煙草染色體片段代換系的構建與遺傳評價

童治軍 焦芳嬋 方敦煌 陳學軍 吳興富 曾建敏 謝 賀 張誼寒肖炳光

云南省煙草農業科學研究院 / 煙草行業煙草生物技術育種重點實驗室 / 國家煙草基因工程研究中心, 云南昆明 650021

煙草染色體片段代換系的構建與遺傳評價

童治軍 焦芳嬋 方敦煌 陳學軍 吳興富 曾建敏 謝 賀 張誼寒肖炳光*

云南省煙草農業科學研究院 / 煙草行業煙草生物技術育種重點實驗室 / 國家煙草基因工程研究中心, 云南昆明 650021

以綜合性狀優良的烤煙種質 Y3為輪回親本, 抗煙草黑脛病(0號和 1號生理小種)和赤星病的雪茄煙種質Beinhart 1000-1及優質烤煙品種K326為供體親本, 連續回交并結合分子標記輔助選擇, 構建國內外第一套由256個具有烤煙Y3遺傳背景并漸滲有Beinhart 1000-1和K326染色體片段株系代換系群體。該群體攜帶377個代換片段, 分布于煙草24條連鎖群上。每個株系攜帶1~5個代換片段, 代換片段長度介于0.05~36.88 cM, 平均長度7.75 cM。代換片段重疊累加總長度為2922.57 cM, 是煙草基因組總長度的2.61倍。代換片段覆蓋總長度為1114.32 cM, 煙草基因組覆蓋率為99.45%。本研究構建的片段代換系可用于煙草基因定位、復雜性狀的QTL分析和標記輔助選擇育種。

煙草(Nicotiana tabacum L.); 染色體片段代換系; SSR; 分子標記輔助選擇

煙草是我國重要的經濟作物之一, 其品種的選育雖取得了一定成績, 但與 K326等國外引進的優良品種相比仍有一定差距, 無法完全滿足國內煙葉生產對品種的需求[1]。煙草的產量、品質和抗性等重要育種目標性狀絕大部分為多基因控制的數量性狀, 遺傳方式復雜, 受多基因位點和環境的共同影響, 且數量性狀位點(QTL)的鑒定難度較大[2-6]。利用傳統的分離群體, 因為數量性狀本身的復雜性, 及分離群體遺傳背景的復雜性, 很難取得QTL定位的滿意結果。染色體片段代換系(chromosome segment substitution lines, CSSL)是在受體的遺傳背景中代換入某個或某些供體親本的染色體片段, 并利用回交和分子標記輔助選擇(MAS)技術建立的覆蓋作物整個基因組的一系列近等基因系[7-9]。與分離群體相比,其遺傳背景簡單、群體遺傳穩定、QTL定位及遺傳效應分析準確, 在番茄[10-12]、油菜[13]、萵苣[14]、大麥[15]、小麥[16]、棉花[17]、黃瓜[18-20]、水稻[21-23]等作物中得到了廣泛應用, 同時, 也是QTL的精確定位、挖掘和利用新基因資源、實現分子標記技術和作物育種鏈接的理想材料[24]。

迄今, 國內外煙草染色體片段代換系的相關研究尚未見報道。雖然煙草基因組測序為構建高密度煙草分子標記遺傳圖譜奠定了基礎[25-28], 但因其遺傳基礎狹窄, 栽培品種間多態性低[29-33], QTL定位等基礎研究相對落后; 目前僅有的少數QTL定位[2-6,34]主要基于初級定位群體, 其結果無法直接應用于育種研究。鑒于此, 本研究利用優質烤煙品種 K326和抗煙草黑脛病(0號和1號生理小種)、赤星病的雪茄煙種質Beinhart 1000-1為供體親本, 優良烤煙品種Y3為受體親本, 經多代回交、自交, 并結合SSR標記輔助選擇構建一套煙草染色體片段代換系, 對K326和Beinhart 1000-1中優良品質和抗病的QTL (基因)定位和轉育、烤煙品種改良及促進煙草分子育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的三份煙草材料均由云南省煙草農業科學研究院提供(表1)。受體親本Y3是從津巴布韋引進的烤煙種質資源, 該資源生育期適中、株型優良、節距較大、葉數多且寬、鮮煙葉柔軟, 但葉片較薄、香氣質中等、香氣量欠足且易感煙草黑脛病和葉斑病害(如赤星病等)。供體親本K326香氣質好、香氣量足、燃燒性強, 是目前世界上種植區域最廣、種植面積較大的烤煙品種; 供體親本 Beinhart 1000-1是葉片肥厚且抗煙草黑脛病0、1號生理小種和煙草赤星病的雪茄煙種質。

表1 用于構建染色體片段代換系的親本來源及類型Table1 Origin and type of parents used for development of CSSLs

1.2 染色體片段代換系的構建

如圖1所示, 2013年在云南省煙草農業科學研究院研和試驗基地(云南省玉溪市)溫室, 以烤煙種質Y3為受體親本, 與烤煙品種K326和雪茄煙種質Beinhart 1000-1分別雜交獲得F1, 再以Y3為輪回親本回交, 獲得2個分別含 300個單株的回交一代群體。從2014年1月(BC2F1)開始對導入的供體片段篩選。即在前期已構建的兩張煙草遺傳圖譜的24個連鎖群上每10~20 cM選取一個標記, 共計100個SSR標記(表2), 對2個群體中的各單株分別進行代換片段的追蹤和檢測。僅含有 1個代換片段的單株直接自交純化建立單片段代換系, 而含有多個供體染色體片段( >5個片段)的單株繼續回交并結合MAS進行前景和背景篩選。2014年6月, 將從BC2F1挑選出的240個株系(每個群體120個株系)播種組成1200 株BC3F1群體。2014年12月, 從1200個BC3F1株系中篩選出 240個株系并種植成 1200株 BC4F1群體。2015年3月, 利用已構建的2張煙草圖譜中共有的416個SSR標記對1200株BC4F1單株進行代換片段的追蹤和檢測。至2015年12月, 篩選獲得256個含有1~5個供體片段的煙草染色體片段代換系并分別自交得到BC4F2群體。2016年2月, 再利用416個標記對2560個BC4F2單株(每個株系隨機選10株)進行供體片段的追蹤和檢測, 直至篩選獲得穩定、純合的煙草染色體(單)片段代換系。

1.3 基因組DNA的提取及代換系基因型的分析

取煙草幼嫩葉片, 提取基因組 DNA參考Maguire等[35]的方法略作修改。參照Tong等[2-3,28]的SSR標記分析及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法。為了構建煙草染色體片段代換系, 前期利用公共數據庫 NCBI上公開的普通煙草基因組序列數據[Nicotiana tabacum (K326), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/wgs/?val=AWOJ01]開發了 13 645對煙草SSR標記[27-28]; 并以K326、Beinhart 1000-1為供體親本與受體親本Y3組配的BC1F1為作圖群體,構建了2張分別包含626個和562個標記位點的SSR標記遺傳圖譜(數據尚未公開), 2張圖譜中共有SSR標記416個, 且較均勻分布于24個連鎖群上(表2)。

圖1 煙草CSSLs群體構建程序Fig.1 Procedure for developing CSSLs in tobacco

1.4 代換系的評價

根據已構建的煙草遺傳圖譜上SSR標記間的遺傳距離來估算染色體片段長度, 若標記的相鄰基因型相同, 則忽略相鄰標記區間的雙交換事件, 兩標記間的區段為相同的標記基因型; 若標記的相鄰基因型不同, 則無多態性的標記與有多態性標記的中點為染色體代換片段的末端, 即認為這 2個標記基因型分別組成這個區間的1/2, 代換片段的長度按已構建的遺傳圖譜中的遺傳距離來計算[36]。

利用MapChat 2.20軟件構建全基因組的圖示基因型, 直觀顯示代換片段的位置和大小, 并分別累計來自供體親本Beinhart 1000-1和K326的染色體片段總長度, 計算其占受體基因組的比例。

2 結果與分析

2.1 SSR標記的選擇

以已構建的 2張遺傳圖譜為基礎, 每隔 10~20 cM左右選擇1個SSR標記, 共選擇了100個SSR標記, 在 BC2F1和 BC3F1世代中進行供體片段的追蹤和檢測。其中, 第5、第14、第17和第18連鎖群上標記最少, 有3個標記。第2、第13、第19和第22連鎖群上標記最多, 有11個標記。SSR標記間最小距離為0.76 cM, 最大距離為41.03 cM, 平均距離為11.89 cM。從BC4F1開始, 利用兩張圖譜中共有的416個標記進行代換片段的檢測與篩選。其中, 第 5連鎖群上標記最少, 有7個標記; 第2連鎖群上標記最多, 有35個標記。SSR標記間最小距離為0.05 cM, 最大距離為36.88 cM, 平均距離為7.75 cM。

2.2 代換片段的遺傳評價

通過3個世代(BC2F1、BC3F1和BC4F1)的分子標記輔助選擇, 篩選出由 256個單株組成的一套分別含有烤煙K326和雪茄煙Beinhart 1000-1導入片段的烤煙染色體片段代換系(圖2)。其中, 含有 K326片段的代換系有 131個株系, 含有 Beinhart 1000-1片段的代換系有 125個株系。在篩選出的 256份BC4F1單株中, 單片段代換單株有31個, 2~4片段代換單株有183個, 5片段代換單株有42個。其中, 具有烤煙 K326片段的代換系中, 單片段代換單株有17個, 2~4片段代換單株有95個, 5片段代換單株有19個; 具有雪茄煙Beinhart 1000-1片段的代換系中,單片段代換單株有14個, 2~4片段代換單株有88個, 5片段代換單株有23個。

從表3和圖2可看出, 煙草基因組導入的377個代換片段總長度為2922.57 cM, 長度范圍為0.05~ 36.88 cM, 平均長度為7.75 cM, 最長的代換片段位于第13連鎖群上, 最短的代換片段位于第20連鎖群上的中下部。其中, 第4連鎖群代換片段的總長最大, 為223.53 cM; 第16連鎖群代換片段的總長最小, 為50.38 cM。具有烤煙K326片段的代換系中導入的215個代換片段總長度為1578.91 cM, 長度范圍為0.05~25.69 cM, 平均長度為7.34 cM。具有雪茄煙Beinhart 1000-1片段的代換系中導入的162個代換片段總長度為1343.66 cM, 長度范圍為0.06~36.88 cM,平均長度為8.29 cM。

377個代換片段在煙草24條連鎖群上的分布不等, 各連鎖群平均導入15~16個片段。其中, 第2連鎖群的代換片段數最多, 為35個, 其次是第1連鎖群的29個片段; 第16號連鎖群代換片段數目最少, 為5個。215個具有烤煙K326片段的代換系中, 第2連鎖群的代換片段數最多, 為21個, 其次是第1連鎖群的16個片段; 第16連鎖群代換片段數目最少, 為 2個。162個具有雪茄煙 Beinhart 1000-1片段的代換系中, 同樣是第 2連鎖群的代換片段數最多, 為14個, 其次是第1連鎖群的13個片段; 第16連鎖群代換片段數目最少, 僅有2個。

代換片段在煙草基因組 24條連鎖群上覆蓋了1114.32 cM 的距離, 覆蓋率為 99.45% (1114.32/ 1120.45)。各連鎖群覆蓋率雖有不同, 但均在87.5%以上。其中, 有21條連鎖群上的代換片段重疊后覆蓋率為100%, 而3個第8、第9和第19連鎖群上分別存在12.49% (4.60 cM)、1.77% (1.00 cM)和1.94% (0.53 cM)的區域未被覆蓋(表3)。具有烤煙K326片段的代換系中, 導入的供體片段覆蓋煙草基因組長度為1048.28 cM, 覆蓋率為93.56%。其中, 有11條連鎖群上的代換片段重疊后覆蓋率達 100.00%, 剩余的 13條連鎖群中的覆蓋率范圍為 64.65%~ 99.34%。具有雪茄煙Beinhart 1000-1片段的代換系中, 代換片段覆蓋煙草基因組長度為989.20 cM, 覆蓋率為 88.29%。其中, 代換片段重疊后覆蓋第 1、第21和第24連鎖群100%, 未能達到全覆蓋的21條連鎖群上代換片段覆蓋率范圍為 59.52%~98.48%(表3)。

表2 受體與供體親本間的煙草SSR標記多態性Table2 Polymorphism between the recipient and donors detected by tobacco SSR markers

(圖2 )

圖2 256份代換系的代換片段在煙草基因組上的位置Fig.2 Genomic positions of the substituted segment in 256 CSSLs

3 討論

在染色體片段代換系構建過程中, 親本選擇十分重要, 一般要選擇遺傳背景差異較大的[7]。已有的研究中的親本的選擇主要分為兩類, 一類是選擇供體親本與受體親本間親緣關系較遠、遺傳背景差異較大且雙親(或其中之一)與生產應用品種間存在較大的性狀差異, 此類染色體代換系群體較為適用于遺傳學研究, 但不易用于育種實踐[10-12,14-15,18]。另一類則是供體與受體親本間親緣關系較近且雙親均為當前大面積推廣應用的主栽品種, 此類代換系群體雖可較容易選擇出具有優良代換系株系、并直接供育種實踐應用, 但雙親間因親緣關系較近而不易篩選獲得足夠量的分子標記, 從而影響代換系群體構建的質量[8-9,21-23]。本研究為獲得既有較高質量又易于烤煙育種實踐應用的煙草染色體片段代換系,在親本的選擇上兼顧了以下 3點。首先, 選擇的親本材料具較多優點, 沒有突出或致命的缺點, 且在主要育種性狀上優缺點能形成互補。受體親本(輪回親本) Y3是綜合性狀優良但香氣量欠足、易感煙草黑脛病和葉斑病害的烤煙種質, 供體親本則分別具有優良品質、高抗煙草黑脛病和赤星病。其次, 親本(或親本之一)是能適應當地生態條件且綜合性狀較好的推廣品種。本研究的 3個親本中, 受體親本Y3經引種試驗, 證明其在我國的西南地區(尤其云南)具有較強的適應性且綜合性狀優良。供體親本K326是目前世界上種植區域最廣、面積較大且深受我國卷煙企業喜好的烤煙品種。供體親本 Beinhart 1000-1具有較高的煙草黑脛病(0號和1號生理小種)和赤星病抗性。最后, 親本間的遺傳差異較大。本研究所選用的 3份親本材料的生態類型差異較大,親緣關系相對較遠。從地域上看, 親本 K326和Beinhart 1000-1來源于美國, 親本Y3來源于津巴布韋。從煙草類型上看, 親本Y3和K326屬于烤煙, 而親本Beinhart 1000-1屬于雪茄煙(表1)。因此, 親本間的多態率及共顯性多態標記數目均較其他烤煙品種間高(表2)。

由于 CSSLs與其輪回親本(受體)間只存在代換片段的差異, 而遺傳背景與受體親本一致, 可將復雜性狀分解為單個孟德爾因子, 對代換區段中的QTL分析時遺傳背景干擾小, 因而受到研究者的重視[22,24]。Eshed和Zamir等[10]最早建立了以栽培番茄為遺傳背景、含有野生番茄單片段的代換系群體,該群體含有50個單片段代換系, 可以覆蓋野生番茄的全基因組。張桂權等[37]利用優良水稻品種華粳秈74為受體, 以來源于世界各地的26個品種(包括14個秈稻和 12個粳稻)為供體, 通過回交和分子標記輔助選擇方法建立了目前世界上規模最大、質量最好的水稻單片段代換系文庫。該文庫共有1529個染色體單片段代換系(CSSSL), 代換片段的平均長度為18.8 cM, 代換片段總長度達28 700 cM, 相當于約18.8倍的水稻基因組長度。通過對代換片段的基因鑒定和定位, 篩選獲得了包括植株形態、稻米品質、產量、抗病性、生育期等重要性狀共2000多個優良基因(QTL)。本研究已獲得了以烤煙Y3為遺傳背景的256個含有1~5個供體片段的煙草染色體片段代換系。其中, 含有K326片段的代換系有131個株系, 含有Beinhart 1000-1片段的代換系有125個株系。獲得的代換系中代換片段重疊后總長度為2922.57 cM, 相當于烤煙全基因組總長的2.61倍(本研究中以Y3和K326為作圖親本構建的烤煙SSR標記遺傳圖譜全長為1120.45 cM), 代換片段覆蓋煙草基因組的長度為 1114.32 cM, 總覆蓋率高達99.45%。因此, 與其他作物相關研究比較, 本研究構建的煙草CSSLs質量總體上還不高, CSSL所包含株系的數量、受體攜帶代換片段的數目、代換片段的大小(長度)及代換片段在基因組的覆蓋率等方面均不能完全滿足煙草育種的要求。究其原因, 可能是: (1)煙草育種過程中, 過度依賴極少數的主體親本而使得許多非育種目標的多樣化性狀丟失, 導致煙草(尤其是烤煙)品種間的親緣關系較近、遺傳基礎狹窄、遺傳多樣性降低。(2)煙草基礎研究相對薄弱。雖然近些年隨著煙草基因組計劃的開展, 基礎研究在分子水平有了質的提升, 但起步較晚, 與其他作物仍有相當大差距?；诖? 導致煙草CSSL在構建過程中既受材料(親本)的限制又受手段(研究基礎)的制約。目前, 本研究獲得的代換系盡管不是覆蓋煙草全基因組的單片段代換系, 但正在對BC4F1繼續進行代換片段的追蹤和檢測, 直至獲得一整套覆蓋煙草全基因組的CSSSLs, 為復雜性狀QTL分析及有效轉育供體親本 K326和 Beinhart 1000-1中優質和抗病性狀的QTL/基因到其他烤煙品種提供理想材料。

4 結論

以綜合性狀優良的烤煙種質 Y3為輪回親本,以抗黑脛病 0號、1號生理小種和抗赤星病的Beinhart 1000-1及優質品種K326為供體親本, 經雜交、回交、自交, 結合分子標記輔助選擇建立了國內外首套煙草染色體片段代換系群體。該群體由256個不同代換系株系組成, 且每個代換系株系中僅含有 1~5個代換片段。通過對 Y3遺傳背景中的Beinhart 1000-1和K326染色體導入片段的分析, 篩選染色體單片段代換系, 為復雜性狀QTL分析、分子標記輔助選擇育種等研究提供材料。

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Construction and Genetic Evaluation of Chromosome Segment Substitution Lines in Tobacco (Nicotiana tabacum L.)

TONG Zhi-Jun, JIAO Fang-Chan, FANG Dun-Huang, CHEN Xue-Jun, WU Xing-Fu, ZENG Jian-Min, XIE He, ZHANG Yi-Han, and XIAO Bing-Guang*
Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding / National Tobacco Genetic Engineering Research Center, Kunming 650021, China

A set of chromosome segment substitution lines (CSSLs) of tobacco (Nicotiana tabacum L.) were first developed by molecular marker assisted selection (MAS) and successive backcrossing with Y3, the flue-cured tobacco germplasm with comprehensive traits as the recipient parent, and two common tobacco cultivars Beinhart1000-1 and K326 as the donor parents.The cigar tobacco cultivar Beinhart 1000-1 carries a variety of resistance traits including black shank (race 0 and race 1) and brown spot resistance, while the flue-cured tobacco K326 is a commercial cultivar with high quality.In 256 CSSLs, a total of 377 substituted segments derived from donor Beinhart 1000-1 and K326 with genetic background of Y3 distributed on 24 linkage groups.Each CSSL contained only 1–5 substituted segments and the length of substituted segments ranged from 0.05 to 36.88 cM with an average of 7.75 cM.The total length of the overlapped substituted segments was 2922.57 cM, which was 2.61 times of the whole tobacco genome length.And the CSSLs covered length was 1114.32 cM, with a covered ratio of 99.45% in the recurrent tobacco genome.The CSSLs constructed in this study are excellent genetic materials for gene mapping, QTL analysis of complicated traits, and developing varieties by marker assisted selection in Nicotiana tabacum L.

Tobacco (Nicotiana tabacum L.); Chromosome segment substitution lines (CSSLs); SSR; Molecular marker assisted selection (MAS)

10.3724/SP.J.1006.2016.01609

本項目由中國煙草總公司項目[2014TBB01,110201301006(JY-06)]和中國煙草總公司云南省公司項目(2014YN18, 2013YN01)資助。

This study was supported by China National Tobacco Company [2014TBB01, 110201301006(JY-06)] and Yunnan Tobacco Company (2014YN18, 2013YN01).

*通訊作者(Corresponding author): 肖炳光, E-mail: xiaobg@263.net

聯系方式: E-mail: tzj861@163.com

稿日期): 2016-03-09; Accepted(接受日期): 2016-07-11; Published online(

日期): 2016-07-28.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160728.0816.010.html