微小RNA mir-145在乳腺癌細(xì)胞中調(diào)控Nanog的機(jī)制與功能研究

駱啟聰，張　環(huán)，陳蓉珊，陳　剛，米彥軍

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 廈門 361003)

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微小RNA mir-145在乳腺癌細(xì)胞中調(diào)控Nanog的機(jī)制與功能研究

駱啟聰，張環(huán)，陳蓉珊，陳剛，米彥軍

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 廈門 361003)

目的：探討mir-145在乳腺癌細(xì)胞中對(duì)Nanog的調(diào)控作用及功能.方法：采用熒光定量PCR檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系中mir-145與Nanog表達(dá)水平，利用流式細(xì)胞術(shù)比較不同乳腺癌細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞比例，懸浮培養(yǎng)瘤球并比較瘤球與貼壁細(xì)胞間mir-145、Nanog的表達(dá)差異，過表達(dá)mir-145后檢測(cè)Nanog表達(dá)水平與報(bào)告基因活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mir-145表達(dá)升高后乳腺癌干細(xì)胞比例，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mir-145表達(dá)升高后乳腺癌細(xì)胞成瘤能力.結(jié)果：T-47D細(xì)胞表達(dá)高水平的mir-145和低水平的Nanog，MDA-MB231表達(dá)低水平的mir-145和高水平的Nanog，MDA-MB231細(xì)胞乳腺癌干細(xì)胞比例高于T-47D細(xì)胞，瘤球細(xì)胞中的mir-145表達(dá)水平低于貼壁細(xì)胞，而Nanog表達(dá)水平高于貼壁細(xì)胞.過表達(dá)mir145降低Nanog表達(dá)水平與報(bào)告基因活性，降低乳腺癌干細(xì)胞比例與平板克隆形成能力.結(jié)論：mir-145能夠調(diào)控Nanog表達(dá)水平，影響乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞特性.

乳腺癌；Nanog；mir-145；腫瘤干細(xì)胞

在中國(guó)癌癥已成為非常重要的公共健康問題，癌癥發(fā)病率和死亡率不斷攀升，已成為疾病死因之首.乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，已成為威脅女性健康的主要惡性腫瘤，而且乳腺癌死亡率有升高趨勢(shì)[1].經(jīng)過術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)治療后的乳腺癌，仍有約30%患者最終出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞在此過程中發(fā)揮重要作用.

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤內(nèi)部一小部分具有特殊標(biāo)記的細(xì)胞，具有自我更新、無(wú)限增殖和多向分化的能力，對(duì)常規(guī)化療藥物和放療有更強(qiáng)的耐受能力，能夠轉(zhuǎn)移、形成新的腫瘤，是腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因[2].腫瘤干細(xì)胞的特征包括表達(dá)多潛能基因(Oct4、Sox2、Nanog)、能夠自我更新、形成瘤球和耐藥性等[3].

多潛能基因Nanog是維持胚胎干細(xì)胞自我更新和增殖的轉(zhuǎn)錄因子，在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4].Nanog表達(dá)水平高的乳腺癌病人預(yù)后差，可作為三陰性乳腺癌病人的預(yù)后因素[5].近年來(lái)對(duì)Nanog等多潛能基因的研究已成為熱點(diǎn)，但對(duì)Nanog等因子的調(diào)控機(jī)制研究較少.本研究通過研究miR145 在乳腺癌中對(duì)Nanog表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，為今后開發(fā)乳腺癌新的治療措施提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231、T47D購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)基、B-27、EGF、bFGF、insulin、胎牛血清購(gòu)自Gibco，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Qiagen，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自東洋坊.

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231、T47D在10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)皿底80% ～ 90% 時(shí)，進(jìn)行傳代，傳代時(shí)吸除培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液洗2 次，0.5 mL 0.25%胰酶進(jìn)行消化，0.5 mL完全培養(yǎng)基中和胰酶消化液后，1, 200 × g 離心4 min，棄上清，加入培養(yǎng)基吹散細(xì)胞.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將細(xì)胞接種于不同規(guī)格的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng).

1.2.2微球體培養(yǎng)

微球體培養(yǎng)富集乳腺癌干細(xì)胞參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[6,7].收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T-47D、MDA-MB231 乳腺癌細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，PBS 緩沖液洗2 次后離心并細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入瘤球培養(yǎng)基[EGF(20 ng /mL)、bFGF(10ng /mL)、胰島素(5 μg /mL)和1×B-27 的DMEM/F12 培養(yǎng)基]重懸，使細(xì)胞密度為1×103個(gè)/mL，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每2日加入100μL新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至1 周時(shí)，300 × g離心5 min 收集微球體，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與感染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：T-47D細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，過夜后分別用Lip3000將質(zhì)粒DNA、miRNA mimics轉(zhuǎn)染入T-47D和MDA-MB-231細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6小時(shí)后換液.37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).轉(zhuǎn)染過程按Lipofectamine3000說(shuō)明書進(jìn)行.

病毒包裝：293T細(xì)胞接種于6cm皿中，過夜后用6μg pLV-mir145質(zhì)粒、3μg pSPAX2質(zhì)粒、1μg pMD2.G質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)換液，37 ℃孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)后收集上清并測(cè)量滴度.

病毒感染：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T-47D、MDA-MB231 細(xì)胞接種于6 孔板中(10×105/孔)，用慢病毒(滴度：1.5×105～2.3×105TU/mL)感染細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后，轉(zhuǎn)為完全培養(yǎng)液培養(yǎng).感染72 h 后，加入嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞.

1.2.4總RNA提取及熒光定量PCR檢測(cè)

總RNA的提取：采用Trizol試劑提取，操作按照說(shuō)明書進(jìn)行.

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：miRNA逆轉(zhuǎn)錄按miScript Reverse Transcription Kit說(shuō)明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20μL，含4μLmiScript RT Buffer，1μL miScript Reverse Transcriptase Mix，1μg Total RNA.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃ 60min，95℃ 5min.mRNA基因逆轉(zhuǎn)錄按東洋坊ReverTra Ace qPCR RT Kit說(shuō)明書進(jìn)行.

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：miRNA的檢測(cè)按miScript SYBR Green PCR Kit說(shuō)明書進(jìn)行.Mir145與U6引物序列購(gòu)買自北京天根生物科技有限公司.20μL體系中含10μL QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix(2×)，2μL miScript Universal Primer(10×)，2μL mir145引物或U6引物，2μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物.反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性15min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 15s，55℃ 30s，70℃ 30s，40個(gè)循環(huán).mRNA的檢測(cè)按東洋坊Realtime PCR Master Mix說(shuō)明書進(jìn)行.

反應(yīng)在羅氏480熒光定量PCR儀上進(jìn)行.利用儀器上自帶的系統(tǒng)軟件分析，可觀察擴(kuò)增曲線和熔解曲線，并對(duì)cDNA的含量進(jìn)行定量分析，計(jì)算樣本的△△Ct值.通過2-△△Ct方法分析基因的相對(duì)表達(dá)情況.

1.2.5報(bào)告基因檢測(cè)

以5×104細(xì)胞/孔的接種量將細(xì)胞接種于24孔板中，24h后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所需的各種DNA，包括mir145表達(dá)或抑制質(zhì)粒、熒光素酶報(bào)告基因和β-半乳糖苷酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中轉(zhuǎn)染6小時(shí)后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液后，細(xì)胞用PBS洗一次，之后加100ul裂解液(50mM Tris，0.1% TritonX-100，1mM DTT，pH7.4)，4℃放置10min后，刮下，收集，13000rpm離心5min后取上清110μL).將30μL細(xì)胞裂解液與120μL β-半乳糖苷酶測(cè)定液混合，于37℃孵育至黃色出現(xiàn)為止，加入80μL 1M Na2CO3終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀410nm測(cè)吸收值，以此作為β-半乳糖苷酶的相對(duì)活性，用于內(nèi)對(duì)照，以標(biāo)定轉(zhuǎn)染效率.將70μL細(xì)胞裂解液與20μL熒光素酶檢測(cè)試劑混勻,立即用SPECTR FLUOR plus 檢測(cè)發(fā)出的熒光信號(hào).該熒光信號(hào)與相應(yīng)的β-半乳糖苷酶OD值之比標(biāo)定后的LUC相對(duì)活性.

2　結(jié)果

2.1乳腺癌細(xì)胞中mir-145表達(dá)水平與干細(xì)胞特性具有相關(guān)性

通過檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系T-47D、MDA-MB231細(xì)胞中mir-145、Nanog表達(dá)水平與乳腺癌干細(xì)胞比例(圖1)，發(fā)現(xiàn)mir-145在T-47D細(xì)胞中的表達(dá)水平是MDA-MB231細(xì)胞的3.54倍(p<0.05),而Nanog在T47D細(xì)胞中的表達(dá)水平只有MDA-MB231細(xì)胞的20%(p<0.05)(圖1 A).流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)(圖1 B )，T-47D細(xì)胞中乳腺癌干細(xì)胞比例(0.13%)遠(yuǎn)少于MDA-MB231細(xì)胞中的乳腺癌干細(xì)胞比例(77.39%)，具有顯著性差異(p<0.01).為進(jìn)一步研究mir-145與Nanog在乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)相關(guān)性，利用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)富集乳腺癌干細(xì)胞，通過熒光定量PCR檢測(cè)mir-145與Nanog的表達(dá)水平(圖1 C).相比較與貼壁細(xì)胞中的表達(dá)量，mir-145在瘤球中的表達(dá)水平均低于貼壁細(xì)胞中的表達(dá)水平，具有顯著性差異(p<0.05).

圖1　mir-145與Nanog表達(dá)相關(guān)性及與干細(xì)胞特性的關(guān)系

2.2mir-145對(duì)Nanog的調(diào)控機(jī)制

通過生物信息學(xué)工具網(wǎng)站MirTarBase檢索mir-145的靶基因，發(fā)現(xiàn)Nanog基因的3’-UTR上存在潛在的mir-145結(jié)合位點(diǎn)(圖2 A).雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示(圖2 B)，在293T細(xì)胞中，mir-145-mimics轉(zhuǎn)染組與Control組相比，mir-145過表達(dá)能夠顯著抑制包含Nanog 3’UTR 的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的活性(p< 0.05)；當(dāng)Nanog 3’UTR中的miR-145 結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變后，mir-145過表達(dá)對(duì)報(bào)告基因的抑制作用消失，即mir-145-mimics轉(zhuǎn)染組與Control組相比的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2 B).在乳腺癌細(xì)胞T-47D中過表達(dá)mir-145 mimics后熒光定量PCR檢測(cè)Nanog表達(dá)水平， mir-145 mimics轉(zhuǎn)染組與Control組相比，mir-145 過表達(dá)進(jìn)一步降低Nanog表達(dá)水平(圖2 C).以上結(jié)果充分說(shuō)明，mir-145 是通過與Nanog 基因的3’UTR 相互作用，負(fù)調(diào)控靶基因Nanog的表達(dá).

圖2　mir-145靶向調(diào)控Nanog基因表達(dá)

2.3mir-145調(diào)控Nanog影響乳腺癌干細(xì)胞特性

通過流式細(xì)胞術(shù)與平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mir-145表達(dá)水平對(duì)乳腺癌干細(xì)胞特性的影響，結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231細(xì)胞中過表達(dá)mir-145后乳腺癌干細(xì)胞群(CD24-CD44+)比例降低(圖3 A)，差異具有顯著意義(p< 0.05).平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)(圖3 B)，MDA-MB231細(xì)胞中過表達(dá)mir-145后，形成的克隆數(shù)量降低，差異具有顯著意義(p< 0.05).

圖3　mir-145影響乳腺癌干細(xì)胞特性

3　討論

Nanog作為轉(zhuǎn)錄因子在維持胚胎干細(xì)胞多潛能性過程中發(fā)揮重要作用[8]，雖然在成體組織中不表達(dá)，但在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9,10]，在乳腺癌中Nanog高表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)，激活MDR1基因表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞耐藥[11].在MCF7細(xì)胞及MDA-MB231細(xì)胞中免疫染色發(fā)現(xiàn)Nanog只在一小部分細(xì)胞中表達(dá)[12].這與腫瘤干細(xì)胞所占比例相符.研究發(fā)現(xiàn)在MCF7細(xì)胞中過表達(dá)Nanog引起乳腺癌干細(xì)胞群的擴(kuò)展[13].另外，在乳腺癌細(xì)胞中抑制Nanog引起細(xì)胞增殖減慢、克隆形成減少以及轉(zhuǎn)移能力減弱[4].最新研究發(fā)現(xiàn)采用TALEN和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除Nanog基因具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和增強(qiáng)化療敏感度的效果[14,15]，Nanog基因敲除、抑制Nanog表達(dá)及功能可單獨(dú)或協(xié)同發(fā)揮腫瘤治療性作用[16]，提示Nanog可作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn).然而目前對(duì)腫瘤細(xì)胞中Nanog基因異常激活和調(diào)控的分子機(jī)制尚未完全闡明.對(duì)這些關(guān)鍵問題研究的不斷深入，將為全面揭示Nanog在腫瘤中的作用提供更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，同時(shí)也為腫瘤分子診斷和靶向治療提供新的思路和方法.

microRNAs 是哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的一類非編碼小分子RNA，具有重要的基因調(diào)節(jié)作用，在腫瘤干細(xì)胞中同樣發(fā)揮重要作用.我們的研究發(fā)現(xiàn)mir-145能夠調(diào)控干細(xì)胞多能基因Nanog，并體現(xiàn)為乳腺癌干細(xì)胞特性的改變，可用于乳腺癌的治療.miRNA mimic 是一種化學(xué)合成的RNA 寡核苷酸，可模擬內(nèi)源miRNA，提高細(xì)胞內(nèi)miRNA 水平，增強(qiáng)miRNA 的功能.通過將mir-145 mimics 導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞中，可能降低乳腺癌病人耐藥風(fēng)險(xiǎn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的幾率，提高患者生存率.基于脂質(zhì)體技術(shù)平臺(tái)的miRNA藥物輸送技術(shù)已進(jìn)行臨床試驗(yàn)，對(duì)實(shí)體瘤患者進(jìn)行嘗試性治療.這一技術(shù)可以使得miRNA類藥物到達(dá)人體內(nèi)部的組織.而外泌體由于其在血液中的穩(wěn)定性與靶向性，將可能成為新一代的藥物輸送平臺(tái).將mir-145包裝在外泌體中，通過外泌體膜表面的特異蛋白靶向乳腺癌干細(xì)胞，將有可能徹底消滅乳腺癌干細(xì)胞，達(dá)到完全治愈乳腺癌患者的目標(biāo).

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(責(zé)任編校：晴川)

LUO Qicong, ZHANG Huan, CHEN Rongshan, CHEN Gang, MI Yanjun

(The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen Fujian 361003, China)

Objective: To investigate the mechanism and function of mir-145 on regulating Nanog in breast cancer cells．Methods: Comparing the expression levels of mir-145 and Nanog of breast cancer cells using Real-Time PCR, comparing the population of cancer stem cells via FACS assay, and culturing and detecting the expression level of mir-145 and Nanog in breast cancer sphere. Breast cancer cells were transfected with mir-145 mimic. Fluorescent quantitative PCR was used to determine mir-145 and Nanog mRNA expression and dual reporter assay was used to determine Nanog protein expression．Results: T-47D cell expressed higher level of mir-145, lower level of Nanog, and smaller population of breast cancer stem cells, while MDA-MB231 cell expressed lower level of mir-145, higher level of Nanog, and larger population of breast cancer stem cells. The mir-145 expression level was lower in sphere and Nanog was higher in sphere comparing to adherent cells. The mir-145 overexpression in breast cancer cells inhibited Nanog mRNA and protein expression and reduced the stem cell population and colony-formation ability. Conclusion: mir-145 can regulate Nanog expression and reverse stemness of breast cencer cells.

breast carcinoma; Nanog; mir-145; cancer stem cell

2016-09-13

廈門科技惠民計(jì)劃項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào)：3502Z20134005).

駱啟聰(1983— )，男，福建泉州人，廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院助理研究員，博士.研究方向：腫瘤細(xì)胞生物學(xué).

Q756

A

1008-4681(2016)05-0010-04