CYP3A5和VEGFR3基因多態性對舒尼替尼治療胃腸道間質瘤的影響

厲志昂，王亞旭，黃勇

（重慶醫科大學第二附屬醫院胃腸外科，重慶400010）

CYP3A5和VEGFR3基因多態性對舒尼替尼治療胃腸道間質瘤的影響

厲志昂，王亞旭△，黃勇

（重慶醫科大學第二附屬醫院胃腸外科，重慶400010）

目的探討細胞色素P4503A5（CYP3A5）和血管內皮生長因子受體3（VEGFR3）基因多態性對舒尼替尼治療胃腸道間質瘤（GIST）的影響。方法收集2013年8月至2014年8月該院胃腸外科住院手術治療的25例GIST患者肘靜脈外周血標本，采用聚合酶鏈反應測序對CYP3A5基因rs776746和VEGFR3基因rs307826的基因序列進行檢測，術后因應用伊馬替尼耐藥或不能耐受或基因檢測表明舒尼替尼敏感而應用舒尼替尼治療，并隨訪跟蹤療效及不良反應。結果25例患者中VEGFR3基因rs307826 AG型僅2例（8.0%），AA型23例（92.0%），未發現GG型；AA型患者疾病控制率明顯高于AG型，差異有統計學意義（Fisher=8.696，P=0.033 0）；rs307826位點基因型與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤危險度分級、腫瘤臨床病理類型等均無關（P＞0.05）。25例患者中CYP3A5基因rs776746 AG型12例（48.0%），GG型13例（52.0%），未發現AA型；GG型患者不良反應明顯輕于AG型，差異有統計學意義（Fisher=8.901，P=0.012 0）；rs776746位點基因型與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤危險度分級、腫瘤臨床病理類型等均無關（P＞0.05）。結論舒尼替尼治療GIST可明顯提高大部分患者疾病控制率。檢測CYP3A5基因多態性對GIST的個體化治療及不良反應的預防和處理具有重要意義。

胃腸腫瘤；間皮瘤；多態性，單核苷酸；基因型；舒尼替尼

胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumors，GIST）是一組來源于胃腸道間葉源性腫瘤，國內發病率為百萬分之一至二，但在消化道間葉腫瘤中占有及其重要的地位。分子水平研究使人們進一步深入認識了GIST，GIST發生因素中最為關鍵的是c-kit基因及血小板源性生長因子受體基因突變［1-3］。酪氨酸激酶抑制劑——伊馬替尼、蘋果酸舒尼替尼膠囊（索坦）等靶向治療藥物的應用極大提高了GIST的療效。

基因多態性是指一個生物群體中存在多種不連續的基因型。有研究表明，基因多態性可影響不同個體對疾病的易感性、藥物不良反應和療效［4］。腫瘤的發生、生長、轉移與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的高表達密切相關。VEGF受體3（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR3）是VEGFR中的一種，主要表達于淋巴管內皮細胞，其信號通路在腫瘤淋巴轉移、腫瘤淋巴管形成等方面具有重要意義。細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）是人體內一種與藥物代謝有關的酶，參與多種化合物的代謝包括藥物的生物轉化等，與藥物在體內的清除密切相關，能代謝近90.0%臨床藥物［5］。CYP3A5是CYP3A的一種亞型，其表達的多態性被認為是CYP3A活性差異的最重要因素。隨著人們對GIST認識的逐步加深，研究基因多態性與疾病發生、發展的關系受到越來越多的關注，目前，尚未見有關CYP3A5基因rs776746和VEGFR3基因rs307826多態性與舒尼替尼治療GIST的療效與不良反應的研究。本研究回顧性分析了CYP3A5基因rs776746和VEGFR3基因rs307826多態性與舒尼替尼治療GIST的療效、不良反應的關系，并希望可以為GIST的靶向治療提供更加科學、有效、個體化的臨床依據。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1資料來源收集2013年8月至2014年8月本院胃腸外科住院手術治療的25例GIST患者術后2周采集的肘靜脈血標本，術后常規進行病理檢查及基因檢測均證實為GIST。

1.1.2排除標準排除患有高血壓、冠心病、糖尿病等基礎疾病的患者。

1.1.3儀器與試劑無水乙醇、95%乙醇、CYP3A5基因rs776746引物、VEGFR3基因rs307826引物、全血DNA提取試劑盒、DNA FFPE Tissue試劑盒、Taq酶、dNTP、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀9700、海爾冰箱、渦旋混合器XW-80A、ABI3730DNA測序儀、平板離心機、電熱恒溫水浴鍋、電泳儀JY300C、Ge1Doc凝膠成像分析系統等。

1.2方法

1.2.1治療方法25例患者中應用伊馬替尼期間出現疾病進展17例，不能耐受伊馬替尼4例（將常規劑量400 mg改為300 mg后患者仍有嚴重骨髓抑制），基因檢測c-kit外顯子9突變及野生型4例，故均采用索坦（美國輝瑞公司，批號不詳）口服，每天1次，每次50 mg，用藥28 d停藥14 d。根據患者身體耐受情況和病情程度以12.5 mg為梯度單位適當調整劑量［6］。

1.2.2基因測序收集的外周靜脈血標本用乙二胺四乙酸抗凝，離心，分離血細胞和血漿，于-20℃冰箱保存。提取全血基因組DNA，并對目的基因進行PCR擴增，設計合成CYP3A5基因rs776746和VEGFR3基因rs307826位點的PCR引物序列（表1）。用50 mL PCR擴增體系擴增：94℃預變性5 min，94℃變性15 s，60℃退火25s，72℃延伸30 s 40個循環；72℃延伸5 min。擴增后用瓊脂凝膠電泳，電泳完畢取出凝膠，在紫外線成像系統下觀察PCR檢測結果。最后進行基因測序，使用Chromas軟件進行數據分析。

表1　PCR引物

1.2.3觀察指標嚴密觀察患者血常規，肝、腎功能，心電圖和尿常規等，于第1次用藥及以后每12周復查腹部CT，并做相應記錄。

1.2.4療效判定標準采用文獻［7］的標準，在第24周進行療效評估包括完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、疾病穩定（stable disease，SD）和疾病進展（progressive disease，PD）。主要觀察終點為無進展生存期（progression-free survival，PFS）、總生存期（overall survival，OS）、客觀有效（CR+PR）及疾病控制（CR+PR+SD）。PFS定義為從接受第一劑量舒尼替尼至PD的時間，OS定義為從接受第一劑量舒尼替尼至死亡的時間。采用NCI標準對患者出現的不良反應進行判定及記錄。

1.2.5隨訪對出院患者進行電話、電子郵箱、門診隨訪等，對患者出院后病情控制情況進行調查和統計。

1.3統計學處理應用SPSS21.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗、Fisher′s精確檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1一般資料25例患者一般資料見表2。

表2　患者一般資料（n=25）

2.2基因測序結果

2.2.1VEGFR3基因rs30782625例患者中AG型2例（8.0%），AA型23例（92.0%），未發現GG型。

2.2.2CYP3A5基因rs77674625例患者中AG型12例（48.0%），GG型13例（52.0%），未發現AA型。

2.3基因位點多態性分析

2.3.1VEGFR3基因rs307826rs307826位點基因型與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤危險度分級、腫瘤臨床病理類型等均無關（P＞0.05），見表3。

表3　VEGFR3基因rs307826位點基因型與臨床特征相關性［n（%）］

2.3.2CYP3A5基因rs776746rs776746位點基因型與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤危險度分級、腫瘤臨床病理類型等均無關（P＞0.05），見表4。

表4　CYP3A5基因rs776746位點基因型與臨床特征相關性［n（%）］

2.4VEGFR3基因rs307826位點多態性對舒尼替尼療效的影響25例患者中出現不同程度進展16例，AA型患者疾病控制率明顯高于AG型，差異有統計學意義（Fisher=8.696，P=0.033 0），見表5。

表5　EGFR3基因rs307826位點多態性與舒尼替尼療效分析

2.5CYP3A5基因rs776746位點多態性對舒尼替尼不良反應的影響主要不良反應為手足綜合征、惡心、乏力、腹瀉、血液系統并發癥等，GG型患者不良反應明顯輕于AG型，差異有統計學意義（Fisher=8.901，P=0.012 0）。見表6。

表6　CYP3A5基因rs776746位點多態性與舒尼替尼不良反應分析

3　討論

GIST發病率雖然不高，但卻是消化道中最常見的間葉源性腫瘤，男女發病比例相差無幾（分別為55.0%、45.0%），各年齡段均可發病，發病年齡為55～60歲［8］。目前，主要以手術為主，再輔以靶向生物治療等綜合治療。隨腫瘤分子生物學的發展及研究，靶向治療已成為GIST不可替代的治療方式。2002年美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）批準伊馬替尼用于無法手術切除或復發轉移的GIST患者，目前為止仍為GIST靶向治療的一線用藥。Fujimoto等［9］研究發現，術前應用伊馬替尼進行新輔助治療后患者直腸GIST瘤體縮小明顯，降低了手術難度，增加了手術效果。Bamboat等［10］認為，伊馬替尼在GIST新輔助治療方面安全、可行，且耐受性良好。但隨伊馬替尼的應用，伊馬替尼耐藥或患者不耐受情況越來越受到重視，2006年1月FDA批準舒尼替尼作為伊馬替尼耐藥或不能耐受的二線用藥。舒尼替尼對伊馬替尼耐藥或不耐受的GIST患者有效。在GIST治療中靶向治療具有更好的療效及耐受性，但靶向治療藥物的不良反應與個體差異不容忽視。有研究表明，靶向藥物不良反應及療效與CYP3A5基因和VEGFR3基因中某些片段的單核苷酸多態性密切相關［11］。因此，檢測這些基因多態性片段對評估舒尼替尼療效及不良反應具有重要意義。

VEGFR3是VEGF-C特異性受體，VEGF-C與VEGFR3特異性結合，受體發生磷酸化，激活相應傳導通路，促進淋巴管內皮細胞增殖、遷移、分化等生物學過程，影響腫瘤侵襲性，改變細胞基質與腫瘤細胞的黏附性，為腫瘤細胞浸潤創造了條件［8］。有研究表明，在GIST中VEGFR與PDGFR-α表達均升高，表達強度隨腫瘤危險度升高而升高，且VEGFR升高較PDGFR-α明顯［12］。總之，通過檢測VEGFR3基因單核苷酸多態性，有助于評判GIST危險度及藥物療效，且根據檢測結果給予個體化用藥。

CYP3A5基因是CYP3A家族的一個亞型。Faivre等［13］認為，CYP3A5基因突變能影響其代謝酶活性，改變代謝底物的速率和能力。在臨床用藥中這是出現個體差異的最重要原因之一。因此，對CYP3A5基因的研究成為解釋酶活性差異的熱點，導致藥物個體差異的重要因素之一是CYP3A5基因多態性。有研究表明，CYP3A5基因rs776746多態性可用以檢測腎細胞癌應用舒尼替尼靶向治療過程中的藥物不良反應，因藥物不良反應而減量的風險與CYP3A5基因rs776746位點高代謝等位基因相關（危害比：3.75，95%可信區間：1.67～8.41，P= 0.001 4），rs776746位點GG型較AG型不容易引起藥物不良反應［14-15］。在GIST的治療中舒尼替尼產生的不良反應亦不容忽視。因此，通過檢測CYP3A5基因多態性可預測舒尼替尼治療GIST過程中的不良反應，從而早預防及治療，為個體化治療提供依據。本研究發現，GIST患者中CYP3A5基因rs776746位點AG型占48.0%，GG型占52.0%，未發現AA型，因此，雖然GIST患者能明顯從舒尼替尼治療中受益，但其不良反應不容忽視，應密切觀察并及時處理。本研究還發現，CYP3A5基因rs776746和VEGFR3基因rs307826位點基因型與患者年齡、性別、腫瘤危險度分級、腫瘤臨床病理類型等均無關（P＞0.05）；GIST患者中VEGFR3基因rs307826位點AA型占92.0%，且AA型患者疾病控制率明顯高于AG型，差異有統計學意義（Fisher=8.696，P=0.033 0），表明AA型患者舒尼替尼療效較好，且大多數GIST患者為AA型，表明大多數GIST患者能從舒尼替尼治療中獲益。GG型患者不良反應明顯輕于AG型，差異有統計學意義（Fisher=8.901，P=0.012 0）。上述研究結果在舒尼替尼治療腎癌中亦有相似結論［15］。本研究未發現CYP3A5基因rs776746 AA型和VEGFR3基因rs307826 GG型，這2種基因型可能不是GIST患者突變熱點。

綜上所述，GIST患者能明顯從舒尼替尼治療中獲益，但藥物不良反應是不容忽視的，因此，檢測CYP3A5基因rs776746位點單核苷酸多態性能提早預防及治療舒尼替尼不良反應，對個體化治療及預防具有重要意義，盡量避免因其不良反應而導致減量或停藥。當然，該結論尚有待于擴大樣本進一步研究證實。

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Influence of CYP3A5 and VEGFR-3 gene polymorphism on sunitinib treatment of gastrointestinal stromal tumors

Li Zhiang，Wang Yaxu△，Huang Yong
（Department of Gastrointestinal Surgery，Second Affiliated Hospital，Chongqing Medical U-niversity，Chongqing 400010，China）

ObjectiveTo investigate the influence of cytochrome P4503A5（CYP3A5）and vascular endothelial growth factor receptor 3（VEGFR-3）gene polymorphism on the sunitinib treatment in gastrointestinal stromal tumors（GIST）.Methods The elbow venous peripheral blood sample was taken for detecting the gene sequence of rs776746 polymorphisms of CYP3A5 gene and rs307826 polymorphisms of VEGFR3 gene by PCR direct sequencing.Sunitinib was used due to imatinib resistance after operation，or unable tolerance or sunitinib sensitivity indicated by gene detection.The curative effect and adverse reactions were fol lowed up and tracked.ResultsAmong 25 cases，only 2 case（8.0%）were rs307826 type of VEGFR3 gene，23 cases（92.0%）were AA type and GG type was not found；the disease control rate of AA type was significantly higher than that of AG type，the difference was statistically significant（Fisher=8.696，P=0.033）；rs307826 site genotype had no relation with the age，sex，tumor site，tumorriskgrade andtumorclinicopathologicaltype（P＞0.05）.Among25 cases，12 cases（48.0%）were rs776746 AG type of CYP3A5 gene，13 cases（52.0%）were GG type and AA type was not found；the adverse reactions in the patients with GG type were significantly slighter than those in AG type，the difference was statistically significant（Fisher=8.901，P=0.012 0）；rs776746 site genotype had no relation with the age，sex，tumor site，tumor risk grade and tumor clinicopathological type（P＞0.05）.ConclusionThe sunitinib treatment of GIST can elevate the disease control rate in the majority of patients.Detecting the polymorphism of CYP3A5 gene has an important significance to the individualized therapy，prevention and treatment of adverse reactions in GIST.

Gastrointestinal neoplasms；Mesothelioma；Polymorphism，single nucleotide；Genotype；Sunitinib

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.12.010

A

1009-5519（2016）12-1806-04

厲志昂（1991-），碩士研究生，主要從事胃腸道間質瘤的研究與治療。

△，E-mail：408861993@qq.com。

（2016-03-01）