滸苔多糖的酶法降解及其工藝條件優化的研究

張高麗,李銀平,趙　梅,劉盟夢,王　鵬

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

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滸苔多糖的酶法降解及其工藝條件優化的研究

張高麗,李銀平,趙梅,劉盟夢,王鵬*

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

采用生物酶法將滸苔多糖降解為分子質量較小、粘度較低的滸苔寡糖,以還原糖生成量作為指標,通過單因素和響應面法優化降解工藝,利用液相色譜和質譜技術對酶解產物進行了組分分析。結果表明:滸苔多糖降解酶能夠實現對滸苔多糖的高效降解,最適酶解條件為加酶量1.5%、底物質量濃度14 mg/mL、初始pH=6.5、反應時間6 h、溫度33 ℃,在此條件下,還原糖生成量為165.21 mg,降解率為61.21%,粘度由349.89 mPa·s降低至2.05 mPa·s。單糖組成結果表明酶解產物由鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖組成,質譜分析表明酶解產物包括酸性寡糖片段和中性寡糖片段。

滸苔多糖,降解酶,響應面,粘度,酶解工藝

滸苔屬(Enteromorpha)又名苔條、青海苔,屬于綠藻門綠藻綱石莼目石莼科。野生滸苔廣泛分布于世界各地沿海,且含有豐富的營養物質。其中可溶性多糖和粗纖維占主要部分,約為干重的63.9%,粗蛋白13.21%,脂肪1.04%,灰分21.87%[1],具有巨大的開發潛力。滸苔可溶性多糖作為滸苔的主要活性成分之一,糖鏈由鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖、半乳糖、葡萄糖構成且摩爾比為15.2∶5.3∶4.7∶1.5∶1.0,且含有大量的硫酸基,重均分子量620.3 ku[1]。因其抗癌、抗病毒、調節血脂、降血糖的功能、且毒性小安全性高等特點倍受關注[2]。雖然滸苔多糖具有良好的生物活性,但因其自身較大的分子量和較高的粘度影響了其吸收性及生理功能,限制其進一步應用。研究發現通過物理、化學方法將多糖降解為分子質量較低的寡糖,降低固有粘度,可大大提高其使用價值和應用范圍[3]。

目前常用的滸苔多糖降解方法包括酸解法、微波輔助酸解法等,但通過酸解法得到的寡糖分子量分布較寬且糖鏈基團及結構受到一定程度影響;通過微波輔助酸解法得到的寡糖收率較低,且生產成本高[4]。相較于物理、化學方法,生物酶法因具有特異性強、酶解條件溫和、工藝簡單及水解可控等特點,成為多糖降解的最理想手段。滸苔多糖作為一種聚陰離子異質多糖,其糖鏈結構特殊,現有的工具酶不能有效將其水解。

本實驗室前期通過篩選、培養獲得一種滸苔多糖降解酶,能夠有效降解滸苔水溶性多糖。實驗以還原糖生成量為指標,進行單因素實驗,在此基礎上進行響應面實驗優化,探求滸苔多糖降解最佳工藝條件,然后利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)和電噴霧電離質譜(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)技術對降解產物的結構和聚合度進行研究,以期為滸苔寡糖的開發和利用提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

滸苔粉由青島海大生物集團有限公司提供;滸苔多糖降解酶(1200 U/mL)分子質量約70 ku,由實驗室保存的菌株Alteromonas. A321發酵獲得[4];果膠酶(30000 U/g)、纖維素酶(200000 U/g)Sigma公司;α-淀粉酶(4000 U/g)、β-淀粉酶(5000 U/g)大連美侖生物技術有限公司;DNS試劑[5];苯酚、硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇均為分析純。

LDZX-40BI型自動電壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠;DL6MB型大容量離心機西安禾普生物科技有限公司;722型分光光度計上海浦東物理光學儀器廠;HHS21-4電熱恒溫水浴鍋北京長安科學儀器廠;FD-1A-50真空冷凍干燥機西安太康生物科技有限公司;SHB-Ⅲ循環水式多用途真空泵鄭州長城儀器廠;PHS-3C精度上海雷茲儀器廠;Agilent 1200 Series高效液相色譜儀Agilent公司;布魯克amaZon SL離子阱電噴霧質譜德國布魯克道爾頓公司;MCR101流變儀奧地利安東帕有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1滸苔多糖制備稱取120 g滸苔粉加入到3.5 L水中,高壓滅菌鍋121 ℃提取30 min,4000 r/min離心10 min,獲得一定質量濃度的滸苔多糖溶液[6-7]。

1.2.2單因素優化實驗50 mL滸苔多糖溶液反應體系,在滸苔多糖降解酶初始加酶量1.5%、底物質量濃度10 mg/mL、初始pH=6.5、反應時間4 h、反應溫度35 ℃下分別研究不同的加酶量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)、底物質量濃度(8、10、12、14、16 mg/mL)、pH(4、5、6、7、8、9、10)、溫度(25、30、35、40、45、50 ℃)和反應時間(0.5、1、2、3、4、5、6 h)對滸苔多糖降解效率的影響。

1.2.3響應面法實驗在單因素實驗基礎上,確定初始pH=6.5,加酶量為1.5%,以底物質量濃度、反應溫度、反應時間為自變量,還原糖生成量為響應值(Y),利用軟件Design-Expert 8.0.6進行Box-Benhnkn實驗設計,因素編碼如表1所示。

表1　Box-Benhnkn實驗因素水平及編碼

1.2.4還原糖生成量測定采用DNS比色法[8],還原糖生成量=m2-m1,其中m1為初始還原糖總量,m2為降解后還原糖總量。

1.2.5多糖降解率測定采用苯酚-硫酸法[8],

式(1)

式中:ρ1為加入等量滅酶活的滸苔多糖經醇沉復溶后總糖質量濃度(mg/mL);ρ2為加入等量不同酶制劑的滸苔多糖經醇沉復溶后總糖質量濃度(mg/mL);v為樣品體積(mL)。

1.2.6滸苔多糖酶解產物的制備取適量滸苔多糖,按1.2.3優化的條件進行酶解,酶解結束立即煮沸5 min滅酶活,冷卻,加入2倍無水乙醇,4 ℃靜置過夜,4000 r/min離心10 min,透析脫鹽后濃縮,得上清寡糖樣品,凍干備用。

1.2.7 酶解產物的HPLC分析參考韓莎莎等[3]報道方法略有改動。將滸苔多糖的酶解產物通過酸解(三氟乙酸)、柱前衍生(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP),然后進行色譜分析。色譜條件:色譜儀:Agilent1200 Series 高效液相色譜儀;色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18(15 cm×4.6 mm,5 μm);流速1.0 mL/min;進樣量10 μL;檢測器為紫外檢測器(VWD),波長254 nm,柱溫及檢測器溫度設定為25 ℃。

1.2.8酶解產物的ESI-MS分析參考韓莎莎等[3]報道方法略有改動。將酶解產物通過乙腈溶解后,取2 μL樣品進行負離子模式質譜分析。毛細管電壓:-140 V;質量掃描范圍:m/z 100～2000。

表2　酶制劑反應條件

1.2.9不同酶制劑對滸苔多糖降解效果的比較分別將α-淀粉酶、β-淀粉酶、果膠酶、纖維素酶、滸苔多糖降解酶調節至酶活為200 U/mL,按優化的條件固定加酶量1.5%、底物質量濃度14 mg/mL、酶解時間6 h,根據商品酶的產品說明確定其最適pH和溫度,具體見表2。反應結束后立即煮沸5 min將酶滅活,測定其粘度和還原糖生成量。加2倍體積無水乙醇,4 ℃靜置過夜,4000 r/min離心10 min,沉淀復溶至初始體積,測定總糖質量濃度,以加等量滅活酶制劑的處理作為對照組,計算多糖降解率。

1.2.10粘度測定采用MCR101流變儀,取適量樣品選用pp50轉子以300 r/s轉速室溫測定2 min,計算平均粘度[9]。

1.3數據處理

所有數據均為3次重復實驗的平均值,運用Excel數據處理軟件和利用Design-Expert 8.0.6軟件中的多元線性回歸分析程序對實驗結果進行處理。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1加酶量對滸苔多糖降解效率的影響由圖1可知,加酶量在0.5%～1.5%范圍內,還原糖生成量迅速增加,之后隨著加酶量增加,還原糖生成量增加趨于平緩。因為在一定的底物濃度下,酶尚未被飽和,所以前期隨著加酶量的增加,酶解效率升高,還原糖生成量明顯增加;但隨著加酶量逐漸加大,酶分子間的競爭性抑制作用增強,導致只有一部分酶與底物結合從而使得還原糖生成量只有少量增加[10]。考慮到實際生產,選擇1.5%為最適加酶量。

圖1　加酶量對滸苔多糖降解效率的影響Fig.1　Effect of enzyme dosage on hydrolysis efficiency of PE

圖2　底物質量濃度對滸苔多糖降解效率的影響Fig.2　Effect of substrate concentration on hydrolysis efficiency of PE

2.1.2底物質量濃度對滸苔多糖降解效率的影響由圖2可知,隨底物質量濃度增大,還原糖生成量呈先增大后降低趨勢,12 mg/mL時還原糖生成量最高。在較低底物質量濃度下,隨著底物質量濃度不斷增大,酶活中心分子飽和,還原糖生成量達到最大值;當底物質量濃度過大,底物粘度過高導致酶與底物接觸概率下降,故降解效率表現為下降趨勢[11],因此確定12 mg/mL為最適底物質量濃度。

2.1.3pH對滸苔多糖降解效率的影響由圖3可知,當pH=7時還原糖生成量最大,pH過高或過低都會抑制滸苔多糖降解酶的活性。這是因為酶活力和構像與溶液體系的pH有關,pH能夠影響酶活性中心的必需基團的解離程度,進而影響滸苔多糖降解酶分子對底物的結合和催化過程[12],由于滸苔多糖溶液初始pH6.5接近于7,為簡化操作確定初始pH6.5為最適底物pH。

圖3　pH對滸苔多糖降解效率的影響Fig.3　Effect of pH on hydrolysis efficiency of PE

2.1.4溫度對滸苔多糖降解效率的影響由圖4可知,當溫度從25 ℃升至35 ℃時,還原糖生成逐漸增加,當溫度高于35 ℃時,還原糖生成量下降。在較低溫度下溫度升高能夠促進多糖的溶解和運動,增加酶與底物的接觸機率[13],然而溫度過高會導致酶分子吸收過多能量,引起維持酶分子結構的次級鍵斷裂,造成蛋白質空間結構發生變化,從而減弱酶活力,降低降解效率[14]。因此確定35 ℃為最適底物溫度。

圖4　溫度對滸苔多糖降解效率的影響Fig.4　Effect of temperature on hydrolysis efficiency of PE

2.1.5酶解時間對滸苔多糖降解效率的影響由圖5可知,反應時間在0.5～4 h內,還原糖生成量迅速增加,降解效率較高,當超過4 h時,還原糖生成量趨于平緩。一方面可能是由于酶活力受到了產物的抑制,另一方面隨著酶解時間的延長,酶的穩定性逐漸降低,考慮到實際生產成本,因此確定4 h為最適酶解時間[15]。

圖5　酶解時間對滸苔多糖降解效率的影響Fig.5　Effect of time on hydrolysis efficiency of PE

2.2響應面實驗結果分析

2.2.1響應面設計及結果在單因素實驗基礎上,利用響應面法對滸苔多糖的酶法降解進行進一步工藝優化。根據響應面Box-Behnken設計17組實驗,其中5組中心實驗進行實驗誤差估測,其余12組用于分析因點。固定加酶量1.5%,初始pH=6.5,具體設計組合、實驗值及軟件預測值如表3所示。

表4　酶解條件回歸模型方差分析表

注:*代表顯著(p<0.05);**代表極顯著(p<0.0001)。

表3　酶解條件優化響應面實驗設計及結果

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表3數據進行二次多項式回歸分析,獲得還原糖生成量(Y)對底物質量濃度(A)、溫度(B)、反應時間(C)的二次多項回歸方程:Y=139.77+7.78A-17.17B+14.96C-4.24AB+9.37AC-1.82BC+0.52A2-39.32B2-15.62C2。

對表2中數據進行多元回歸分析,結果如表3所示。

2.2.2各因素之間的交互作用采用Design-Expert 8.0.6軟件對底物質量濃度、溫度、反應時間3個因素間交互作用進行響應面分析,得到以還原糖生成量為響應值的響應面。由等高線形狀可觀察交互作用大小,橢圓形表示交互作用較強,反之形狀越圓表示交互作用越弱[18]。由此分析所有等高線圖和響應曲面,其中底物濃度和時間的交互作用顯著見圖6。由圖6可知,當固定溫度為35 ℃時,反應時間升高到最優值時,底物濃度對還原糖生成量的影響較小;當底物濃度升高到最優值時,還原糖生成量隨時間顯著提高。說明時間對響應值峰值的影響大于底物濃度,與回歸分析結果相同。

圖6　底物濃度和時間交互作用對酶解效率的影響Fig.6　Response surface plots showing interaction effects of hydrolysis conditions between on substrate concentration and time

2.2.3回歸模型驗證由Design-Expert 8.0.6軟件分析可知,酶法降解滸苔多糖最佳工藝條件為底物質量濃度13.96 mg/mL,溫度為32.13 ℃,反應時間為5.89 h。在此條件下,得到還原糖生成量的理論值為160.08 mg。為檢驗響應面優化所得結果的可靠性,在添加量為1.5%,初始pH=6.5下,采用上述優化的實驗條件進行驗證。從實際操作角度考慮,將此工藝條件調整到底物質量濃度14 mg/mL,溫度為33 ℃,反應時間為6 h。在此條件下實際還原糖生成量為165.21 mg,與預測值十分接近且相對誤差約3.20%,說明基于響應曲面法所得的酶解優化工藝穩定可靠。

2.3HPLC分析

由圖7可知,滸苔多糖酶解產物的2倍醇沉上清的單糖組成為鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖,通過峰面積計算其摩爾比為1.51∶2.30∶6.66∶1。

圖7　滸苔多糖酶解產物的HPLC圖Fig.7　High performance liquidchromatograms of hydrolysate fractions注:a標準單糖HPLC(1～10分別代表甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、乳糖內標、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖);b為滸苔多糖酶解產物的HPLC圖(鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖)。

2.4ESI-MS分析

由圖8可知,酶解產物的豐度較高的寡糖片段有五種,從左至右它們的m/z分別為243、341、401、503、665。根據滸苔多糖的單糖分析推測質荷比為243的寡糖為具有取代基的單糖,根據文獻報道滸苔多糖上的取代基只能是分子量為80的硫酸基[19],則該單糖的分子量為164,在本實驗中是鼠李糖,所以單糖為鼠李糖硫酸酯;質荷比為401的糖推測為二糖脫一分子水,葡萄糖醛酸成酯脫一分子水再失去一個質子[244+194-H2O-H2O-H]-,二者均屬酸性寡糖片段。m/z分別為341、503、665,其差值均為162,且自左到右分別為:二糖脫一分子水再失去一個質子[180×2-H2O-H]-,三糖脫兩分子水再失去一個質子[180×3-2H2O-H]-,四糖脫三分子水再失去一個質子[180×4-3H2O-H]-。根據單糖組成分析該類寡糖為中性寡糖片段,其分別為葡二糖、葡三糖和葡四糖。

圖8　滸苔多糖酶解產物的ESI-MS圖Fig.8　ESI-MS spectra of hydrolysate fractions

2.5不同酶制劑對滸苔多糖降解結果比較

由表5可知,滸苔多糖降解酶產生的還原糖最高,纖維素酶次之,α-淀粉酶、β-淀粉酶和果膠酶較低;多糖降解率的趨勢與還原糖生成量趨勢大致相同;就粘度而言,滸苔多糖降解酶的降粘效果最顯著。因此,以滸苔多糖降解酶做為酶制劑,結合本實驗的最優酶解工藝,可以實現對滸苔多糖的高效降解,酶解產物低分子糖鏈可用于活性研究,也可為結構解析提供思路。

表5　不同酶制劑對滸苔多糖降解效率的比較

3　結論

本實驗所開展的酶法降解滸苔多糖研究,通過系列單因素和響應面實驗優化。多糖降解趨勢與還原糖生成量趨勢大致相同,因此以還原糖生成量為指標,確定最佳降解工藝為:加酶量1.5%,初始pH=6.5,底物質量濃度14 mg/mL,溫度為33 ℃,反應時間為6 h。在此條件下還原糖生成量可達165.21 mg,降解率61.21%,粘度由349.89 mPa·s降低至2.05 mPa·s,降解產物包括酸性寡糖片段和中性寡糖片段。通過與α-淀粉酶、β-淀粉酶、果膠酶、纖維素酶等酶制劑進行對比,該酶具有高效降解滸苔多糖及顯著降粘的作用,可為今后滸苔活性物質提取及不同聚合度寡糖制備提供理論依據及方法指導。

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Study on enzymatic degradation for polysaccharide fromEnteromorphaand its technical condition optimization

ZHANG Gao-li,LI Yin-ping,ZHAO Mei,LIU Meng-meng,WANG Peng*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

The purpose of this study was to hydrolyze PE for oligosaccharide using specific PE degradase. The enzymatic hydrolysis conditions were optimized. The saccharide composition of the hydrolysate fractions was analyzed by liquid chromatography and electrospray ionization mass spectrometry. The yield of reducing sugar was chosen as an evaluating indicator during single factor experiments and response surface methodology. Results showed that the enzyme could hydrolyze PE efficiently. The optimal hydrolysis condition was as follows:enzyme dosage 1.5%,substrate concentration 14 mg/mL,the initial pH6.5,reaction time 6 h,and hydrolysis temperature of 33 ℃. The corresponding reducing sugar yield and hydrolysis efficiency was 165.21 mg and 61.21%,respectively. Besides,the viscosity of PE reduced from 349.89 mPa·s to 2.05 mPa·s. The HPLC results indicated that the monosaccharide composition of the hydrolysate was rhamnose,glucuronic acid,glucose and xylose. The results of mass analysis showed that degradase could degrade sulfate PE and neutral PE.

polysaccharides ofEnteromorpha;degrading enzyme;response surface methodology;viscosity;optimization of enzymatic hydrolysis

2016-02-22

張高麗(1990-)，女，碩士，研究方向：食品加工與功能食品，E-mail：sucigel@163.com。

王鵬(1980-)，男，副教授，研究方向：海洋應用微生物，E-mail：pengwang@ouc.edu.cn。

山東省自然科學基金(ZR2015DQ005)；青島市應用基礎研究計劃(15-9-1-62-jch)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)18-0202-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.030