不同方法提取絞股藍(lán)總皂苷的比較研究

楊婧娟,何少貴,趙夢(mèng)琦,張　希,*

(1.云南中醫(yī)學(xué)院,云南昆明 650500;2.廈門華夏學(xué)院,福建廈門 361024)

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不同方法提取絞股藍(lán)總皂苷的比較研究

楊婧娟1,何少貴2,趙夢(mèng)琦1,張希1,*

(1.云南中醫(yī)學(xué)院,云南昆明 650500;2.廈門華夏學(xué)院,福建廈門 361024)

以常規(guī)乙醇回流法、酶法及微生物發(fā)酵法提取絞股藍(lán)總皂苷,通過(guò)總皂苷含量、單體皂苷組分、抗氧化活性三方面對(duì)不同提取方法進(jìn)行比較研究。結(jié)果顯示,復(fù)合酶法提取所得絞股藍(lán)總皂苷含量達(dá)7.69%,比常規(guī)回流法相對(duì)提高了31%,但對(duì)皂苷組分轉(zhuǎn)化未見(jiàn)顯著效果。微生物發(fā)酵提取破壁效果最佳,提取物中絞股藍(lán)總皂苷含量達(dá)8.34%,比回流提取法所得含量相對(duì)提高了42.1%;經(jīng)發(fā)酵處理后,絞股藍(lán)總皂苷中活性更強(qiáng)的次級(jí)苷組分如絞股藍(lán)皂苷V-AH(人參皂苷Rg3)等含量增加,對(duì)DPPH·清除的IC50值相比常規(guī)法由1.544 mg/mL降至0.562 mg/mL,對(duì)Fe3+還原力的VC當(dāng)量抗氧化能力AEAC值提高至(236.299±12.785)mg VC/g固形物,顯示出該方法的優(yōu)越性。

絞股藍(lán)總皂苷,提取,酶法,微生物發(fā)酵,抗氧化活性

絞股藍(lán)(GynostemmapentaphyllumMakin.)為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草本藥食兩用資源,主要活性成分為絞股藍(lán)皂苷,具有與人參皂苷相同的四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型結(jié)構(gòu),其中部分單體絞股藍(lán)皂苷與人參皂苷同物異名[1]。藥理學(xué)研究表明,絞股藍(lán)總皂苷及其中的部分單體皂苷具有血糖、血脂調(diào)節(jié)、腫瘤抑制、抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫等功效[2],在保健食品及藥品研發(fā)中具有廣闊的應(yīng)用前景,因此,探究有效的提取方法以獲取活性成分具有重要意義。

目前關(guān)于絞股藍(lán)總皂苷提取的研究只注重其提取率的提高,并未關(guān)注在提取率提高的同時(shí),提取方法對(duì)絞股藍(lán)總皂苷中組分單體結(jié)構(gòu)的影響,而構(gòu)效關(guān)系研究已充分表明其中單體皂苷的結(jié)構(gòu)直接關(guān)系其生物利用率及生物活性。如生藥中含量較多的絞股藍(lán)皂苷Ⅲ(人參皂苷Rb1)等的分子結(jié)構(gòu)并不是活性最佳狀態(tài),通過(guò)水解皂苷側(cè)鏈糖基轉(zhuǎn)化為低糖鏈次級(jí)苷絞股藍(lán)皂苷V-AH(人參皂苷Rg3)后,才顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性[3-4]。然而,Rg3等作為稀有皂苷在生藥中含量甚微,主要由含量相對(duì)高的主皂苷轉(zhuǎn)化而得。因此,尋找一種提取方法,可以在提高絞股藍(lán)總皂苷提取率的同時(shí),又能對(duì)其中單體皂苷起到結(jié)構(gòu)修飾作用,轉(zhuǎn)化為活性更高的稀有皂苷成為亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

本研究主要應(yīng)用常規(guī)乙醇回流法、酶法和微生物發(fā)酵法提取絞股藍(lán)總皂苷,通過(guò)活性成分含量、單體皂苷組分、抗氧化活性三方面對(duì)不同提取方法進(jìn)行比較研究,為有效獲取更高活性的絞股藍(lán)總皂苷提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

絞股藍(lán)藥材干燥粉碎后過(guò)40目篩備用，購(gòu)自張仲景大藥房,產(chǎn)地安徽亳州;綠色木霉云南中醫(yī)學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室;人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品:人參皂苷Rb1、Rd、Rg3、F2購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技;DPPH、抗壞血酸購(gòu)自Aladdin;纖維素酶:20000 U/g、果膠酶:30000 U/g購(gòu)自深圳恒生生物科技有限公司;所用其他試劑均為分析純。

SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司;LDZX-40BI型滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;UV-1800PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)翱藝儀器(上海)有限公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱上海醫(yī)療器械五廠;DK-98ⅡA型水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司;SC-3614型離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1絞股藍(lán)總皂苷的提取方法

1.2.1.1乙醇回流法取一定量絞股藍(lán)藥材,按料水比1∶10加入75%乙醇,置于80 ℃回流提取2次,每次90 min,合并兩次收集的上清液,定容,備用[5]。

1.2.1.2酶法纖維素酶法:取一定量絞股藍(lán)藥材,按80 U/g生藥用量加入纖維素酶,調(diào)pH5.0,置于50 ℃酶解2 h,然后加入75%乙醇于80 ℃提取90 min,收集上清液,定容,備用。

果膠酶法:取一定量絞股藍(lán)藥材,按150 U/g生藥用量加入果膠酶,調(diào)pH為4.0,置于50 ℃酶解2 h,加入75%乙醇于80 ℃提取90 min,收集上清液,定容,備用。

復(fù)合酶法:取一定量絞股藍(lán)藥材,按每克生藥加入80 U纖維素酶和150 U果膠酶的用量進(jìn)行復(fù)合酶解,調(diào)pH為4.5,置于50 ℃下酶解2 h,加入75%乙醇于80 ℃提取90 min,收集上清液,定容,備用[6]。

1.2.1.3微生物發(fā)酵法取一定量絞股藍(lán)藥材與輔料麩皮按3∶2比例混勻后滅菌備用,接種5%綠色木霉,于30 ℃培養(yǎng)5 d,加入75%乙醇于80 ℃提取90 min,收集上清液,定容,備用。

1.2.2絞股藍(lán)總皂苷含量測(cè)定

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)方程建立[7]精密稱取干燥至恒重的人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,加入甲醇溶解定容至5 mL,制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取20、40、60、80、100 μL于具塞試管中,水浴揮干其中溶劑,分別加入5%香草醛冰醋酸溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)0.2 mL、高氯酸0.8 mL,搖勻后于60 ℃恒溫水浴15 min,取出立即置冷水中冷卻,各加入冰醋酸5 mL,搖勻,以甲醇為試劑空白,在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo),以皂苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.962x-0.021,R2=0.999。

1.2.2.2樣品測(cè)定取各樣品提取物稀釋2倍,按標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方法操作測(cè)定樣品中絞股藍(lán)皂苷的含量(%)。

1.2.3絞股藍(lán)總皂苷提取物薄層層析(TLC)檢測(cè)分別取樣品5 μL,用毛細(xì)管點(diǎn)于薄層層析板上,置于層析缸中展開(kāi),其中展開(kāi)劑為氯仿、甲醇、水(體積比為7∶3∶0.5),當(dāng)展開(kāi)至離頂部邊緣約1 cm時(shí)取出,吹干板上溶劑,噴灑10%硫酸乙醇溶液,置于121 ℃,10 min,顯色[8]。

1.2.4絞股藍(lán)總皂苷提取物抗氧化活性測(cè)定DPPH自由基清除法測(cè)定抗氧化能力[9]:將提取液濃縮干燥成固形物后制備成濃度分別為0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mg/mL的絞股藍(lán)總皂苷提取物樣液,各取1.5 mL,分別加入 2.5 mL 濃度為6.5×10-5mol/L DPPH乙醇溶液中,避光反應(yīng)20 min,測(cè)定其在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度Ai;測(cè)定1.5 mL 50%乙醇溶液與2.5 mL DPPH溶液混合后在波長(zhǎng)517 nm處吸光度A0;測(cè)定1.5 mL提取物樣液與2.5 mL 50%乙醇溶液反應(yīng)后在波長(zhǎng)517 nm處吸光度Aj。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算絞股藍(lán)總皂苷提取物自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100。以抗壞血酸(VC)為參照,同操作測(cè)定不同濃度VC對(duì)DPPH自由基清除率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以各樣品清除率達(dá)到50%時(shí)的作用濃度(IC50值)表示其對(duì)DPPH自由基的清除能力。

鐵離子還原能力測(cè)定[10]:將提取液濃縮干燥成固形物后制備成0.6 mg/mL的絞股藍(lán)總皂苷提取物樣液,各取1.0 mL,分別加入2.5 mL 濃度0.2 mol/L磷酸緩沖液、2.5 mL濃度1%的鐵氰化鉀溶液,置于50 ℃水浴20 min,取出后迅速冷卻,加入2.5 mL濃度10%三氯乙酸溶液,離心10 min后取上清液2.5 mL,再加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL濃度0.1%三氯化鐵溶液,混勻后反應(yīng)10 min,測(cè)定其在波長(zhǎng)700 nm處的吸光度值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。另以不同濃度抗壞血酸(VC)同操作繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.899x+0.008,R2=0.994),計(jì)算絞股藍(lán)總皂苷提取物的VC當(dāng)量抗氧化能力AEAC(ascorbic acid equivalent antioxidant capacity)。

2　結(jié)果與分析

2.1酶法對(duì)絞股藍(lán)總皂苷提取的影響

以不同的酶對(duì)絞股藍(lán)總皂苷進(jìn)行提取,提取物含量結(jié)果如圖1所示。應(yīng)用酶法提取所得絞股藍(lán)總皂苷含量均高于常規(guī)乙醇回流法所得,其中酶法所得提取物含量:果膠酶法<纖維素酶法<復(fù)合酶法,經(jīng)過(guò)復(fù)合酶酶解,使提取物中絞股藍(lán)總皂苷含量達(dá)到7.69%,比回流法(5.87%)相對(duì)提高了31%。復(fù)合酶集合了纖維素酶和果膠酶,兩種酶共同發(fā)揮作用,破壞植物組織細(xì)胞壁的致密性,可以有效降解細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的果膠、纖維素等,利于活性成分溶出,提高提取率[11],提取效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用纖維素酶、果膠酶。

圖1　不同提取方法所得絞股藍(lán)總皂苷含量Fig.1　The concentration of total gypenosidesextracted by different methods

不同方法所得絞股藍(lán)總皂苷的人參皂苷組分如圖2所示,與常規(guī)乙醇回流法相比,酶法提取對(duì)絞股藍(lán)總皂苷中人參皂苷組分無(wú)顯著影響。色譜板b顯示提取效果較優(yōu)的復(fù)合酶法所得總皂苷中單體皂苷組分與回流法提取物基本一致。比較三種不同酶解效果,色譜板a顯示纖維素酶法提取物在Rf 4.1處的點(diǎn)相比果膠酶及復(fù)合酶法提取物顏色略淺,提示該組分有一定程度的降解,其他組分無(wú)明顯異同。說(shuō)明酶法提取絞股藍(lán)總皂苷主要優(yōu)勢(shì)在于破壁、促進(jìn)有效成分溶出,對(duì)組分轉(zhuǎn)化未見(jiàn)顯著效果。

圖2　不同方法所得絞股藍(lán)總皂苷TLC圖譜Fig.2　The TLC of total gypenosidesextracted by different methods注:a中數(shù)字:1.復(fù)合酶提取法;2.果膠酶提取法;3.纖維素酶提取法;b中數(shù)字:1.復(fù)合酶提取法2.乙醇回流法。

2.2微生物發(fā)酵法對(duì)絞股藍(lán)總皂苷提取的影響

以綠色木霉發(fā)酵絞股藍(lán)后提取所得絞股藍(lán)總皂苷含量為8.34%,相比常規(guī)回流提取法,提取物含量相對(duì)提高了42.1%,提取效果也優(yōu)于復(fù)合酶提取法,結(jié)果如圖3所示。微生物發(fā)酵提取與酶法提取本質(zhì)相同,主要是利用酶對(duì)植物組織產(chǎn)生破壁作用,而微生物在發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生豐富酶系協(xié)同發(fā)揮作用,如綠色木霉可分泌纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、糖苷酶等胞外酶,因此效果優(yōu)于簡(jiǎn)單的酶疊加,可顯著提高細(xì)胞壁的通透性,強(qiáng)化提取效率。

圖3　不同提取方法所得絞股藍(lán)總皂苷含量Fig.3　The concentration of total gypenosides extracted by different methods注:1.乙醇回流法;2.復(fù)合酶提取法;3.微生物發(fā)酵法。

圖4　不同方法所得絞股藍(lán)總皂苷TLC圖譜Fig.4　The TLC of total gypenosides extracted by different methods注:TLC中數(shù)字表示:1.微生物發(fā)酵法;2.乙醇回流法;TLC中字母對(duì)應(yīng)Rf值:a:0.35;b:1.0;c:1.45;d:1.6;e:1.75;f:2.1;g:2.6;h:1.5;i:0.5。

圖5　絞股藍(lán)皂苷組分轉(zhuǎn)化分析圖Fig.5　Transformation analysis of gypenoside component

2.3不同方法提取對(duì)絞股藍(lán)總皂苷提取物抗氧化活性的影響

由表1抗氧化能力測(cè)定結(jié)果可知,復(fù)合酶法及發(fā)酵法提取的絞股藍(lán)總皂苷抗氧化能力優(yōu)于常規(guī)乙醇回流提取物,其中發(fā)酵法提取物抗氧化能力最佳,其對(duì)DPPH·清除的IC50值相比常規(guī)法由1.544 mg/mL降至0.562 mg/mL,對(duì)Fe3+還原力提高至(236.299±12.785) mg VC/g固形物,提示發(fā)酵處理對(duì)絞股藍(lán)總皂苷提取物的抗氧化活性帶來(lái)一定影響。

由于復(fù)合酶法及微生物發(fā)酵法提取物中絞股藍(lán)總皂苷含量相對(duì)較高,因此,在相同固形物濃度下,總皂苷含量越高可能造成抗氧化能力越強(qiáng),即活性物質(zhì)含量與抗氧化活性呈正比例關(guān)系。另外,在三種提取方法中,發(fā)酵法提取物中皂苷組分相對(duì)發(fā)生了變化,一些次級(jí)苷如Rd、Rg3含量增加等,這些轉(zhuǎn)化可能導(dǎo)致總皂苷抗氧化活性受到影響。有研究表明人參皂苷抗氧化活性的高低與單體皂苷之間的協(xié)同作用有關(guān)[14-15],發(fā)酵過(guò)程使絞股藍(lán)皂苷組分的構(gòu)成和比例發(fā)生改變,必然會(huì)帶來(lái)組分間協(xié)同作用的差異,可能進(jìn)一步影響其抗氧化活性。

表1　不同提取方式所得絞股藍(lán)總皂苷的抗氧化能力

注:不同上標(biāo)字母表示在p<0.05水平下差異顯著。

3　結(jié)論

應(yīng)用酶法和微生物發(fā)酵法提取所得絞股藍(lán)總皂苷含量均高于常規(guī)乙醇回流法提取物。比較不同酶法提取,復(fù)合酶法效果優(yōu)于單獨(dú)使用纖維素酶及果膠酶,經(jīng)過(guò)復(fù)合酶酶解,使提取物中絞股藍(lán)總皂苷含量達(dá)到7.69%,比回流法(5.87%)相對(duì)提高了31%,但對(duì)皂苷組分轉(zhuǎn)化未見(jiàn)顯著效果。微生物發(fā)酵提取破壁效果最佳,提取物中絞股藍(lán)總皂苷含量達(dá)8.34%,比回流提取法含量相對(duì)提高了42.1%;經(jīng)發(fā)酵處理后,絞股藍(lán)總皂苷中單體皂苷組分相對(duì)發(fā)生了變化,一些活性更強(qiáng)的次級(jí)苷如Rg3含量增加;而絞股藍(lán)皂苷含量及組分構(gòu)成、比例的改變對(duì)其活性產(chǎn)生了影響,表現(xiàn)為發(fā)酵提取樣對(duì)DPPH自由基清

除能力及還原力顯著提高。綜合比較三種方法,微生物發(fā)酵法不僅能提高活性物質(zhì)的溶出率,在發(fā)酵過(guò)程中藥材本身相當(dāng)于誘導(dǎo)物,可使微生物定向產(chǎn)生特異性水解酶實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化,絞股藍(lán)總皂苷抗氧化活性也顯著提高,顯示出該方法的優(yōu)越性。但本研究中關(guān)于發(fā)酵提取樣單體皂苷間的轉(zhuǎn)化,對(duì)已知成分還需定量分析、對(duì)未確定成分還需進(jìn)一步研究確定其成分歸屬,為微生物發(fā)酵法應(yīng)用于天然活性物質(zhì)的提取提供科學(xué)參考。

[1]金亭亭,孫兆林,江蔚新.絞股藍(lán)化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2014,16(10):30-32.

[2]史琳,宋東平,潘明佳，等.絞股藍(lán)皂苷成分的研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2011,34(6):456-464.

[3]Li W,Liu Y,Zhang J W,et al.Anti-androgen-independent prostate cancer effects of ginsenoside metabolitesinvitro:mechanism and possible structure-activity relationship investigation[J].Archive of Pharmacal Research,2009,1(32):49-57.

[4]Mona Abdel Tawab,Ute Bahr,karas Michael,et al. Degradation of ginsenosides in humans after oral andministration[J]. Drug Metab Dispos,2003,31(8):1065-1071.

[5]沈宏偉,肖彥春,車仁國(guó).絞股藍(lán)中總皂苷的提取及含量研究[J].食品科技,2008(4):158-160.

[6]李元波,殷輝安,唐明林.復(fù)合酶解法提取三七皂苷的實(shí)驗(yàn)研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2005,l17(4):488-492.

[7]林碩,岳琳娜,高學(xué)玲，等.超聲波強(qiáng)化提取絞股藍(lán)皂苷的工藝研究[J].食品科學(xué),2009,30(14):72-75.

[8]楊宇. 生物酶法轉(zhuǎn)化絞股藍(lán)皂苷的研究[D].遼寧省大連市:大連工業(yè)大學(xué),2009.

[9]鄭德勇,安鑫南.竹葉提取物清除DPPH自由基的測(cè)定方法[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,34(1):59-62.

[10]Apati P,Szentmihalyi K,Kristo ST,et al.Herbal remedies of Solidago-correlation of phytochemical characteristics and antioxidant properties[J].Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis,2003,32(4):1045-1053.

[11]王劍文,許云峰,周建芹，等.酶法輔助強(qiáng)化中藥提取過(guò)程研究進(jìn)展[J]. 生物加工過(guò)程,2008,6(6):6-11.

[12]Cheng L Q,Na J R.,Bang M H,et al. Conversion of major ginsenoside Rb1to 20(S)-ginsenoside Rg3by Microbacterium sp.GS514[J].Phytochemistry,2008,69:218-224.

[13]Son J W,Kim H J,Oh D K. Ginsenoside Rd production from the major ginsenoside Rb1by beta-glucosidase from Thermus caldophilus[J].Biotechnology Letters,2008,4:713-716.

[14]Attele A S,Wu J A,Yuan M. Ginseng Pharmacology(mutiple constituents and multiple actions)[J]. Biochemical Pharmacology,1999,58:1685-1693.

[15]Zai-Qun Liu,Xu-Yang Luo,Yun-Xiu Sun,et al.Can ginsenosides protect human erythrocytes against free-radical-induced hemolysis[J]. Biochimica et Biophysica Acta,2002,1572:58-66.

Compared study on extraction of total gypenosides by different methods

YANG Jing-juan1,HE Shao-gui2,ZHAO Meng-qi1,ZHANG Xi1,*

(1.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China;2.Xiamen Huaxia University,Xiamen 361024,China)

To study the extraction effects of traditional reflux techniques,enzyme techniques,microbial fermentation techniques,the content,consititude,antioxidant activities of total gypenosides were evaluated. The results exhibited that the total gypenosides contents by complex enzyme method were reached to 7.69%,Which increased by 31% comparing with traditional method,but transformation of saponins constituents did not detected signiflcantly by the enzyme techniques. The wall-breaking extraction effects of fermentation method was most excellent,the total gypenosides contents by this method were reached to 8.34%,Which increased by 42.1% comparing with traditional method,and transformation of component saponins involved in the fermentation process,such as the contents of gypenosides V-AH(ginsenoside Rg3)were increased. Due to fermentation,IC50of DPPH radical scavenging capacity was reduced from 1.544 to 0.562 mg/mL comparing with traditional method,and ascorbic acid equivalent antioxidant capacity on reducing power of Fe3+were reached to(236.299±12.785) mg VC/g solids. In summary,the microbial fermentation extraction method was prior to other methods.

total gypenosides;extraction;enzyme techniques;microbial fermentation;antioxidant

2016-02-17

楊婧娟(1986-)，女，碩士，助教，研究方向:天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),E-mail：yjj23@126.com。

張希(1982-)，女，博士，講師，研究方向:藥食資源開(kāi)發(fā)與利用,E-mail：zhangxi1030@hotmail.com。

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2014Y230)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)16-0269-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.045