大鼠腦干星形膠質細胞在應激性胃黏膜損傷中的作用*

秦雪，劉真，王璟，仝令印，孫海基

（山東師范大學生命科學學院生理學教研室，濟南250014）

1 引 言

束縛—浸水應激（restraint water-immersion stress，RWIS）作為一種復合應激模型對軀體和心理方面有較大的刺激強度。該模型可在短時間內使大鼠情緒暴躁、體溫下降并導致胃腸機能發生紊亂，如產生急性胃黏膜損傷[1]。許多研究證明，腦內多個核團和區域參與胃機能的調節。其中，位于延髓的DMV、NTS作為迷走復合體的組成部分，是調控胃機能的副交感初級中樞。

應激條件下，Fos蛋白的表達一般被認為是神經元激活的標志，本實驗室的前期研究發現，RWIS不同時段，大鼠NTS、DMV等部位的Fos表達發生了不同程度的變化[2]，說明其參與了束縛—浸水應激反應。腦和脊髓中存在大量星形膠質細胞，其中膠質纖維酸性蛋白（GFAP）是其重要組成成分[3]，而引起星形膠質細胞發生反應的標志就是GFAP表達的增強。在一側脛腓骨骨折的即刻應激反應模型中，延髓內臟帶、中縫大核等有明顯的GFAP陽性表達，并且與Fos蛋白的分布基本一致[4]。但對于星形膠質細胞是否參與RWIS的研究還未曾報道。已有研究表明，在應激條件下，星形膠質細胞在形態和功能方面的可塑性對調節神經元活動起到重要的作用。段麗等人[5]的研究表明，視上核（SON）內神經元是通過星形膠質細胞的活動狀態對高滲刺激作出反應。如果神經元和星形膠質細胞都參與RWIS，那兩者之間的關系是相互促進還是相互抑制目前尚不清楚。L-AA是一種谷氨酸類似物，它可抑制星形膠質細胞的表達，但不直接抑制神經元的表達。有研究表明，向脊髓鞘內注射L-AA后，可抑制星形膠質細胞在脊髓背角的表達；而且神經元的表達也明顯減少。此外，大鼠經L-AA預先處理，可顯著抑制高滲刺激下視上核星形膠質細胞的表達，對神經元Fos蛋白的表達也起到了抑制作用[6]。那么，L-AA預先處理的大鼠，在RWIS條件下，是否會影響NTS和DMV核團內神經元Fos的表達目前尚未有研究。

2 材料和方法

2.1 實驗材料與試劑

實驗動物是體重分別為220～250 g和250～300 g雄性Wistar大鼠，購于山東大學動物實驗中心。兔c-Fos由美國Santa Cruz公司提供；兔抗GFAP由北京博奧森生物技術有限公司提供，兩者均由PBS、10%Triton X-100和10%NGS稀釋；正常山羊血清；SP系列試劑盒購于中杉金橋公司；L-α-aminoadipate，L-AA購于Aladdin試劑有限公司，由生理鹽水稀釋。

2.2 動物分組與模型制備

（1）將36只體重為220～250 g雄性 Wistar大鼠隨機分為對照組和實驗組，實驗組又分為束縛浸水應激 0.5、1、2、3、5 h五個亞組，每組各 6只，正式實驗前24 h饑餓處理。應激組大鼠經乙醚輕度麻醉后，背向木板固定四肢，10min后將其豎直放于冷水（21±1℃）中，水位達胸骨劍突處。對照組不進行束縛—浸水處理。（2）將12只體重為250～300 g大鼠隨機分為生理鹽水對照組和L-AA組各6只，按大鼠體重，以5 ml／kg的4%水合氯醛麻醉大鼠，側腦室定位（前囟后0.96 mm，旁開1.8 mm，硬腦膜下3.5mm）埋管，手術后連續兩天注射青霉素消炎，恢復三天，正式實驗前24 h禁食。大鼠經乙醚輕度麻醉后，背向木板固定四肢，微量注射器側腦室注射10μl生理鹽水或者L-AA。10 min后將其豎直放于冷水（21±1℃）中1 h，水位達胸骨劍突處。為避免晝夜節律影響應激反應，所有束縛—浸水處理過程均在上午7時至12時進行。

2.3 胃黏膜損傷的評估

RWIS結束后，腹腔注射過量4%水合氯醛，將胃從腹腔取出后用4%多聚甲醛溶液固定40 min。將胃沿胃大彎剪開沖洗干凈，解剖鏡下（10×）觀察胃黏膜損傷程度。胃黏膜損傷程度用Guth計數法計算后采用損傷指數（EI）表示。

2.4 組織準備

大鼠取出胃后，依次用0.01mol／l的PBS，pH＝7.4和4℃的多聚甲醛，pH＝7.4經心臟全身灌流固定、取腦，置于多聚甲醛中4℃冰箱后固定4 h，隨后放入30%的蔗糖溶液中脫水過夜。腦沉底后用冰凍切片機對延髓進行片厚20μm的冠狀切片，將切好的腦片放在 PBS（0.01 mol／l）中備用。

2.5 免疫組織化學染色

將兩套相同切片漂洗后加入30%的過氧化氫／甲醇溶液，室溫孵育30 min，消除內源性酶的活性；含10%正常羊血清和10%TritonX-1000的PBS 0.01mol／l pH＝7.4，室溫孵育 30 min；加入兔抗 GFAP抗體（1：500）或兔抗 c-fos抗體（1：600），4℃孵育24 h；再依次加入生物素標記山羊抗兔IgG和辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫下各孵育2 h；DAB顯色液避光顯色5 min；各步驟之間均用PBS漂洗，將腦片貼在明膠處理的載玻片上，脫水、透明、中性樹膠封片。

2.6 顯微拍照計數及統計學分析

借助顯微鏡觀察DMV和NTS中GFAP或者Fos-IR神經元表達情況；其吻端、中端和尾端GFAP或者 Fos-IR神經元的個數（個數／0.01 mm2）用Image pro-Plus 6.0圖象分析軟件統計。均數采用均數±標準誤表示，數據處理用SPSS 13.0統計軟件，用雙尾獨立性樣本t-檢驗比較組間均數，用單因素方差分析和S-N-K多重比較進行吻端、中端、尾端間的均數比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 束縛-浸水應激不同時間段對胃黏膜損傷和GFAP表達的影響

3.1.1 胃潰瘍指數統計 與對照組相比，胃潰瘍指數在應激組各時段均有極顯著差異，P＜0.01，見圖1。隨著應激時間延長，胃潰瘍指數顯著升高，胃黏膜損傷由對照組的光滑完整變為出現點狀血斑，甚至出現條狀血斑，見圖2。

圖1 對照組和應激組各時段胃潰瘍指數的比較（*P＜0.05，**P＜0.01）Fig 1 The gastric ulcer index of the unstressed and stressed 0.5，1，2，3，5h rats（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖2 RW IS不同時間段對胃黏膜損傷的比較A：對照組；B：RWIS 0.5小時組；C：RWIS 1小時組；D：RWIS 2小時組；E：RWIS 3小時組；F：RWIS 5小時組。Fig 2 Gastric mucosa of the unstressed and stressed ratsA：Unstressed group；B：RWIS 0.5h group；C：RWIS 1h group；D：RWIS 2h group；E：RWIS 3h group；F：RWIS 5h group.

3.1.2 NTS和DMV不同區段GFAP的表達 免疫組化結果顯示，相比對照組，應激組各時段NTS和DMV不同區段GFAP表達增加，細胞突起增多。見圖3。GFAP分布在NTS和DMV的吻-尾全段，應激1 h時，NTS和DMV三個區段的GFAP表達均達到高峰，之后GFAP表達有所下降，但與對照組相比仍有顯著差異，見圖4、圖5、圖6。

圖3 對照組和應激 0.5、1、2、3、5h組 NTS和 DMV不同區段GFAP的表達各應激組與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 A：NTS不同區段GFAP表達；B：DMV不同區段GFAP表達。Fig 3 GFAP expression in different sections of the DMV and NTS in the unstressed and stressed 0.5，1，2，3，5h RatsEach stress group compared with control group，*P＜0.05，**P＜0.01 A：GFAP expression in different sections of the NTS；B：GFAP expression in different sections of the DMV

3.2 星形膠質細胞抑制劑L-AA對胃黏膜損傷和GFAP及Fos表達的影響

3.2.1 給藥處理胃潰瘍指數統計應激1 h，與生理鹽水對照組相比，注射L-AA組胃潰瘍指數降低，P＜0.05，見圖7。生理鹽水對照組胃黏膜損傷程度較為嚴重，出現條索狀血斑。而注射L-AA組，胃黏膜表面只有少數潰瘍斑點，損傷較輕，見圖8。

圖4 對照組和RW IS不同時段組GFAP在大鼠NTS、DMV吻端的表達（×200）A：對照組；B：RWIS 0.5小時組；C：RWIS 1小時組；D：RWIS 2小時組；E：RWIS 3小時組；F：RWIS 5小時組。Fig.4 GFAP expression in the rostral portion of the NTS and DMV in the unstressed and stressed 0.5，1，2，3，5h rats（×200）A：Unstressed group；B：RWIS 0.5h group；C：RWIS 1h group；D：RWIS 2h group；E：RWIS 3h group；F：RWIS 5h group.

圖5 對照組和RW IS不同時段組GFAP在大鼠NTS、DMV中端的表達（×200）A：對照組；B：RWIS 0.5小時組；C：RWIS 1小時組；D：RWIS 2小時組；E：RWIS 3小時組；F：RWIS 5小時組。Fig 5 GFAP expression in the intermediate portion of the NTS and DMV in the unstressed and stressed 0.5，1，2，3，5h rats（×200）A：Unstressed group；B：RWIS 0.5h group；C：RWIS 1h group；D：RWIS 2h group；E：RWIS 3h group；F：RWIS 5h group

3.2.2 給藥處理GFAP和Fos在NTS和DMV不同區段的表達免疫組化結果顯示，相比生理鹽水對照組，使用L-AA抑制劑后，GFAP在NTS和DMV各個區段的表達明顯減少，同時神經元標記物Fos表達也顯著減少，說明L-AA可以抑制星形膠質細胞，見圖9、圖 10、圖11。

圖6 對照組和RW IS不同時段組GFAP在大鼠 NTS、DMV尾端的表達（×200）A：對照組；B：RWIS 0.5小時組；C：RWIS 1小時組；D：RWIS 2小時組；E：RWIS 3小時組；F：RWIS 5小時組。Fig 6 GFAP expression in the caudal portion of the NTS and DMV in the unstressed and stressed 0.5，1，2，3，5h rats（×200）A：Unstressed group；B：RWIS 0.5h group；C：RWIS 1h group；D：RWIS 2h group；E：RWIS 3h group；F：RWIS 5h group

圖7 生理鹽水對照組和注射L-AA組對胃潰瘍指數的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）Fig 7 The gastric ulcer index of the saline and L-AA rats（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖8 生理鹽水組、L-AA組大鼠胃粘膜A：生理鹽水組；B：L-AA組。Fig 8 Gastric mucosa of the saline and L-AA ratsA：saline group；B：L-AA group

圖9 生理鹽水對照組和L-AA給藥處理NTS和DMV不同區段GFAP和Fos的表達給藥組與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 A：NTS區段GFAP表達；B：DMV區段GFAP表達；C：NTS區段Fos表達；D：DMV區段Fos表達。Fig 9 GFAP and Fos expression in different sections of the DMV and NTS of the saline and L-AA rats.L-AA group compared with saline group，*P＜0.05，**P＜0.01 A：GFAP expression in the NTS；B：GFAP expression in the DMV；C：Fos expression in the NTS；D：Fos expression in the DMV

圖10 生理鹽水組和L-AA組大鼠NTS、DMV不同區段Fos表達（×100）A：生理鹽水組；B：L-AA組；a：吻端；b：中端；c：尾端。Fig 10 Fos expression in different sections of the NTS and DMV in the saline and L-AA rats（×100）A：saline group；B：L-AA group；a：rostral；b：intermediate；c：caudal

圖11 生理鹽水組和L-AA組大鼠NTS、DMV不同區段GFAP的表達（×200）A：生理鹽水組；B：L-AA組；a：吻端；b：中端；c：尾端。Fig 11 GFAP expression in the different sections of the NTS and DMV in the saline and L-AA rats（×200）A：saline group；B：L-AA group；a：rostral；b：intermediate；c：caudal.

4 討論

NTS和DMV是迷走復合體的組成部分，是調控胃機能的低級中樞[7]。對大鼠進行RWIS后，來自胃腸道的感覺信息經迷走傳入神經傳導至孤束核，傳入纖維的終末通過NTS內的神經元終末進入腦干[8-9]。這些傳入信號經NTS整合后，主要利用谷氨酸、GABA或者去甲腎上腺素（NE）作為神經遞質傳遞到相鄰的DMV，與DMV中支配胃腸的膽堿能神經元形成突觸聯系。DMV支配胃的膽堿能神經元釋放興奮性（乙酰膽堿）或者抑制性（非膽堿能NANC）遞質[10-12]。本實驗室張玉玉等人的研究表明，大鼠NTS、DMV中Fos蛋白在RWIS條件下明顯增加，表明大鼠NTS和DMV參與了RWIS。神經組織是由神經元和神經膠質細胞構成的。在神經膠質細胞中，星形膠質細胞是體積最大的膠質細胞，許多研究表明，星形膠質細胞在一些應激反應中起到重要的作用。膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein GFAP）本身是腦和脊髓中成熟星形膠質細胞的一個組成成分[13]，屬于中間絲蛋白，有研究指出，在受到急性刺激時，海馬、下丘腦、杏仁核和中腦導水管周圍灰質里星形膠質細胞會釋放神經遞質參與了急性應激反應[14]。我們研究發現，在RWIS 1h時，NTS和DMV中GFAP表達都達到高峰。1 h后GFAP表達減弱，但與對照組比仍有顯著差異。表明RWIS激活了NTS、DMV中的星形膠質細胞，參與了RWIS反應。

孤束核經矢狀切可分為吻端、中端和尾端三部分，吻端（前囟-12.96～-13.32 mm）、中端（前囟-13.80～-14.04 mm）和尾端（前囟-14.52～-14.76 mm），各段約占 NTS全長的1／3。本實驗研究結果顯示，GFAP分布在NTS吻-尾全段。與對照組相比，RWIS 1h，NTS中GFAP表達達到高峰，其中，吻端2.42±0.1（個／0.01 mm2）是對照組 1.39±0.03（個／0.01 mm2）的1.74倍；中端2.66±0.08（個／0.01mm2）是對照組 1.18±0.05（個／0.01 mm2）的2.25倍；尾端 2.68±0.08（個／0.01 mm2）是對照組 1.46±0.04（個／0.01mm2）的 1.83倍。可見，NTS三個區段相比，GFAP在尾段和中段表達較多，這可能是NTS三個區段的不同功能影響了GFAP的表達分布，迷走神經的大量內臟傳入主要與NTS尾段和中段相關，而吻段則主要負責接受味覺傳入。DMV經矢狀切也可分為吻端、中端和尾端三部分，位置與NTS大致一樣。GFAP分布在DMV吻-尾全段。與對照組相比，RWIS 1h，DMV中GFAP表達達到高峰，其中，吻端2.92±0.11（個／0.01 mm2）是對照組 1.67±0.1（個／0.01 mm2）的1.75倍；中端 2.31±0.13（個／0.01 mm2）是對照組0.93±0.07（個／0.01 mm2）的2.49倍；尾端4.31±0.09（個／0.01 mm2）是對照組2.43±0.12（個／0.01 mm2）的1.77倍。可見，在DMV的三個區段，中段GFAP表達最強烈。這可能與DMV中段的功能有關，DMV中段存在迷走節前神經元支配胃的不同部位，因此形成了一個特定的胃代表區[15]。GFAP在中段表達最強烈，這可能是由于支配胃的興奮性神經元主要分布于DMV中段及吻段內側區域[16-17]，而DMV尾段是支配胃的迷走抑制通路的起源處。

我們實驗室前期研究發現RWIS導致NTS和DMV中神經元的Fos表達明顯增加，表明NTS和DMV中神經元參與RWIS過程。本研究發現NTS和DMV中的星形膠質細胞也被激活，參與RWIS過程。那么NTS和DMV中星形膠質細胞對神經元激活是否存在著調節作用。高蓓等人的研究[6]指出，在急性腹腔高滲刺激模型中，向大鼠腹腔注射高濃度的鹽水，視上核中的神經元和星形膠質細胞均明顯增加。當星形膠質細胞被抑制劑抑制表達后，Fos陽性神經元在視上核中的表達顯著減少，證明視上核中神經元對刺激的反應是通過星形膠質細胞的活動狀態介導的。

L-AA是一種谷氨酸類似物，能夠特異性地抑制星形膠質細胞的GFAP表達，但對神經元活動影響較小。注射L-AA后明顯抑制了星形膠質細胞GFAP的表達，同時NTS和DMV中Fos表達均有極顯著減少。提示，星形膠質細胞參與調節RWIS狀態下的神經元激活。本研究中，L-AA處理組抑制星形膠質細胞表達后，能夠顯著抑制應激性胃潰瘍。其機制可能是在RWIS狀態下，NTS和DMV中星形膠質細胞，通過調控神經元的活性，而影響了胃機能的紊亂，導致應激性胃潰瘍的產生。綜上所述，在RWIS狀態下，星形膠質細胞可能通過調節神經元的激活，參與了束縛浸水應激，影響了胃腸機能，導致胃黏膜損傷。