雌激素皮下注射對兔視網膜缺血再灌注損傷的預防作用

葛嫣然，邵宏超，王福海

(1華北理工大學附屬醫院，河北唐山 063000；2河北青縣人民醫院)

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雌激素皮下注射對兔視網膜缺血再灌注損傷的預防作用

葛嫣然1，邵宏超1，王福海2

(1華北理工大學附屬醫院，河北唐山 063000；2河北青縣人民醫院)

目的觀察雌激素對兔視網膜缺血再灌注損傷的預防作用。方法55只雄性健康純種大耳白兔，將其隨機分為正常假手術組(5只)、缺血組(25只)、治療組(25只)。治療組皮下注射苯甲酸雌二醇1 mg/kg，共7 d；缺血組給予等量生理鹽水皮下注射7 d。缺血組與治療組制備視網膜缺血再灌注損傷模型，正常假手術組僅進行前房穿刺。觀察缺血組與治療組再灌注后3、6、12、24、72 h及正常假手術組視網膜病理形態學變化，免疫組織化學SABC法測算其視網膜組織中bax的陽性細胞數。結果治療組再灌注后3、6、12、24、72 h視網膜水腫、細胞空泡變性等改變均較缺血組輕，視網膜bax陽性細胞數均較缺血組少(P均<0.05)。結論雌激素對兔視網膜缺血再灌注損傷有預防作用，其機制可能為下調bax表達。

視網膜；缺血再灌注損傷；苯甲酸雌二醇；bax蛋白；細胞凋亡

在臨床上，視網膜缺血損傷超過90 min，視網膜功能將永久受損。研究[1]發現，5～10 min的缺血后再灌注已可造成視網膜細胞的明顯凋亡。研究證明，凋亡是視網膜缺血再灌注損傷中神經細胞死亡的主要形式，而bax為重要的凋亡調控基因。雌激素可通過清除自由基、抗氧化、抗神經凋亡減少缺血再灌注損傷，減少缺血性心腦血管病和視網膜中央靜脈阻塞的發生[2～4]。本實驗通過建立兔視網膜缺血再灌注損傷模型，觀察了雌激素對兔視網膜缺血再灌注損傷的預防作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物及試劑55只健康純種大耳白兔，體質量(3.0±0.2)kg，雄性，外眼及眼底檢查均正常，室溫環境飼養。苯甲酸雌二醇(天津金耀氨基酸有限公司)，bax抗體(武漢博士德生物工程公司)，SABC試劑盒(即用型)購自武漢博士德生物工程公司，HE染色試劑由本院病理教研室提供。

1.2兔視網膜缺血再灌注損傷模型制備及雌激素用法實驗分為正常假手術組(5只)、缺血組(25只)、治療組(25只)。治療組皮下注射苯甲酸雌二醇1 mg/kg，共7 d。缺血組給予等量生理鹽水皮下注射7 d。缺血組與治療組采用升高眼內壓方法制備視網膜缺血再灌注損傷模型，正常假手術組僅進行前房穿刺。正常假手術組前房穿刺后即處死，缺血組與治療組在再灌注后3、6、12、24、72 h各處死5只兔，用于下述實驗。

1.3視網膜病理形態學觀察方法摘除兔眼球,置于4%多聚甲醛固定24 h,去除眼前節組織,后段眼環再固定4 h，梯度乙醇脫水，透明，浸蠟，包埋，切片。切片HE染色，光鏡顯微鏡下觀察視網膜病理形態學變化。

1.4視網膜bax蛋白檢測采用免疫組織化學SABC法檢測兔視網膜bax蛋白，將切片常規脫蠟后熱修復抗原，滴加H2O2滅活內源性酶,滴加山羊血清封閉液封閉。依次加入抗bax抗體(鼠抗兔IgG)、生物素化山羊抗鼠IgG、SABC、DAB顯色液，蘇木素復染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察，細胞質染成棕黃色為蛋白陽性表達。在視網膜切片中央部位向兩側各取兩個連續不重疊的高倍視野，計數每個視野陽性細胞數，以平均數作為每張切片陽性細胞數。

2　結果

正常假手術組視網膜內界膜平滑完整，三層細胞分界清楚，節細胞呈單層排列，按細胞核大小分為兩類：一類大核淺染；另一類小核深染，核內染色質分布均勻。內、外核層細胞均呈多層排列，其厚度、染色均勻，細胞排列整齊緊密。缺血組缺血再灌注損傷后24 h可見各層細胞排列疏松，細胞間隙增大，神經纖維層輕度腫脹；傷后24～72 h，視網膜水腫，部分細胞空泡樣變，視網膜神經節細胞數量減少。治療組傷后24 h，視網膜各層細胞排列稍顯疏松，細胞間隙略增大，傷后24～72 h，視網膜水腫相對較輕，少量細胞空泡變性等改變，視網膜神經節細胞數量輕度減少。治療組視網膜在再灌注后3、6、12、24、72 h的病理改變均較缺血組明顯減輕。缺血組、治療組視網膜bax陽性細胞數比較結果見表1。

表1　缺血組、治療組視網膜bax陽性細胞數比較(個

注：與缺血組同時點比較，*P<0.05。

3　討論

雌激素是一類重要的類固醇激素，可促進女性生殖器官成熟，維持女性特征和生殖系統活動。在中樞神經系統及骨組織中也發揮著重要作用，與視網膜血管生成調控、視網膜缺血再灌注損傷、眼底惡性腫瘤及老年性黃斑變性等眼部生理及病理過程有密切關聯[5]。Nonaka等[6]在大鼠視網膜缺血再灌注損傷實驗中發現，雌激素可以減少白細胞在缺血視網膜內聚集，從而減輕再灌注時神經組織損傷。Zhou等[7]在繼發性青光眼的實驗中發現，雌激素可通過抑制細胞凋亡減少神經節細胞及神經纖維丟失。代艷等[8]發現雌激素可以減輕治療組視網膜內層萎縮變性程度，使神經節細胞凋亡數量減少。Russo等[9]在大鼠急性眼壓升高模型的實驗中發現，雌激素可減少由高眼壓導致的視網膜神經節細胞的凋亡。王建平等[10]在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型實驗中發現，17β-雌二醇可以通過升高凋亡抑制基因bcl-2的表達，減少腦缺血再灌注損傷細胞的凋亡。

本研究采用HE染色觀察視網膜組織形態學變化，發現治療組再灌注后各時間點視網膜病理改變均較缺血組明顯減輕，提示雌激素能夠減輕視網膜缺血再灌注損傷，對維持視網膜功能、保護視網膜細胞有重要的治療作用。bax是神經細胞調亡的重要調節因子，基因位于染色體19q13.3-19q13.4，含有6個外顯子。研究表明，bax在神經系統損傷后表達增強，說明bax在神經損傷后視網膜神經節的繼發性死亡中起重要作用。通過對凋亡相關基因的研究發現，bax、bcl-2、bcl-xs、bad、bag-1具有同源性，bax和bcl-2可以分別以同源二聚體存在，也可以形成異源二聚合體。bcl-2是一種抗氧化劑，它不能改變內源性過氧化物產生的速度，但能完全阻止脂質過氧化，保護細胞免受H2O2等誘導的凋亡。本實驗中缺血組及治療組視網膜中可見bax陽性細胞表達，缺血組bax陽性細胞在再灌注3 h即有表達，6 h已較顯著，24 h達到高峰，72 h仍有所表達；雌激素治療組陽性細胞出現時間較缺血組晚，且表達明顯低于缺血組。此研究結果表明，雌激素能抑制bax基因的表達從而抑制細胞凋亡。

綜上可見，雌激素對兔視網膜缺血再灌注損傷有預防作用，其機制可能為下調bax表達。

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唐山市科技計劃項目(12140209A-47)。

邵宏超(E-mail: shaohongchao@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.016

R774.1

A

1002-266X(2016)23-0050-02

2015-10-29)