毛細管電泳電化學發光檢測香草扁桃酸和高香草酸

楊洋，孫雪梅,李傳龍

(青島科技大學 化學與分子工程學院　生態化工教育部重點實驗室，山東 青島　266042)

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毛細管電泳電化學發光檢測香草扁桃酸和高香草酸

楊洋，孫雪梅,李傳龍

(青島科技大學 化學與分子工程學院生態化工教育部重點實驗室，山東 青島266042)

利用毛細管電泳電化學發光(CE-ECL)法檢測了尿樣中的香草扁桃酸(VMA)和高香草酸(HVA)，得到了最佳的分離檢測條件：50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.2)；分離電壓16 kV；檢測電勢1.2 V(相對于飽和甘汞電極).在最佳條件下，VMA和HVA的濃度檢測限(S/N=3)分別為5.0×10-7mol/L和6.1×10-7mol/L，線性回歸系數分別為0.999 3和0.997 9.并以此方法將尿液中的VMA和HVA在10 min內有效地分離檢測，不受其他干擾，得到加標回收率分別為98%和99%，取得了滿意的結果.

毛細管電泳;電化學發光檢測;香草扁桃酸;高香草酸

香草扁桃酸(vanilla mandelic acid,VMA)和高香草酸(homovanillic acid,HVA)是人體內神經遞質兒茶酚胺的主要終末代謝產物，兒茶酚胺由腎上腺髓質、交感神經、中樞神經系統內的激素通過生物合成而得，這2種產物可以作為神經母細胞瘤和嗜鉻細胞瘤的腫瘤標記物，大約有90%的患者尿液中VMA和HVA的含量都會升高[1]，因此，檢測尿中VMA 和HVA對2種細胞瘤早期診斷及病情監測有著重要的臨床意義.對于VMA或HVA的檢測前人做了大量的工作，傳統的檢測方法主要有重氮法[2]、微柱法[3]、層析法[4]等，但這些方法過程繁瑣，易受外界干擾，所以很難用于臨床檢測.高效液相色譜法對于尿液中HVA和VMA 的檢測具有可靠性強、特異性高、準確性好等優點，但是因為其儀器設備特殊，并且價格昂貴，所以難以廣泛應用于臨床[5].毛細管電泳作為一種新型的有效的分離分析技術，具有分析速度快、分辨率高、試樣消耗量小等優點.電化學發光檢測選擇性好、靈敏度高、線性范圍寬，經常與毛細管電泳技術相結合來達到更低的檢測限，目前已廣泛應用于醫藥科學、生命科學、分子生物學[6-8]等多個領域.國內雖然有關于用毛細管電泳來檢測尿液中神經遞質的代謝產物的報道，但是要預處理樣本，操作比較麻煩[9].本文結合了毛細管電泳與電化學發光檢測技術，建立了一種能夠簡單快速分離檢測尿樣中VMA和HVA的方法.

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

MPI-A型毛細管電泳電化學發光檢測儀(西安瑞邁分析儀器有限責任公司)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；三電極體系由自制的碳纖維簇微盤電極(工作電極)、飽和甘汞電極(參比電極)、鉑絲電極(輔助電極)組成.彈性石英毛細管(60 cm×25 μm I.D.,375 μm O.D.)(河北永年光導纖維廠)；香草扁桃酸標準品，高香草酸標準品，美國Sigma公司；磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，市售分析純試劑；三聯吡啶釕.

1.2實驗方法

實驗中CE分離系統和ECL檢測池的俯視圖同參考文獻[10]，簡單地說，由高壓電源在毛細管兩端提供高壓(0～30 kV)，毛細管兩端插在存有緩沖液的檢測池中，在進樣端施加高壓，檢測池采用的三電極體系為：碳纖維素微盤電極(工作電極)，其制作過程同文獻[11]，飽和甘汞電極(參比電極)，鉑絲電極(輔助電極).把工作電極固定在檢測池上,在三維顯微鏡下將毛細管與工作電極間的距離調節為80～100 μm，將1.2 V作為檢測電勢,進樣方式為12 kV下電遷移進樣10 s.當毛細管內電滲流達到恒定值后開始進樣并記錄電泳圖.

2　結果與討論

2.1香草扁桃酸和高香草酸電化學發光行為

采用循環伏安法，在含有5.0×10-3mol/L Ru(bpy)32+的50 mmol/L pH 為8.2的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中進行循環伏安掃描，得到如圖1a所示的電化學發光強度譜圖，在上述條件下分別加入VMA和HVA，循環伏安掃描所得的相應的電化學發光譜圖，如圖1b、c所示.

圖1曲線a反應出，Ru(bpy)32+溶液本身在這種實驗條件下電化學發光強度不是很明顯.但隨著VMA和HVA的加入，Ru(bpy)32+的電化學發光信號明顯增強(圖1b,c)，說明了VMA和HVA可以與Ru(bpy)32+相互作用，產生比較強的發光信號，因此，本實驗可通過加入Ru(bpy)32+采用電化學發光的方法來檢測VMA和HVA.

a.Ru(bpy)32+;b.Ru(bpy)32++VMA;c.Ru(bpy)32++HVA.圖1　電化學發光曲線Fig.1　Curves of the ECL emission

2.2VMA與HVA分離條件的選擇

2.2.1緩沖溶液種類的選擇

緩沖溶液的成分直接影響毛細管內的電滲流和待測組分的遷移及最后的分離效果，實驗考察了硼酸鹽和磷酸鹽緩沖體系，結果得出，在磷酸鹽緩沖體系中，樣品峰形好，基線平穩，因此選擇磷酸鹽作為電泳緩沖溶液.

2.2.2緩沖溶液pH值的選擇

在50 mmol/L不同pH值的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系中分別檢測VMA和HVA，得到2種物質電化學發光強度與pH值的關系，見圖2.由圖2可知，當緩沖液pH為8.2時，2物質的電化學發光強度均最大，因此選擇緩沖液的pH為8.2.

1.VMA;2.HVA.圖2　電化學發光強度隨緩沖液pH變化的曲線Fig.2　Curves of ECL intensity along with the change of the buffer pH

2.2.3緩沖液濃度的選擇

在不同濃度磷酸鹽(pH為8.2)的條件下分別檢測了VMA和HVA，所得的電化學發光強度以及遷移時間tm隨緩沖溶液濃度cB的變化曲線如圖3所示.綜合考慮2種物質的電化學發光強度以及背景噪音和遷移時間的因素，采用NaH2PO4-Na2HPO4的濃度為50 mmol/L做為實驗條件.

a.化學發光強度曲線；b.遷移時間曲線；1.VMA;2.HVA.圖3　化學發光強度和遷移時間隨緩沖液濃度變化的曲線Fig.3　Curves of ECL intensity and tm along with the change of the buffer concentration

2.2.4分離電壓的選擇

在不同分離電壓US下，對VMA和HVA分別進行檢測，圖4為電化學發光強度和遷移時間tm隨分離電壓US的變化曲線.綜合考慮被測組分的分離度、基線噪音、分析時間等因素，選擇了16 kV作為分離電壓.

a.化學發光強度曲線；b.遷移時間曲線；1.VMA;2.HVA.圖4　化學發光強度與遷移時間隨Us變化的曲線Fig.4　 Curves of ECL intensity and tm along with the change of Us

2.2.5檢測電勢的選擇

在不同檢測電勢Ed下，對VMA和HVA分別進行檢測，得到檢測電勢與電化學發光強度關系如圖5所示.由圖5可看出，VMA和HVA的電化學發光強度隨檢測電勢的增大而增強，但噪音信號也隨之呈上升趨勢，導致基流不穩，為保證檢測的靈敏度與較好的信噪比，故選擇1.2 V作為檢測電勢.

2.2.6Ru(bpy)32+的濃度的選擇

在不同濃度的Ru(bpy)32+的磷酸鹽緩沖溶液中，分別檢測2種物質，得到VMA和HVA的發光強度隨緩沖液中Ru(bpy)32+的濃度變化規律如圖6所示.綜合考慮2組分的分離度和基線噪音等因素，故選擇5.0 mmol/L作為Ru(bpy)32+檢測分離組分的最佳濃度.

圖5　化學發光強度隨電勢Ed變化的曲線圖6　化學發光強度隨Ru(bpy)32+濃度變化的曲線Fig.5　Curves of ECL intensity of along withFig.6　Curves of ECL intensity of along with the the change of Ed change of Ru(bpy)32+ concentration

本實驗確定了分離檢測VMA和HVA的最佳條件為50 mmol/L pH 8.2的磷酸鹽緩沖溶液、初始電位為1.2 V、16 kV下電遷移進樣10 s、發光劑Ru(bpy)32+的濃度為5.0 mmol/L.在最優條件下，通過電化學發光來檢測濃度均是1.0×10-5mol/L 的2待測物的標準混合液，電化學發光強度隨遷移時間變化的譜圖如7所示，可以看出，VMA和HVA已經有效分離.

圖7　VMA與HVA混合標準溶液的電泳Fig.7　Electropherogram of the standard mixture solution of VMA and HVA

2.3重現性、線性范圍及檢測限

配一系列2組分的混合標準液(濃度范圍1.0×10-6～1.0×10-3mol/L)，在上述最優條件下，測定待測物的電化學發光強度I與濃度的關系，考察了各組分的線性范圍，得出2組分的線性回歸方程，并以信噪比為3時得到檢測下限，結果如表1.

在最優條件下，連續檢測6次濃度均是1.0×10-5mol/L的2組分的混合標準溶液，得到峰高的相對標準偏差(RSD)為2.7%(VMA)和3.1%(HVA)，以及遷移時間的RSD為1.1%(VMA)和0.9%(HVA).

表1　VMA與HVA的線性范圍和檢測下限Tab.1　Linear ranges and the LOD of VMA and HVA

2.4樣品的檢測及回收率實驗

準確取10 mL成人尿液標準樣品，將濃度均為1.0×10-5mol/L的VMA與HVA的標準混合液用尿液標準樣品稀釋10倍，得到樣品混合液.在以上優化條件下對樣品混合液進行檢測，得到電化學發光強度譜圖如下，2待測物在10 min內被有效地分離與檢測.

圖8　尿樣中VMA與HVA的電泳譜Fig.8　Electropherogram of VMA and HVA in urine

在最佳條件下的回收率實驗采用標準加入法，結果如表2，VMA和HVA的加標回收率分別為98%和99%，上述結果表明，本方法簡單快速，靈敏度很高，給尿液中的2物質的分離與檢測提供了一種可靠易行的方法.

表2　加標回收率的結果 (n=5)Tab.2　Results of recovery (n=5)

3　結論

采用毛細管電泳電化學發光檢測法分離并檢測了尿液中的VMA和HVA，得到最佳檢測條件.在此條件下，VMA與HVA的濃度檢測限分別為5.0×10-7mol/L和6.1×10-7mol/L，其加標回收率分別為98%和99%，此方法設備簡單，快速易行，2被測物在10 min內有效地分離與檢測，且無干擾，結果準確可靠，筆者期望在以后的臨床醫學中能夠得到實際應用.

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(責任編輯：梁俊紅)

Determination of vanilla mandelic acid and homovanillic acid based on capillay electrophoresis combinated with electrochemiluminescence detection

YANG Yang，SUN Xuemei，LI Chuanlong

(Key Laboratory of Eco-chemical Engineering,Ministry of Education,College of Chemistry and Molecular Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China)

Vanilla mandelic acid(VMA) and homovanillic acid(HVA) in the urine were detected by capillary electrophoresis with electrochemiluminescence detection(CE-ECL).The following conditions were suitable for the determination of VMA and HVA:running buffer,50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4(pH=8.2);separation voltage,16 kV;detection potential,1.2 V(vs.saturated calomel electrode (SCE)).Under the optimum conditions of detection,satisfactory sensitivities (LOD of 5.0×10-7mol/L for VMA and 6.1×10-7mol/L for HVA at S/N=3) were obtained,the correlation coefficients of the method were 0.999 3 and 0.997 9,respectively.The determination of these metabolites in human urine was completed within 10 min without any interferences,the recoveries were VMA 98% and HVA 99%,the result obtained is satisfactory.

capillary electrophoresis;electrochemiluminescence detection;vanilla mandelic acid;homovanillic acid

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.03.007

2015-08-23

山東省自然科學基金資助項目(ZR2009BM029)

楊洋(1990—)，女，河北滄州人，青島科技大學在讀碩士研究生.E-mail：1193428612@qq.com

孫雪梅(1967—)，女，山東青島人，青島科技大學副教授，主要從事毛細管電泳研究.E-mail：2634702755@qq.com

O657.8

A

1000-1565(2016)03-0257-07