斑貞1號、TMP和5-FU聯合對人胃癌細胞ERCC1表達的影響

張愛民 郝海燕 郝旺勝 馬振華.包頭醫學院第一附屬醫院消化科，內蒙古包頭0400；.內蒙古自治區包頭市第四醫院消化科，內蒙古包頭04030

斑貞1號、TMP和5-FU聯合對人胃癌細胞ERCC1表達的影響

張愛民1郝海燕2郝旺勝1馬振華1
1.包頭醫學院第一附屬醫院消化科，內蒙古包頭014010；2.內蒙古自治區包頭市第四醫院消化科，內蒙古包頭014030

目的探討斑貞1號、川芎嗪（TMP）和五氟尿嘧啶（5-FU）聯合逆轉人胃癌細胞系SGC-7901/ADR與ERCC1表達的影響。方法采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR），監測人胃癌細胞SGC-7901/ADR細胞在5-FU組、斑貞1號組、斑貞1號+5-FU組、斑貞1號+5-FU+TMP組切除修復交叉互補基因1（ERCC1）mRNA的表達情況。結果5-FU組與陰性對照組比較，ERCC1 mRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05），而5-FU聯合中藥斑貞1號及TMP處理組ERCC1mRNA表達量明顯升高（P＜0.05）。結論斑貞1號、TMP和5-FU聯合逆轉SGC-7901/ADR細胞耐藥性可能與ERCC1基因相關，為當前胃癌的治療提供了新的理論依據。

胃癌；斑貞1號；TMP；5-FU；多藥耐藥；ERCC1基因

胃癌是中國常見的惡性腫瘤之一，至今為止手術仍是胃癌的主要治療方法，因早癌診斷率低，70%患者失去手術機會，所以化療顯得非常重要，但目前最大的問題是胃癌多藥耐藥性（MDR），近幾年發現［1，2］ER CC1參與胃癌的多藥耐藥，并起重要作用，本課題組侯培珍等［3］研究結果示斑貞1號、5-FU和TMP聯合對人胃癌有逆轉作用。本課題采用RT-PCR方法比較人胃癌細胞（SGC-7901/ADR）經過不同藥物組治療后的ERCC1 mRNA的表達量，進一步探討各藥物組對人胃癌SGC-7901/ADR細胞的作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系

胃癌SGC-7901/ADR細胞，第四軍醫大贈。

1.2 藥物、試劑及主要儀器

自擬“斑貞1號”每毫升含露蜂房、山茱萸、斑蝥、女貞子各0.2 g。5-FU（規格：10 mL∶0.25 g，國藥準字H31020593，上海旭東海普藥業有限公司）、TMP（規格40 mg，國藥準字H20031302，安徽制藥），RPMI1640培養基（RPMI為Roswell Park Memorial Institute縮寫，1640是培養基代號，其中含有10%胎牛血清，美國GIBCO北京有限公司），二甲基亞砜、胰蛋白酶（美國Sigma公司產品），新生小牛血清（杭州四季青公司），兩步法RT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司產品），引物片段（上海生物工程公司），PCR擴增儀（Ambion公司）、電泳儀及紫外分光度計（北京六一公司），Trizol（TakaRa公司），紫外透視成像系統（上海精科實業有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞處理取對數生長期的細胞，以5×104/mL濃度接種于6孔板上，每孔用吸管加入2 mL，然后培養24 h，然后分為五組；對照組、5-FU組、斑貞1號組、斑貞1號+5-FU、斑貞1號+5-FU+TMP，分別加入等量的新的培養液，5-FU稀釋液、斑貞1號稀釋液、斑貞1號+5-FU稀釋液、斑貞1號+5-FU+TMP稀釋液。培養48 h后，經過PBS緩沖液沖洗，提取總mRNA。

1.3.2 RT-PCR提取細胞中的總RNA：以mRNA為模板，采用Oligo隨機引物，利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。然后再以cDNA作為模板PCR擴增，瓊脂糖電泳并拍照，分析電泳條帶灰度值，檢查基因mRNA轉錄相對量的變化。具體步驟如下：以mRNA為模板經逆轉錄合成cDNA，每個反應體系25 μL，目的基因引物各0.5 μL，Takara Taq 1 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，ddH2O 13.5 μL；各樣品cDNA 5 μL，滅菌蒸餾水13.5 μL。經過預變性→變性→退火→延伸，（PCR擴增條件分別為94℃1 min，58℃30 s，72℃45 s，72℃10 min），共30個循環，最后延伸72℃10 min，擴增結束，取10 μL樣品，跑電泳60 min，（經100 V恒壓，2%瓊脂糖）然后采集電泳圖像，得出各電泳帶光密度值，β-action引物正義列為5’-GTGGG GCGCAGGCACCA-3’，反義列為5’-CTCCTTAATACGCACGATTTC-3’ERCC1基因引物序列的正義列引5-TCAGACCTTCGCCGTATATGC-3’，反義列引物為5’-ACATCCACATGGACCAG-CAGG-3’。

1.4 統計學方法

應用SPSS17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，進行方差分析及LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌SGC-7901/ADR細胞ERCC1 mRNA的表達情況

5-FU組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。其他藥物組與對照組相比及組間比較均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同藥物組處理后SGC7901/ADR細胞的ERCC1 mRNA表達±s）

表1 不同藥物組處理后SGC7901/ADR細胞的ERCC1 mRNA表達±s）

注：A組與B組比較，差異無統計學意義（t=0.44，P＞0.05），C組、D組、E組與A組比較，差異均有統計學意義（t=6.95、11.36、14.40，P＜0.05）；C組與B組比較t=6.50；D組與C組比較t=4.91，E組與D比較t=2.58，差異均有統計學意義（P＜0.05）

組別ERCC1相對光密度值A（對照組）B（5-FU組）C（斑貞1號組）D（斑貞1號+5-FU組）E（斑貞1號+5-FU+TMP組）F值P 1.89±0.28 1.84±0.25 2.89±0.24 3.51±0.23 4.14±0.04 84.616＜0.05

2.2 ERCC1和對照基因β-action的RT-PCR產物經瓊脂糖分離后電泳圖

切除修復交叉互補基因1（ERCC1）和對照基因（β-action）的RT-PCR產物經瓊脂糖分離后分別位于354bp和548bp，見圖1。

圖1 ERCC1和對照基因β-action的RT-PCR產物經瓊脂糖分離后電泳圖

3 討論

目前我國胃癌發病率及死亡率位居惡性腫瘤第三位［4］，化療是胃癌治療中其重要作用，但大部分藥物因多藥耐藥（MDR）使化療失敗［5］。

近年研究發現ERCC1基因與惡性腫瘤的多藥耐藥及腫瘤的發生、發展、療效預測及預后相關。此基因在許多腫瘤組織中表達低下，對頭頸部鱗癌的研究發現，ERCC1水平低表達可能是發生頭頸部癌的危險因素，在對食管癌和胃食管結合部癌的研究中，發現ERCC1的表達降低與惡性腫瘤的發病率增加有關，在胃癌的研究中也得到了相似的結果。在胃癌的研究中發現［6］ERCC1的表達水平與化療敏感性密切相關，認為其表達水平對進展期胃癌患者的臨床療效進行有效預測。馬冬等［7］回顧性分析發現ERCC1表達與淋巴結轉移相關而與腫瘤大小、浸潤深度無關。而胡鏘、于東風等［8］研究卻發現此基因表達水平與患者性別、年齡、組織學類型、淋巴結轉移均無相關性。而李紫燕等［9］研究發現此基因在胃癌組織中表達水平與患者年齡、腫瘤部位、組織學類型、分期及淋巴結轉均無關，而與性別有相關，趙國華、吳杰等［10］發現ERCC1陰性的胃癌患者采用5-Fu和奧沙利鉑化療的療效更好。李紅等［11］研究發現ERCC1在胃癌組織中的表達與組織學分級及研究中，有無淋巴結轉移無明顯差異，本課題組先前已證實胃癌細胞對5-FU耐藥性，ERCC1（切除修復交叉互補基因）是Westerveld等在1984年發現的，此基因定位于人類第19號染色體短臂13.2～13.3位點上，大小為15 kb，ERCC1基因擁有四種分子量的mRNA，但只有1.1kb mRNA具有核苷酸切除修復作用。關于腫瘤發生和發展的學說認為腫瘤是致癌相關的危險因素暴露造成DNA損傷，再加上DNA修復基因表達低下造成基因損傷不斷地在上皮細胞內累積導致癌基因和抑癌基因突變等一系列連續事件作用的結果。ERCC1基因表達低下影響細胞對DNA加合物及核苷酸損傷的修復，可導致p53、K-RAS基因突變增加，從而增加惡性腫瘤的發生率［12］。ERCC1修復了損傷的基因，使基因組保持完好，減少了癌變相關基因的出現，使細胞能保持正常的生物學活性，從而減少癌變的幾率，降低了腫瘤的發病率［13，14］。

斑貞1號合劑（斑蝥、露蜂房、女貞子、山茱萸），斑蝥能抑制腫瘤細胞DNA和RNA合成，殺傷腫瘤。它對HeLa細胞及人食管、胃、肝、乳腺癌細胞均有抑制作用，能促進造血干細胞分化，加速粒細胞的釋放，很好地對抗了放化療中血細胞下降，減少了不良反應。TMP通過多種途徑對腫瘤起到治療和逆轉多藥耐藥的作用。楊葉等［15］已證實TMP能增加5-FU對胃癌化療的敏感性。本實驗研究發現斑貞1號、5-FU和TMP三聯藥物處理組胃癌細胞ERCC1 mRNA表達量高于其他用藥組，差異有統計學意義（P＜0.05），說明三種藥聯合可顯著提高ERCC1 mRNA的高表達，增強了治療效果。

［1］柴文剛.ERCC1與RRM1在胰腺癌中的表達及臨床意義［D］.吉林大學，2013.

［2］王瓊，王南瑤，邵國益，等.基因mRNA表達水平在晚期胃癌化療敏感性預測中的應用［J］.實用臨床醫藥雜志，2012，（19）：13-15.

［3］侯培珍，張娟，趙永峰.中西藥結合對胃癌細胞多藥耐藥性逆轉和誘導凋亡的實驗研究［J］.第四軍醫大學學報，2008，29（13）：1181-1183.

［4］郭曉川，張婷婷，蘇丹，等.小腸原發惡性腫瘤根治術后輔助化療療效分析［J］.腫瘤防治研究，2013，40（7）：693-696.

［5］田君，姚學權，陳徹，等.進展期胃癌不同切除術式對輔助化療耐受性的影響［J］.中國腫瘤外科雜志，2014，（2）：88-92.

［6］顧術東，茅國新，張曙.晚期胃癌ERCC1和BRCA1表達與鉑類化療療效及預后關系？［J］.現代腫瘤醫學，2013，21（11）：2525-2528.

［7］馬冬，楊冬陽，羅少燕，等.COX-2和ERCC1在胃癌中的表達及其臨床意義［J］.實用醫學雜志，2014，（16）：2585-2587.

［8］胡鏘，于東風，劉弋.ERCC1和TUBB3在晚期胃癌組織中的表達及其臨床意義［J］.安徽醫藥，2015，（5）：891-894.［9］李紫燕，張翼，張士虎.胃癌組織中ERCC1基因實時熒光定量PCR表達及臨床意義［J］.中國衛生產業，2014，（28）：26-28.

［10］趙國華，吳杰，范中寶，等.ERCC1和TS對奧沙利鉑和5-Fu聯合化療的胃癌患者化療療效的Meta分析［J］.實用癌癥雜志，2014，（6）：657-659.

［11］李紅，李乾，王祎萌.中晚期胃癌中ERCC1與CerbB-2的表達及臨床意義［J］.中國熱帶學，2015，15（8）：997-999.

［12］楊安，劉平，董媛媛.ERCC1和AKT2在胃癌組織中的表達及其臨床意義［J］.醫學臨床研究，2014，31（5）：972-974.

［13］聶瑩瑩，王權蓉，王瑞.胃癌組織中HPSE及ERCC1的表達及臨床意義［J］.醫學信息，2015，28（7）：26-28.

［14］左靜，孔雁，戚素文，等.ERCC1與消化道腫瘤關系研究進展［J］.河北北方學院學報：自然科學版，2015，（3）：110-112.

［15］楊葉，侯培珍，張娟.川芎嗪聯合氟尿嘧啶對胃癌細胞SGC-7901/ADR的殺傷作用［J］.腫瘤防治研究，2008，35（9）：624-626.

Effects of combined Banzhen 1，TMP and 5-FU on the expression of human gastric cancer cell ERCC1

ZHANG Aimin1HAO Haiyan2HAO Wangsheng1MA Zhenhua1
1.Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou014010，China；2.Department of Gastroenterology，the Fourth Hospital of Baotou City in Inner Mongolia Autonomous Region，Baotou 014030，China

Objective To explore the effects of combined Banzhen 1，TMP and 5-FU on reversing human gastric cancer cell line SGC-7901/ADR and the expression of ERCC1.Methods Semi-quantitative RT-PCR was applied to monitor the expression of ERCC1 mRNA in human gastric cancer cell SGC-7901/ADR cell in 5-FU group；Banzhen 1 group；Banzhen 1 group+5-FU group；Banzhen 1+5-FU+TMP group.Results 5-FU group and negative control group were compared，and the difference of ERCC1 mRNA expression was not significant（P＞0.05），but ERCC1 mRNA ex pression volume in 5-FU combined with TCM Banzhen 1 group and TMP group was significantly improved（P＜0.05）.Conclusion Combined Banzhen 1，TMP and 5-FU in reversing drug resistance of SGC-7901/ADR cell may be correlated with ERCC1 gene，which provides new theoretical evidence for the treatment of gastric cancer.

Gastric cancer；Banzhen 1；TMP；5-FU；Multiple resistance；ERCC1 gene

R735.2

A

1673-9701（2016）26-0034-03

2016-06-04）