Microbacterium sp.OU01殼聚糖酶Glu51和Asp69定點突變對酶活性的影響

孫玉英,嚴　翠,王淑軍,張繼泉,趙　宏,趙斌元

(1.淮海工學院海洋學院,江蘇連云港 222005;2.江蘇省海洋資源開發研究院,江蘇連云港 222000;3.中國科學院海洋研究所,山東青島 266071)

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Microbacteriumsp.OU01殼聚糖酶Glu51和Asp69定點突變對酶活性的影響

孫玉英1,2,嚴翠1,王淑軍2,張繼泉3,趙宏2,趙斌元2

(1.淮海工學院海洋學院,江蘇連云港 222005;2.江蘇省海洋資源開發研究院,江蘇連云港 222000;3.中國科學院海洋研究所,山東青島 266071)

為確定Microbacteriumsp.OU01殼聚糖酶特定氨基酸與酶活性間的關系,以含殼聚糖酶基因的pCT7-CHISP6H-mMschito質粒為模板,利用反向PCR的方法對殼聚糖酶兩個可能的酶活性位點Glu51(突變成Gln51)和Asp69(突變成Asn69)進行突變,從而構建了兩個單位點突變,突變質粒分別轉化至EscherichiacoliBL21(DE3)并經IPTG誘導表達,測定突變前后酶的比活性,突變酶(Asp69→Asn69)比活力與野生型相比幾乎不變,而突變酶(Glu51→Gln51)比活力大約為野生型的10%。通過測定動力學常數發現,突變酶和天然酶Km幾乎沒有很明顯的變化,但是突變酶(Glu51→Gln51)的Vmax與上述兩種酶的Vmax相比有很明顯的變化。采用DNA Star和Deep view分析軟件,預測突變前后殼聚糖酶的二級結構和三級結構,結果表明,Microbacteriumsp. OU01殼聚糖酶Glu51極有可能是維持酶的催化活力的必需氨基酸,它的突變可能導致酶蛋白二級結構組件及氫鍵網絡的改變,從而導致酶活力的喪失。

殼聚糖酶,定點突變,比活力,必需氨基酸

殼寡糖是殼聚糖進一步降解形成的產物,具有較低的分子量,呈水溶性,容易被機體吸收,作為一種功能性低聚糖,具有抗菌、調節機體免疫、抗腫瘤及促進農作物增產等功效,在醫藥、食品等領域中具有廣泛的應用前景[1],是近幾年糖類研究和應用開發的熱點之一。目前制備殼寡糖的方法主要有化學降解法和酶解法。利用殼聚糖酶降解殼聚糖制備殼寡糖具有專一性強,反應條件溫和,寡糖得率高,不造成環境污染等優點,是制備殼寡糖的首選方法。目前關于殼聚糖酶高產菌株的篩選,酶的分離純化與酶學特征,以及利用基因工程菌異源表達殼聚糖酶的研究比較多[2-11],關于殼聚糖酶的結構和功能方面的研究主要集中在鏈霉菌(Streptomycessp.)[12]、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)[13]、桿菌(Bacillussp.)[12]、松江殼聚糖降解菌(Mitsuariachitosanitabida)[14]、類芽孢桿菌[15-16]和曲霉菌(Aspergillussp.)[17]等所產的殼聚糖酶,其中鏈霉菌(Streptomycessp. N174)的研究更加詳細。

在前期研究中,已從自然界中分離到一株殼聚糖酶活性較高的微桿菌(Microbacteriumsp. OU01),克隆了該殼聚糖酶的全長基因序列(序列注冊號:EF159153),并在大腸桿菌中成功實現了其重組表達,并獲得了具有生物學活性的重組殼聚糖酶[18]。本文在前期的基礎上,利用反向聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)的方法對殼聚糖酶兩個可能的酶活性位點Glu51(突變成Gln51)和Asp69(突變成Asn69)分別進行突變,通過測定動力學常數和結構預測的方法,初步研究了殼聚糖酶的結構和功能的關系,探討微桿菌(Microbacteriumsp. OU01)殼聚糖酶的酶活作用機制,為殼聚糖酶的分子設計和改造提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種與宿主菌微桿菌(Microbacteriumsp.OU01)殼聚糖酶基因保存在pCT7-CHISP6H-mMschito(見圖1)質粒上,由中國科學院海洋研究所動物生殖與遺傳工程課題組保存。克隆宿主Escherichiacoli(E.coli)TOP10F’,表達宿主E.coliBL21(DE3);LB培養基酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L,用NaOH 調pH至7.0;氨芐西林(Ampicillin,Amp)/LB培養基含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養基;酵母提取物、胰蛋白胨英國Oxiod公司;殼聚糖浙江澳興生物科技有限公司;高保真PrimeSTAR? HS DNA聚合酶、異丙基-β-D-乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)日本Takara公司;質粒提取試劑盒上海生工生物工程技術服務有限公司;其他試劑國產分析純。

170-6701 PCR儀美國伯樂公司;FLUOSTAR OMEGA全自動多功能酶標儀德國BMG LABTECH公司。

圖1　質粒pCT7-CHISP6H-mMschito的特征Fig.1　Characterization of the plasmidpCT7-CHISP6H-mMschito注:T7啟動子:堿基20～36;T7啟動子引物位點:堿基20～39;核糖體結合位點:堿基87～90;起始ATG:堿基100～102;信號肽區域:堿基100～177;多聚組氨酸(6xHis)區域:堿基178～195;目標基因(mMschito)區域:堿基196～925;T7反向引物區域:堿基982～1001;T7轉錄終止區域:堿基944～1073;f1起始區域:堿基1144～1599;青霉素抗性基因:堿基1730～2590;pUC起始區:堿基2735～3408。

1.2實驗方法

1.2.1PCR引物設計及突變體構建利用軟件Primer Premier 5.0,根據已克隆的Microbacteriumsp. OU01殼聚糖酶基因序列設計引物[18]。以pCT7-CHISP6H-mMschito質粒為模板進行反向PCR擴增目標產物。

突變子1(MUT1):Glu51-Gln51,將位點GAG突變成CAG,引物設計如下:

MUT1-F:CAGAACTCATCGACGGACT(5′磷酸化)

MUT1-R:GAAGCTGGACACGAGCGAC(5′磷酸化)

突變子2(MUT2):Asp69-Asn69,將位點GAC突變成AAC,引物設計如下:

MUT2-F:AACGGCCGAGGGTACACCG(5′磷酸化)

MUT2-R:TGCGATGTCCTCAAGGTAG(5′磷酸化)

以MUT1-F/MUT1-R為引物對,以質粒pCT7-CHISP6H-mMschito為模板,利用高保真PrimeSTAR? HS DNA聚合酶進行擴增。

PCR反應體系為50 μL,如下:

5×PrimeSTAR buffer 10 μL;三磷酸脫氧核糖核苷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTPs)(10 mmol/L)1 μL;MUT1-F(10 μmol/L)1 μL;MUT1-R(10 μmol/L)1 μL;PrimeSTAR? HS DNA聚合酶0.5 μL;質粒pCT7-CHISP6H-mMschito(100 ng/μL)1 μL;ddH2O 35.5 μL。

PCR擴增程序:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min,共30個循環;最后72 ℃延伸10 min。

同理,突變子2(MUT2)的構建(Asp69-Asn69)僅僅將引物對由MUT1-F/MUT1-R換成MUT2-F/MUT2-R,其余條件均不變。

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行電泳,切膠回收與預測大小一致的片段,片段大小約為3.5 kb,擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳回收后,在T4 DNA連接酶的作用下自連,轉化大腸桿菌感受態細胞TOP10F’,涂布含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板,37 ℃培養過夜,以T7-F/T7-ter為引物對,利用PCR方法對LB平板上的單克隆進行檢測,將PCR檢測陽性克隆搖菌后進行DNA測序,由此篩選到構建的突變體MUT1和MUT2,分別命名為pCT7-CHISP6H-mschito-MUT1和pCT7-CHISP6H-mschito-MUT2。

1.2.2質粒的提取將含質粒pCT7-CHISP6H-mMschito及構建的突變體(測序正確)的E.coliTOP10F’按照1%接種量接種于LB/Amp培養基中培養至OD600為0.6～0.8,按照說明書提取質粒。

1.2.3Microbacteriumsp.OU01殼聚糖酶的誘導表達和純化將上述提取的重組表達質粒(pCT7-CHISP6H-mMschito、-MUT1和-MUT2)分別轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞中,轉化產物接種于LB/Amp液體培養基中37 ℃搖床中培養,測定OD600值到0.6～0.8之間,加入IPTG,使其終濃度為1 mmol/L,誘導表達6 h。然后8000×g離心5 min,收集上清液作為粗酶液。粗酶液用Ni金屬親和層析柱純化。

1.2.4殼聚糖酶的酶活力測定參見文獻[6]。

1.2.5酶的Km和Vmax的測定用0.2 mol/L pH5.6的HAc-NaAc緩沖液配制不同的底物殼聚糖溶液并使其倒數1/[S]成等差級數,依次為10～500 mg/mL的殼聚糖溶液,將殼聚糖酶和突變酶分別與不同濃度的殼聚糖溶液在45 ℃、pH5.6下測定酶活力。采用雙倒數作圖法(Lineweaver-Burk)來測定殼聚糖酶和突變酶的Km和Vmax。即以殼聚糖溶液的濃度的倒數1/[S]為橫坐標,反應速度的倒數1/V為縱坐標作圖,繪出直線并外推至與橫坐標相交,在橫坐標的截距為-1/Km,在縱坐標的截距為1/Vmax。

2　結果與分析

2.1突變質粒的構建

利用反向PCR的方法分別構建了兩個突變體,突變位點分別為Glu51-Gln51和Asp69-Asn69。由圖2可以看出,在突變體MUT1中,編碼第51個氨基酸的三連體密碼子由GAG(編碼谷氨酸)變成CAG(編碼谷氨酰胺);在突變體MUT2中,編碼第69個氨基酸的三連體密碼子由GAC(編碼天冬氨酸)變成AAC(編碼天冬酰胺),兩個突變體的構建正確。

圖2　原始質粒及及突變體部分測序結果Fig.2　Partial sequence of the primary plasmidand the mutant plasmids注:CHI代表非突變體;MUT-1表示編碼第51個氨基酸的密碼子由GAG突變成CAG;MUT-2表示編碼第69個氨基酸的密碼子由GAC突變成AAC。

2.2殼聚糖酶的活性測定

將構建的重組表達質粒(pCT7-CHISP6H-mMschito)及其突變體(pCT7-CHISP6H-mschito-MUT1和pCT7-CHISP6H-mschito-MUT2)分別轉化E.coliBL21(DE3),誘導表達并利用親和層析分離純化后,由圖3可以看出,酶蛋白被吸附在親和層析柱上后,進行線性梯度洗脫,隨著洗脫液中咪唑濃度的逐漸升高,洗脫下來的目的蛋白濃度逐漸升高。分析誘導后所產殼聚糖酶的比活力,結果發現;突變體MUT2與未突變的酶活力大致相等(1543 U/mg和1498 U/mg),而突變體MUT1所產殼聚糖酶活力僅為147 U/mg,大約為未突變酶活力的10%,初步說明Glu51極有可能是維持該殼聚糖酶的催化活力的必需氨基酸。

圖3　SDS-PAGE分析來自Microbacterium sp. OU01的重組酶Fig.3　SDS-PAGE analysis of recombinant chitosanasefrom Microbacterium sp. OU01.注:M:蛋白markers;1:IPTG誘導前的懸浮液;2:IPTG誘導4 h后的懸浮液;3～7:不同濃度的咪唑洗脫親和層析純化重組殼聚糖酶。

2.3酶的Km和Vmax測定

天然酶和突變酶的表觀米氏常數Km和Vmax值如表1所示。通過對數據進行統計學分析,可以發現兩種突變酶與自然酶的表觀米氏常數Km值差異不顯著(p>0.05);突變體MUT1殼聚糖酶Vmax值與自然酶差異極其顯著(p<0.01),而突變體MUT2殼聚糖酶Vmax值與自然酶差異不顯著(p>0.05)。上述比較說明殼聚糖酶Glu51極有可能是維持酶催化活力的必需氨基酸,它的突變導致Vmax的急劇降低,從而導致酶活力的喪失。而Asp69的突變使酶的動力學常數Km和Vmax幾乎沒有很明顯的變化,所以Asp69可能跟酶的活力沒有直接關系。

表1　天然酶和突變酶的Km和Vmax

2.4突變前后殼聚糖酶二級結構的比較

利用DNAStar軟件,通過Garnier-Robson法計算特定氨基酸在特定結構內部的可能性來預測蛋白質分子中的α-螺旋、β-折疊、β-轉角以及無規則卷曲等二級結構區域[19]。如圖4所示,殼聚糖酶Glu51突變成Gln51,α螺旋數目減少一個,β-轉角的數目沒有變化,但在約50～60氨基酸處β-轉角的長度明顯發生了變化,β-無規則卷曲在約50～60氨基酸處減少一個,但是其長度明顯發生了變化。殼聚糖酶Asp69突變成Asn69,α螺旋數目增加一個,β-折疊的數目減少兩個,β-無規則卷曲數目減少一個。

圖4　Microbacterium sp.OU01殼聚糖酶二級結構的預測Fig.4　Prediction of secondary structure of Microbacterium sp.OU01 chitosanase注:A:α-螺旋;B:β-折疊;T:β-轉角;C:β-無規則卷曲;a:突變前Microbacterium sp.OU01殼聚糖酶二級結構;b:突變后Microbacterium sp.OU01殼聚糖酶(Glu51-Gln51)二級結構;c:突變后Microbacterium sp.OU01殼聚糖酶(Asp69-Asn69)二級結構。

2.5突變前后三級結構的比較

通過Swiss-model構建Microbacteriumsp.OU01殼聚糖酶突變前后的立體結構,結果發現突變前后殼聚糖酶的整體三維結構基本一致,Gln51和Asn69都位于酶分子表面β-轉角上。利用DeepView軟件分析51和69位點突變前后氫鍵的變化(圖5),由于51位點的Glu變為Gln,氫鍵的數目由4個變為3個,而且與之形成氫鍵的氨基酸種類及氫鍵距離大部分都發生了改變。突變前,Glu51與Val47(鍵間距離為2.83 A)、Arg234(2.93 A和2.98 A)、Ser48(3.35 A)形成氫鍵;突變后,51Gln分別與Ser47(2.83 A)、Ser48(3.35 A)和Asn52(2.60 A)形成氫鍵。由于69位點的Asp變為Asn,氫鍵由3個變為1個,且與之形成氫鍵的氨基酸種類及氫鍵距離均發生了改變。突變前,Asp69與Gly70(鍵間距離為3.25 A)、Arg71(2.92 A和3.16 A)形成氫鍵;突變后,69Asn僅僅與Arg71(鍵間距離為2.79 A)形成氫鍵。

圖5　Microbacterium sp.OU01殼聚糖酶三級結構突變前后放大圖Fig.5　Tertiary structures of Microbacterium sp.OU01chitosanase with and without mutation

3　討論

目前,部分微生物產殼聚糖酶的空間結構已經獲得了解析,截至2016年1月13日,在Protein Data Bank(PDB)中公布的殼聚糖酶(chitosanase)結構有7個(1CHK、1QGI、1V5C、1V5D、2D05、4ILY和4OLT)。經分析發現:其中1V5C和1V5D,1QGI和2D05系重復結構。因此,在PDB數據庫中公布的chitosanase空間結構實際上應該是5個。為了深入研究殼聚糖酶結構與功能的關系,開展催化機理、底物特異性和穩定性等方面研究,定點突變技術被應用于殼聚糖酶的研究中。論文作者前期獲得的Microbacteriumsp. OU01殼聚糖酶基因編碼氨基酸序列與已經公布空間結構(1CHK)Streptomyces N174的殼聚糖酶序列具有62%相似性。

Fukamizo等對StreptomycesN174殼聚糖酶結構和功能研究發現,對Glu-22和Asp-40這兩個催化中心殘基的任何一個進行功能保守上的氨基酸取代,會導致酶的活力降低到小于1%[20]。根據晶體結構和定點突變結果,可以推斷Glu22是質子供體而Asp40活化水分子,攻擊催化位點附近的糖殘基上的C-1原子。Mitsuariachitosanotabidus3001殼聚糖酶的保守氨基酸Glu121和Glu141是催化的活性氨基酸殘基,M.chitosanotabidus[21]殼聚糖酶的兩個必需谷氨酸(Glu-121和Glu-141)被天冬氨酸取代后,酶活力不足野生型活力的0.2%。這些結果說明,在細菌殼聚糖酶中,與底物相關的羧酸基團位置對于催化活力來說是極其重要的。為探索Microbacteriumsp. OU01殼聚糖酶的活力中心,論文作者比對了GH46家族的殼聚糖酶氨基酸序列,發現Glu51和Asp69在所有已報道殼聚糖酶的氨基酸序列中是保守的。因此本文通過反向PCR法,置換了對應的兩個氨基酸(Glu51→Gln51,Asp69→Asn69),結果發現突變Glu51后殼聚糖酶的比活力很明顯地受到影響,通過測定突變酶的動力學常數Km和Vmax,初步說明Glu51是酶的活性中心必需基團,而Asp69對酶的活力影響不大,這與同為GH46家族的StreptomycesN174殼聚糖酶是不同的。

由實驗得到Microbacteriumsp. OU01殼聚糖酶的結構還未見報道,突變效應的分析在一定程度上受到了制約,通過模型模擬的方法預測該酶分子結構將有助于對該酶分子結構與功能關系的理解,從而實現對酶分子的結構改造。Microbacteriumsp.OU01所產殼聚糖酶Glu51定點突變后只保持初始生物活性的10%,突變后氨基酸的種類、氨基酸殘基之間形成的氫鍵網絡和氫鍵之間的距離、二級結構組件的含量與長度等多個因素都發生了改變,有可能對酶折疊構象所對應的自由能產生影響,從而改變酶的生物活性[22]。

運用定點突變法,向殼聚糖酶的基因中引入突變堿基之后,發現Glu51是維持催化活力的必需氨基酸。這對于進一步在分子水平上研究該殼聚糖酶的分子結構和作用機制以及進行改造奠定了基礎,對于獲得比天然酶活力更高、穩定性更好的工業用酶具有重要的應用價值。更進一步的確定酶的催化作用機制,需要制備Microbacteriumsp.OU01殼聚糖酶的晶體結構,進一步研究該酶的結構和功能的關系。

4　結論

本文以含殼聚糖酶基因的pCT7-CHISP6H-mMschito質粒為模板,利用反向PCR的方法對殼聚糖酶兩個可能的酶活性位點Glu51(突變成Gln51)和Asp69(突變成Asn69)進行突變,構建了兩個點突變,突變質粒分別轉化至E.coliBL21(DE3)并經IPTG誘導表達,測定突變前后酶的比活性,突變酶(Asp69→Asn69)比活力與野生型相比幾乎不變,而突變酶(Glu51→Gln51)比活力大約為野生型的10%;通過測定動力學常數發現,突變酶和天然酶Km幾乎沒有很明顯的變化,但是突變酶(Glu51→Gln51)的Vmax與上述兩種酶的Vmax相比有很明顯變化。采用DNAStar和Deepview分析軟件,預測突變前后殼聚糖酶的二級結構和三級結構,結果表明,Microbacteriumsp. OU01殼聚糖酶Glu51極有可能維持酶的催化活力的必需氨基酸,它的突變可能導致酶蛋白二級結構組件及氫鍵網絡的改變,從而導致酶活力的喪失。

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Effect of site-directed mutagenesis of Glu51 and Asp69 on activity ofMicrobacteriumsp.OU01chitosanase

SUN Yu-ying1,2,YAN Cui1,WANG Shu-jun2,ZHANG Ji-quan3,ZHAO Hong2,ZHAO Bin-yuan2

(1.College of Marine Science,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China；2.Jiangsu Institute of Marine Resources,Lianyungang 222000,China;3.Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071,China)

In order to determine the relationship between amino acid residues at the special site and specific activity ofMicrobacteriumsp.OU01 chitosanase,pCT7-CHISP6H-mMschito plasmid was used as a template for the site-directed mutagenesis from Asp69 to Asn69 and Glu51 to Gln51. The specific activity of chitosanase with and without mutation was measured. Mutation of Glu51 into Gln51 resulted in a drastic loss of specific activity. Through the determination of kinetic constants of enzyme,it was found that the mutant enzyme hadalmostthe same Kmvalue as the native enzyme,but the Vmaxvalue from the mutant enzyme(Glu51→Gln51)varied obviously compared with that of the native enzyme. According to the difference between per-mutant and mutant cDNA sequences,the secondary structure and three-dimensional structure of chitosanase were also predicted using DNA Star and Deep view analysis software. The results showed that the amino acid Glu51 was critical significant for maintaining the activity of chitosanase fromMicrobacteriumsp. OU01. The site-directed mutagenesis ofMicrobacteriumsp. OU01 chitosanase at position 51 changed the properties of secondary structure as well as hydrogen-bonding networks,thus probably resulting in the loss of specific activity.

chitosanase;site-directed mutagenesis;specific activity;essential amino acid

2015-12-29

孫玉英(1974-)，女，博士，副教授，研究方向：微生物酶工程，E-mail：sunyuying125@163.com。

碳谷-江蘇海資院海洋先進材料聯合研究中心開放課題(TG-201402)；江蘇省科技項目產學研聯合創新資金——前瞻性聯合研究項目(BY2014085)；連云港市中小企業技術創新項目(CK1419)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0167-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.025