產(chǎn)表面活性劑菌株（QS—M2）的篩選及其特性研究

張麗霞　張虹　卞立紅　任國(guó)領(lǐng)　孟令一　黃永紅

摘要：從大慶油田油水采出液中經(jīng)富集培養(yǎng)、劃線(xiàn)分離、溶血圈測(cè)定和苯酚硫酸檢測(cè)等方法篩選出一株產(chǎn)表面活性劑的菌株QS—M2，經(jīng)生理生化分析和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，確定菌株Qs·M2為銅綠假單胞菌，提取其代謝產(chǎn)物經(jīng)薄層層析和HPLc—Ms鑒定表明：主要的表面活性劑物質(zhì)是鼠李糖脂類(lèi)物質(zhì)，其中單鼠李糖脂的主要組分為RhaC₁₀、RhaC₁₂：C₁₂雙鼠李糖脂的主要組分為Rha2C₁₄CC₁₂、Rha2C₁₀C₁₂和Rha2C₁₀C₁₀，該菌株產(chǎn)生的鼠李糖脂可將上清液的界面張力由72.0mN/m降至36.9mN/m，且鼠李糖脂的乳化性能較好，在72 h內(nèi)乳化性能穩(wěn)定，結(jié)果表明，鼠李糖脂類(lèi)表面活性劑物質(zhì)是Qs-M2菌株在微生物提高原油采收率過(guò)程中發(fā)揮作用的主要因素，

關(guān)鍵詞：生物表面活性劑；菌株篩選；界面張力；乳化性能；鼠李糖脂

DoI：10.15938/j.jhust.2016.04.012

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ920.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-2683（2016）04-0065-05

0引言生物表面活性劑是由微生物產(chǎn)生的一類(lèi)嚴(yán)格集親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)于一體的具有表面活性的化學(xué)物質(zhì)與化學(xué)表面活性劑相比，生物表面活性劑除具有潤(rùn)濕、乳化、分散、洗滌、起泡、增溶等功能外，還具有低毒性、可降解性和環(huán)境友好性、高效性等性能，在石油、環(huán)境保護(hù)、食品和醫(yī)藥、化妝品、洗化用品等諸多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景大量研究已經(jīng)證明，利用微生物產(chǎn)生的生物表面活性劑能夠有效的提高原油采收率其主要作用機(jī)理是降低油水界面張力，乳化原油，形成水包油的乳化液，提高巖石的親水性能，然而，在一般的生產(chǎn)過(guò)程中，由于生物表面活性劑產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高、純化工藝復(fù)雜，所以目前生物表面活性劑沒(méi)有大規(guī)模的生產(chǎn)采用原油為唯一碳源篩選產(chǎn)生物表面活性劑的微生物菌株，經(jīng)過(guò)馴化得到高效產(chǎn)生物表面活性劑的菌株，不僅降低生產(chǎn)成本而且適應(yīng)油田環(huán)境，可以產(chǎn)生更好的驅(qū)油效果。

產(chǎn)生物表面活性劑的微生物主要是細(xì)菌和酵母菌，微生物代謝的目前最有效的生物表面活性劑是鼠李糖脂類(lèi)，其產(chǎn)生菌多為假單胞菌屬，假單胞菌屬產(chǎn)生的鼠李糖脂的親水基團(tuán)一般由1-2分子的鼠李糖構(gòu)成，疏水基團(tuán)則由1-2分子具有不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸構(gòu)成，在生物合成過(guò)程中，這些基團(tuán)之間可能相互鏈接而生成多種化學(xué)結(jié)構(gòu)相近的同系物，鼠李糖脂組分的鑒定是闡述鼠李糖脂采油性能的前提和基礎(chǔ)，而糖脂類(lèi)物質(zhì)的成分鑒定方法則從簡(jiǎn)易的利用鼠李糖脂水解后測(cè)定鼠李糖的色度逐漸發(fā)展為利用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振等分析樣品組成的復(fù)雜方法Mata-Sandoval等則利用高效液相色譜法分析得到了由銅綠假單胞菌UG2所產(chǎn)生的鼠李糖脂的主要組成為RhC₁₀Rh2C₁₀C₁₂H₂、RH₂C₁₀C₁₂和Rh₂C₁₀C₁₀，目前，高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用被認(rèn)為是目前對(duì)鼠李糖脂組分研究最精確的方法之一，

本研究從大慶油田油藏采出液中篩選出一株高產(chǎn)糖脂類(lèi)生物表面活性劑的菌株QS-M2，對(duì)QS-M2菌株進(jìn)行生理生化分析和分子生物學(xué)鑒定；利用薄層層析實(shí)驗(yàn)和HPLC，MS方法對(duì)提純的鼠李糖脂組分進(jìn)行了鑒定和表征；同時(shí)，通過(guò)對(duì)糖脂類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)量、界面張力、乳化性能等指標(biāo)的測(cè)定，分析了篩選菌株的采油潛力。

1.材料和方法

1.1樣品來(lái)源

樣品來(lái)自于大慶油田采油三廠(chǎng)油藏采出液，

1.2培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨1%，酵母粉0，5%，NaCI1%，pH 7.0.LB固體培養(yǎng)基（g/L）：LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加1.5%瓊脂粉，制成平板，石油液體培養(yǎng)基（g/L）：原油5%，NaCl0.21%，NH4cl0.07%，N%HPO₄12%，KH2PO₄0.07%，酵母粉0.6%，MgSOC₄0.5%，pH7.0，血平板培養(yǎng)基：購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3菌株的篩選和鑒定

1.3.1菌種富集、分離純化

菌種富集、分離純化參照文將100 mL石油液體培養(yǎng)基加入250 mL錐形瓶中，121℃滅菌20min，樣品接種量為3%，37°C150 rpm培養(yǎng)48 h至培養(yǎng)基渾濁，采用平板劃線(xiàn)法進(jìn)行菌種的分離純化，將所鑒定的純菌劃線(xiàn)至斜面，37℃培養(yǎng)1 d，4～C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2產(chǎn)糖脂類(lèi)菌株的篩選

1）產(chǎn)生物表面活性劑菌株的初篩，挑取單菌落接人5mL LB液體培養(yǎng)基，37°C150 rpm培養(yǎng)24h取1mL菌液4°C 12000 rpm離心除菌后，取上清10UL滴在血平板上，37°C培養(yǎng)24 h，觀察透明溶血圈的出現(xiàn)篩選產(chǎn)表面活性劑的菌種。

2）苯酚硫酸法篩選產(chǎn)糖脂類(lèi)菌株，發(fā)酵上清液加人0，5 mL 6%苯酚溶液，混勻，加入2，5 mL濃硫酸，混勻，沸水浴10 min，分光光度計(jì)490 nm處測(cè)定吸光度值，糖脂定性檢測(cè)中，在490 nm處吸光值顯著高于對(duì)照組，可確定為產(chǎn)糖脂菌種，

1.3.3產(chǎn)糖脂類(lèi)菌株的鑒定

1）菌株生理生化分析，菌株的生理生化分析參照文，主要進(jìn)行了革蘭氏染色、淀粉水解、糖發(fā)酵、吲哚試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、檸檬酸試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)等。

2）菌株的分子生物學(xué)鑒定，菌株的分子生物學(xué)鑒定參照文

1.4糖脂類(lèi)表面活性劑特性研究1，4，1糖脂類(lèi)表面活性劑的組分鑒定

1）薄層層析實(shí)驗(yàn)，薄層層析實(shí)驗(yàn)參照文，

2）HPLC—MS鑒定，采用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)純化組分進(jìn)行鑒定，單糖脂和二糖脂主要成分的物質(zhì)的量百分比由各成分出峰面積的比例近似計(jì)算得到。

1.4.2糖脂類(lèi)表面活性劑的性能檢測(cè)

糖脂類(lèi)表面活性劑的提取參照文，對(duì)提取的糖脂類(lèi)表面活性劑進(jìn)行界面張力、乳化性能和排油圈性能測(cè)定，

1）界面張力測(cè)定，使用界面張力儀檢測(cè)上清界面張力，對(duì)照組為蒸餾水，

2）乳化性能測(cè)定，在20mL乳化管中中依次加入5mL不同濃度的表面活性劑溶液和5mL二甲苯。超聲處理3min，靜置，分別于Oh、24h、48h、72h觀察并記錄乳化相體積及變化，

3）排油性能測(cè)定，將0，5g蘇丹紅Ⅲ溶解于100mL液體石蠟中，攪拌均勻后，過(guò)濾除去不溶物及雜質(zhì)，在90 mm平皿中加入30mL蒸餾水，滴加1mL蘇丹紅Ⅲ染色后的液體石蠟，待液體石蠟散開(kāi)在水面上鋪開(kāi)形成一層均勻的薄膜后，在石蠟中心處緩慢滴加10txL上清液，觀察排油圈直徑并記錄，

2.結(jié)果與討論

2.1產(chǎn)糖脂類(lèi)表面活性劑菌株的篩選結(jié)果

經(jīng)富集培養(yǎng)、平板劃線(xiàn)分離后，從大慶油田采油三廠(chǎng)油藏采出液中初步篩選出18株微生物菌株，對(duì)初篩的21株微生物菌株進(jìn)行溶血圈檢測(cè)，如圖1所示，共得到14株產(chǎn)生物表面活性劑的微生物菌株，為了進(jìn)一步篩選產(chǎn)糖脂類(lèi)表面活性劑的菌株，進(jìn)行了苯酚硫酸實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵上清液經(jīng)過(guò)在490 nm處吸光值顯著高于對(duì)照組的菌株，可確定為產(chǎn)糖脂菌種，經(jīng)過(guò)篩選共得到7株產(chǎn)糖脂類(lèi)菌株，對(duì)7株產(chǎn)糖脂類(lèi)菌株進(jìn)行液體發(fā)酵7 d后，對(duì)提取的糖脂類(lèi)粗品進(jìn)行稱(chēng)重，其中菌株QS-M2的粗品產(chǎn)量最高，達(dá)到了0.725g/L后續(xù)實(shí)驗(yàn)中用到的菌株均為QS-M2菌株，

2.2產(chǎn)糖脂類(lèi)菌株的鑒定結(jié)果

2.2.1QS-M2菌株的形態(tài)及生理生化特征

Qs—M2菌株形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果和生理生化特征如表l、2所示，QS-M2菌落圓形、表面光滑、淺綠色、邊緣整齊、短桿狀、菌落中心向上凸起、菌落不透明，QS-M2菌株屬于革蘭氏陰性菌，VP試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)為陽(yáng)性，淀粉水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)為陰性，

2.2.2 QS-M2菌株的分子生物學(xué)鑒定

QS-M2菌株的16S rDNA基因經(jīng)克隆測(cè)序拼接后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast比對(duì)，如表3所示，16S rDNA序列分析的結(jié)果顯示，該菌株為銅綠假單胞桿菌，

2.3QS-M2菌株產(chǎn)生的表面活性劑類(lèi)型分析和組

分鑒定

2.3.1

薄層層析實(shí)驗(yàn)對(duì)表面活性劑的定性分析

如圖2所示，以鼠李糖作為標(biāo)準(zhǔn)品（左側(cè)），用薄層層析實(shí)驗(yàn)對(duì)QS-M2菌株產(chǎn)生的糖脂類(lèi)表面活性劑進(jìn)行定性分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照相似，QS-M2菌株產(chǎn)生的糖脂類(lèi)表面活性劑顯色為黃綠色，表明QS-M2菌株產(chǎn)生的糖脂類(lèi)表面活性劑為鼠李糖脂，

2.4 QS-M2菌株產(chǎn)生的鼠李糖脂的性能測(cè)定

界面張力、排油圈性能和乳化性能是生物表面活性劑性能測(cè)定的重要指標(biāo)_1引，如表4所示，界面張力隨著鼠李糖脂濃度的增大逐漸降低并且穩(wěn)定，最終界面張力由72.0mN/m降低至36.9mN/m，下降了35.1mN/m，排油圈直徑隨著表面活性劑濃度增大而增加，排油能力增強(qiáng)，

乳化指數(shù)是靜置24h后乳化體積與總體積的百分比，乳化指數(shù)越高說(shuō)明乳化效果越好，且乳化性能穩(wěn)定，由表5可以得出，乳化層的體積并非隨著表面活性劑濃度的增大而增大，而是達(dá)到了一定體積后，隨著濃度的增加，乳化層體積下降，與50%吐溫20溶液相比，乳化穩(wěn)定性極高，長(zhǎng)達(dá)72 h的測(cè)量時(shí)間里，乳化層體積幾乎穩(wěn)定不變，說(shuō)明鼠李糖脂的乳化性能較高，并且乳化的穩(wěn)定性能極好，

3.結(jié)論

1）從大慶油田油藏產(chǎn)出水樣中經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)、劃線(xiàn)分離、溶血圈測(cè)定和苯酚硫酸檢測(cè)等方法篩選出一株產(chǎn)表面活性劑的菌株QS-M2，其發(fā)酵產(chǎn)生的糖脂產(chǎn)量為0，225g/L

2）QS-M2菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化分析和分子生物學(xué)鑒定，該菌株為銅綠假單胞菌（Pseudo，monas aeruginosa）。

3）QS-M2菌株產(chǎn)生的表面活性劑經(jīng)薄層層析和HPLC-MS鑒定，主要的表面活性劑物質(zhì)是鼠李糖脂，其中單鼠李糖脂的主要組分為RhaC₁₀C₁₀、RhaC₁₂C₁₂雙鼠李糖脂的主要組分為Rha2C₁₄C₁₂、Rha2C₁₀C₁₂和Rha2C₁₀C₁₀。

4）QS-M2菌株產(chǎn)生的鼠李糖脂對(duì)上清液界面張力的影響是隨著鼠李糖脂濃度的增大逐漸降低并穩(wěn)定，最終降低界面張力72.0mN/m至36.9mN/m，下降了35.1mN/m；排油圈直徑隨著表面活性劑的濃度增大而增加，排油性能增強(qiáng)；該鼠李糖脂具有較好的乳化性能，并在72h內(nèi)乳化性能穩(wěn)定。