǎn)生任何毒副作用，因此，Nisin被認為是一種天然防腐劑，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè).

酵母發(fā)酵生產(chǎn)酒精時，會產(chǎn)生大量的廢液酒糟，每生產(chǎn)1 t酒精就會排放8～15 t酒糟，酒糟中除含大量水外，還含有5%～8%的營養(yǎng)物質(zhì)，但無重金屬和有毒物質(zhì)的殘留[5-6].其BOD 值為25 000～35 000 mg/L，COD 值為35 000～50 000 mg/L[7].因此，如果將酒糟直接排放，不僅會浪費大量的有用資源，而且也會對生態(tài)環(huán)境造成嚴重污染.將酒糟作為培養(yǎng)基成分來處理，不僅能解決酒糟污染的問題，還可以生產(chǎn)出有價值的產(chǎn)品，一舉多得.

目前，在Nisin的研究上存在的主要技術(shù)瓶頸是如何降低成本，提高Nisin產(chǎn)量[8-9].本研究探索將酒糟清液作為培養(yǎng)基的主要氮源，添加其他營養(yǎng)物質(zhì)后，發(fā)酵生產(chǎn)Nisin，降低Nisin的生產(chǎn)成本.首先對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，然后利用清華大學研發(fā)的常壓室溫等離子體誘變?nèi)樗崛榍蚓?，采?4方孔深孔板篩選技術(shù)進行選擇性的高效篩選正突變菌株，并借助搖瓶發(fā)酵實驗深入探究所獲得的正突變菌株的生長特性和Nisin發(fā)酵水平.

1　實驗部分

1.1實驗用品

乳酸乳球菌(Nisin產(chǎn)生菌，由本實驗室誘變篩選并保藏)；藤黃微球菌(效價檢測菌)；Nisin標準品；牛肉膏、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、NaCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、Tween 20和NaH2PO4(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；玉米酒糟(本公司酒精生產(chǎn)車間).

1.2培養(yǎng)基的制備

菌種活化、種子培養(yǎng)基：蔗糖2%(質(zhì)量分數(shù)，下同)，酵母膏1%，蛋白胨1%，K2HPO41%，NaCl 0.2%，MgSO4·7H2O 0.02%，配制固體培養(yǎng)基時加入2%瓊脂.培養(yǎng)基使用前均需在121 ℃滅菌鍋中滅菌20 min.

Nisin發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖 2%，酵母膏 0.4%，K2HPO41%，NaCl 0.2%，酒糟清液體積分數(shù)50%，121 ℃滅菌鍋中滅菌20 min.

篩選培養(yǎng)基：蔗糖2%，K2HPO41%，NaCl 0.2%，瓊脂2.0%，Nisin 6 000 U/mL，酒糟清液體積分數(shù)50%，121 ℃滅菌鍋中滅菌20 min.

效價測定培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖0.3%，K2HPO40.1%，Tween 20 0.05%，MgSO4·7H2O 0.02%.

1.3乳酸乳球菌菌種的活化

將保藏的乳酸乳球菌菌種接種至用于菌種活化的固體平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取生長旺盛的單菌落接種到裝有菌種活化液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃活化12 h，再以體積比5%的接種量接入100 mL體積分數(shù)為50%的酒糟清液的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，125 r/min 恒溫搖床培養(yǎng)，測定不同時間的OD600.

1.4培養(yǎng)基配方優(yōu)化

在含酒糟清液體積分數(shù)為50%的基礎(chǔ)上，選取蔗糖、酵母膏和磷酸氫二鉀作為實驗因素，按L9(33)正交表設(shè)計實驗，接種量為體積比4.0%，36 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)9 h，取菌液測定其在600 nm處的吸光度值，以吸光度值結(jié)果優(yōu)化培養(yǎng)基配方.

1.5菌種發(fā)酵

用無菌接種環(huán)挑取平板上的目標單菌落，接種到液體種子培養(yǎng)基中，在溫度36 ℃,轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床中培養(yǎng)至OD600值約為1時結(jié)束(用時大約4 h)，再以體積比4.0%的接種量將初步篩選好的菌種接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于36 ℃,150 r/min的搖床中，發(fā)酵培養(yǎng).期間每隔1 h取樣一次，實時監(jiān)測發(fā)酵液的OD600及Nisin活性.

1.6等離子體誘變育種

采用涂布法把乳酸乳球菌菌液均勻涂抹于無菌金屬平板上，用常壓室溫等離子體誘變育種機(ARTP)進行誘變處理15～150 s后涂布于固體平板上，置于37 ℃無菌培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)48 h后數(shù)取菌落,計算致死率，計算公式如下：

致死率=(Y-X)/Y×100%，

式中：Y——不經(jīng)過誘變處理的總菌落數(shù)；X——經(jīng)過誘變處理后的總菌落數(shù).

1.7Nisin高產(chǎn)菌株的篩選

在無菌條件下，將誘變后的單菌落接種到盛有3 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的24方孔深孔板中，37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng) 10～12 h，4 000 r/min離心10 min，測定菌株的Nisin活性.

1.8Nisin活性的測定

將藤黃微球菌接種到液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)約3 h測定OD600，OD600約為0.5時為宜(32 ℃、150 r/min).取500 μL該菌液接種到固體培養(yǎng)基中，倒板，固化后打孔，分別將10、40、70、100、200、400 U/mL的Nisin標準品溶液和發(fā)酵清液(稀釋20倍)加入孔中.30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，通過測定抑菌圈直徑與Nisin濃度的對數(shù)關(guān)系來求得其Nisin活性.

2　結(jié)果與討論

2.1培養(yǎng)基優(yōu)化對乳酸乳球菌生長繁殖的影響

在酒糟清液中，直接接種乳酸乳球菌，菌體生長緩慢，9 h后，OD600僅有0.7左右(圖1).這是由于酒糟清液中營養(yǎng)成分單一，缺乏直接碳源和必要的生長因子及磷源.乳酸乳球菌在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中的搖瓶生長曲線如圖1所示，與只用酒糟清液作為培養(yǎng)液相比，乳酸乳球菌的生長速度明顯加快，開始進入的是生長緩慢的延遲期，1 h后進入迅速增長的對數(shù)期，大約6 h，菌體生長進入對數(shù)生長后期，7 h后進入穩(wěn)定期，9 h后，OD600達到2.03，菌體濃度達到最大值，比只用酒糟清液提高了2.9倍.

2.2正交設(shè)計優(yōu)化培養(yǎng)基實驗結(jié)果

選擇蔗糖作為直接碳源，酵母膏補充生長因子，K2HPO4作為磷源，使用正交設(shè)計研究這些營養(yǎng)因子對乳酸乳球菌生長繁殖的影響.正交實驗設(shè)計見表1，正交實驗結(jié)果如表2所示，影響乳酸乳球菌生長的主次順序為C>A>B，即酵母膏的添加量對乳酸乳球菌的生長影響最為顯著，然后為蔗糖的添加量，K2HPO4影響較小.培養(yǎng)基的最佳組合為A2B2C2，即質(zhì)量分數(shù)分別為蔗糖2.0%、K2HPO40.4%、酵母膏0.4%.

圖1　培養(yǎng)基優(yōu)化前后乳酸乳球菌的搖瓶生長曲線對比Fig.1　Growth curve comparis of Lactococcus lactis on medium before and after optimization in shake flask

水平w/%蔗糖(A)K2HPO4(B)酵母膏(C)11.00.20.222.00.40.433.00.60.6

表2　培養(yǎng)基優(yōu)化正交實驗結(jié)果Tab.2　Results of orthogonal test on culture medium optimization

2.3誘變前后乳酸乳球菌的Nisin發(fā)酵過程曲線

圖2是誘變前后的乳酸乳球菌的搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)Nisin曲線，起始菌株發(fā)酵10 h 后達到最高效價3 650 U/mL，兩誘變菌株發(fā)酵最高效價達到6 000 U/mL以上.已有研究報道，表明Nisin屬于初級代謝產(chǎn)物,其產(chǎn)量與菌體濃度成正比例增長關(guān)系的說法是一致的[10-11]，圖1與圖2的對比很好地說明該關(guān)系，當菌體生長到達穩(wěn)定期后，菌體濃度達到最大值后Nisin效價很快也達到最大.隨后，雖然菌體濃度基本不變， Nisin效價不再增加甚至會呈現(xiàn)下降趨勢，這可能與蛋白酶降解了部分代謝產(chǎn)物Nisin[12]有關(guān).

2.4等離子體誘變致死率曲線的測定

為提高Nisin產(chǎn)量，進一步采用等離子體誘變技術(shù)和24方孔深孔板來實現(xiàn)對Nisin高產(chǎn)菌株的高效篩選.為保證篩選的成功率，所選菌體大小、生理狀態(tài)要基本保持一致，還要保證具有一定的細胞濃度，故選擇對數(shù)生長中后期的細胞作為研究對象.依據(jù)研究經(jīng)驗，選擇誘變對象為培養(yǎng)6.0 h后的乳酸乳球菌.

微生物經(jīng)過ARTP處理后，能自己修復(fù)損害的DNA，產(chǎn)生基因突變而進化存活下來的即為優(yōu)選菌種.因此，該誘變方法現(xiàn)已成為一種高效的微生物誘變育種技術(shù)[13-14].

由圖3可以看出，ARTP對乳酸乳球菌的殺傷力極強，處理60 s就可使87%的菌株死亡；處理90 s后菌株致死率達95.2%.由于細胞存活率在 1%～10%時，細胞的誘變效應(yīng)較強[15-17].因此，本實驗選擇對細胞進行等離子體處理時間為90 s.

2.5誘變菌株的快速篩選

在無菌操作下，將等離子體處理后的乳酸乳球菌均勻涂布在篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)基中僅以酒糟清液作為氮源，使得篩選得到的菌種更能適應(yīng)酒糟清液，并且高產(chǎn)Nisin的菌株還要能夠耐受高濃度的Nisin，本實驗選擇碳源為蔗糖，通過ARTP處理高濃度Nisin培養(yǎng)基，培育高效價的抗Nisin乳酸乳球菌[8，18].

圖2　菌株誘變前后乳酸乳球菌搖瓶發(fā)酵曲線Fig.2　Nisin curve of strains Lactococcus lactis and mutant strains in shake flask

圖3　乳酸乳球菌的致死率與ARTP處理時間的關(guān)系Fig.3　Curve of the fatality rate of Lactococcus lactis with the ARTP processing time

在平板上接種適當稀釋誘變后的菌液，當菌落數(shù)為10～50個時，接種至24方孔深孔板中，從而實現(xiàn)對突變菌株的快速篩選.深孔板中的培養(yǎng)基也是以酒糟清液為基礎(chǔ)的優(yōu)化培養(yǎng)基.由圖4 可以看出，在培養(yǎng)9 h后的42株誘變菌株中，有11株發(fā)生了正突變，即Nisin相對活性在1.2以上，正突變率為26.2%.其中6株(A2，B2，B6，D2，E3 和G1)的Nisin相對活性超過了1.5，作為后續(xù)實驗研究對象.

2.6高產(chǎn)Nisin乳酸乳球菌誘變菌株的搖瓶復(fù)篩

為了找到能夠穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)Nisin乳酸乳球菌誘變株，將起始菌株和篩選出的6株高產(chǎn)Nisin的正突變菌株進行搖瓶發(fā)酵重復(fù)篩選[17].當菌株搖瓶培養(yǎng)9 h后，測定其Nisin活性.由圖5可知，B2和E3正突變菌株的Nisin活性超過6 000 U/mL，為高產(chǎn)Nisin的乳酸乳球菌誘變株.

圖4　培養(yǎng)9 h后菌株的Nisin相對活性Fig.4　Lactococcus lactis’s Nisin relative activity after 9 hours

圖5　發(fā)酵后菌株的Nisin活性Fig.5　Lactococcus lactis’ Nisin activity after fermentation

2.7高產(chǎn)Nisin菌株發(fā)酵特性

為了考察高產(chǎn)Nisin誘變菌株的發(fā)酵特性，將起始菌株和B2、E3誘變菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測其細胞和Nisin效價.

由圖6可以看出，B2和E3誘變菌株的增值速度比起始菌株的增殖速度快很多，說明經(jīng)過等離子誘變處理后，B2和E3誘變菌株更能適應(yīng)酒糟清液為主要氮源的培養(yǎng)基.

由圖2可知，誘變菌株的Nisin效價增長速度明顯快于起始菌株，在10 h后，優(yōu)化培養(yǎng)基后的菌株Nisin效價達到最高值.由圖5可知，B2和E3誘變菌株搖瓶發(fā)酵后的Nisin活性均超過6 000 U/mL，其中B2誘變菌株發(fā)酵的Nisin活性最高，達6 520 U/mL，且比起始菌株增加了1.51倍.

由圖7可以看出，在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液的pH不斷下降，發(fā)酵10 h后，pH降到4.89 (圖7).

圖6　不同菌株的搖瓶生長曲線Fig.6　Growth curve of different strains in shake flask

圖7　乳酸乳球菌誘變菌株E3搖瓶發(fā)酵pH變化曲線Fig.7　pH curve of E3 Lactococcus lactis mutant strains in shake flask fermentation

3　結(jié)論

乳酸乳球菌發(fā)酵生產(chǎn)Nisin過程中，以玉米酒糟上清液為主要氮源，對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，等離子體誘變?nèi)樗崛榍蚓?，獲得了B2和E3 2株發(fā)酵Nisin活性超過6 000 U/mL的乳酸乳球菌誘變菌株，并且其在玉米酒糟上清液中的發(fā)酵能力比起始菌株更強.

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(責任編輯：趙藏賞)

Mutating Lactococcus lactis for high-yield strain of Nisin using corn thick mash as main nitrogen source

ZHANG Shuanli1,HU Shihai2,CUI Yun3,ZHAO Dishun3

(1.General Labor Office,Shijiazhuang Xinyu Sanyang Industrial Co.,Ltd,Shijiazhuang 051430,China; 2.Research and Development Office,Shijiazhuang Xinyu Sanyang Industrial Co.,Ltd, Shijiazhuang 051430,China;3.College of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050000,China)

Corn thick mash was used as main nitrogen source to produce Nisin.Firsty,the fermentation media were optimized by single factor experiment.The results indicated that the growth ofLactococcuslactiswas obviously enhanced by adding sucrose,yeast extract and K2HPO4to thick mash.As the starting strain,the strain was further treated by atmospheric and room temperature plasmas and quickly selected using 24 well culture plate.At a survival rate of 5%,the positive mutation rate of theLactococcuslactiswas found to be 26.2% evaluated by the comparison with the starting strain.The results from shake flask culture further confirmed that a positive mutant strains could produce 6 520 IU/mL Nisin.

Nisin；Lactococcuslactis；atmospheric and room temperature plasma (ARTP)mutation;corn thick mash

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.04.014

2015-10-15

河北省科技計劃項目(13272802D)

張拴力(1968—)，男，河北欒城人，石家莊新宇三陽實業(yè)有限公司高級工程師，主要從事生物化工研究.

E-mail :zslyx96@126.com

Q815

A

1000-1565(2016)04-0417-07