解毒化瘀方對凝血酶合并缺氧誘導PC12細胞損傷ERK1/2信號通路表達的影響

鄧奕輝，成紹武，易亞喬，覃弘宇，李銀，李定祥*

（湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，湖南長沙410208）

解毒化瘀方對凝血酶合并缺氧誘導PC12細胞損傷ERK1/2信號通路表達的影響

鄧奕輝，成紹武，易亞喬，覃弘宇，李銀，李定祥*

（湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，湖南長沙410208）

目的探討急性缺血性中風（AIS）瘀毒病機的分子機制及解毒化瘀方對凝血酶合并缺氧損傷的保護作用。方法（1）用凝血酶合并缺氧損傷PC12細胞，模擬急性缺血性中風的體外細胞模型。（2）將細胞分為空白組，模型組，解毒化瘀方含藥血漿組和PD98059組（MEK抑制劑組），應用熒光定量實時RT-PCR方法檢測MEK1、PAR-1及ERK1/2的mRNA表達，應用免疫熒光法檢測ERK1/2、P-ERK1/2的蛋白表達。結果PCR結果提示：模型組MEK1、PAR-1及ERK1/2的mRNA表達與空白對照組相比顯著升高（P＜0.01），解毒化瘀方組和PD98059組MEK1、PAR-1及ERK1/2的mRNA表達較模型組顯著降低（P＜0.01），免疫熒光結果提示：解毒化瘀方組和PD98059組ERK1/2、P-ERK1/2的蛋白表達較模型組顯著降低（P＜0.01）。結論解毒化瘀方以凝血酶為作用的分子靶點，能夠顯著降低ERK1/2信號通路在缺血性中風體外細胞模型中的表達。

解毒化瘀方；急性缺血性中風；凝血酶；ERK1/2信號通路；黃連解毒湯

急性缺血性中風（acute ischemic stroke，AIS）是最常見腦血管疾病之一，占各類腦中風（stroke）的60%～80%［1］，已經(jīng)成為嚴重影響人類健康和社會經(jīng)濟的重大醫(yī)學問題。近年來，有關急性缺血性中風的機制的主要學說有能量耗竭、興奮性氨基酸毒性、梗死灶周邊半暗帶去極化、炎性細胞因子、鈣離子超載、一氧化氮（NO）和自由基損傷、細胞凋亡等［2-3］。本研究在總結前期研究成果和繼承傳統(tǒng)中醫(yī)理論的基礎上，提出了AIS的主要病機為與凝血酶毒性相關的瘀血阻滯、毒損腦絡，解毒化瘀法是該病有效治法的假說，并從ERK1/2信號轉導通路來探討解毒化瘀方神經(jīng)保護作用的分子機制。

1　材料

1.1實驗藥物與試劑

解毒化瘀方（藥物組成有黃連、黃芩、黃柏、梔子、紅花、川芎、赤芍和地龍，由黃連解毒湯加味而成）飲片（購于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院）；胰蛋白酶（Sango公司）、DMEM HIGH GLUCOSE（1X）培養(yǎng)基（美國HyClone試劑公司，批號NAC1362）、胎牛血清（美國HyClone試劑公司，批號NWK0489）、凝血酶（1000 U/20 mg）（中國Solarbio試劑公司批號106A069）、PD98059（Cayman產(chǎn)品，上海葉舟生物科技有限公司，產(chǎn)品編號，167869-21-8）；一抗，美國圣克魯斯公司；二抗（羊抗兔），康為世紀，貨號CW0160。

1.2細胞及動物

PC12細胞（來源于大鼠的腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，高分化，永生性，購自長沙贏潤生物技術有限公司，編號2015032007）；SD大鼠18只，雌雄各半，體質量為180～200 g（購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號2015032007）。

1.3主要儀器

ABI-7300 Real-time檢測儀（美國ABI公司），逆轉錄試劑盒（立陶宛Fermentas公司，貨號#K1622），XDS-1B倒置顯微鏡（日本奧林巴斯），普通二氧化碳培養(yǎng)箱（德國賀利氏），3131三氣培養(yǎng)箱（Thermo），SP-756型紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司），ELX800酶標儀（美國羅氏公司）。

2　方法

2.1凝血酶合并缺氧誘導PC12細胞損傷模型的建立

PC12細胞以含10%胎牛血清、100 μ/mL青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5%CO2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液一次，待細胞成長融合后傳代培養(yǎng)。細胞以1×105cells/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.18 mL，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后再加終濃度為50 μg/L的神經(jīng)生長因子（NGF）誘導分化72 h后［4］，細胞神經(jīng)元特性鑒定采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）免疫熒光細胞化學方法。棄原培養(yǎng)液，將細胞分為，每組設8個復孔，分別加入0、50、100、150、200 μ/mL凝血酶10 μL和100 μL無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于三氣培養(yǎng)箱中（5%CO2、1%O2、94%N2）模擬缺氧培養(yǎng)過程，按1、6、12、24 h時間點依次培養(yǎng)孵育后取出。干預濃度及時間前期已通過前期實驗明確［5］。

2.2解毒化瘀方含藥血漿的制備

處方飲片置于煎煮容器內，加相當于藥材5倍量水浸泡1 h，煮沸45 min過濾，濃縮成每毫升含生藥2 g的藥液，冷卻后裝入無菌容器中，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩D大鼠9只灌服解毒化瘀方水煎液（按生藥36.6 g/kg灌胃，即成人臨床用量的5倍），每天1次，連續(xù)7 d，于末次給藥后2 h無菌條件下腹主動脈取血，取血后立即以3 000 r/min離心15 min，取上清液，組內血漿混合后0.22 μm過濾除菌后，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3解毒化瘀方含藥血漿對PC12細胞增殖的半數(shù)抑制濃度及作用時間的確定

采用MTT法測定，分為空白對照組（不含血漿），解毒化瘀方含藥血漿組（終濃度分別為1%、5%、10%、15%）。PC12細胞培養(yǎng)于96孔板，待貼壁分化后以無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細胞同步于G0期，分別加入濃度為0、1%、5%、10%、15%的含藥血漿。作用24 h后，加10 μL 5 mg/mL的MTT于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸去上清加150 μL的DMSO，震蕩10 min后于490 nm波長處檢測光密度值（OD），計算各含藥血漿抑制PC12細胞增殖的濃度（IC50）。

采用MTT法測定，分為無血漿對照組和含藥血漿組（各含藥血漿組終濃度為各含藥血漿的增殖抑制半數(shù)濃度IC50），于37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0、12、24、48 h后取出，加10 μL濃度為5 mg/mL的MTT于培養(yǎng)箱中溶液培養(yǎng)4h后，吸去上清加150 μL的DMSO，震蕩10 min后于490 nm波長處檢測光密度值（OD），以OD值反映PC12細胞的增殖活性。

2.4分組給藥及指標檢測

將細胞置于玻璃培養(yǎng)皿中并隨機分為空白組（正常細胞組）、模型組（凝血酶150 μ/mL、在缺氧條件下作用12 h）、解毒化瘀方含藥血漿組（含藥血漿+模型細胞，簡稱血漿組）和PD98059組（MEK信號通路抑制劑+模型細胞，簡稱對照組）。取空白組和模型組細胞，加入PBS平衡液潤洗（加入量以剛好沒過玻片為準）2次后，加入4%多聚甲醛固定15 min，進行PCR及激光共聚焦檢測。含藥血漿組加入含10%濃度解毒化瘀方的培養(yǎng)液于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后檢測相關指標。PD98059組加入10 μL濃度為20 um的阻斷劑，培養(yǎng)2 h后檢測相關指標。平行重復3次實驗取平均值。

2.4.1熒光定量實時PCR檢測PAR-1及ERK1/2的mRNA的表達引物由Invitrogen Biotechnology CO.，LTD中國公司合成（見表1），按照合成單加入ddH2O，制成7.5 μmd/L溶液。RNA的提取：按照試劑盒說明書提取細胞RNA，紫外分光光度計測定RNA純度，并進行RNA定量。PCR條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃復性45 s，60℃延伸1 min，40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物分析：取PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察條帶，數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析（ABI Prism 7300 SDS Software），各標本重復3次，取平均值。

表1　引物序列和擴增序列長度

2.4.2免疫熒光法檢測ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表達PC12細胞以1×104/mL接種于24孔板中，制作細胞爬片，吸取并棄上清加4%多聚甲醛固定15 min，加0.5%曲拉通作用10 min，再以牛血清蛋白封閉液封閉1 h，加一抗（1∶500）4℃孵育過夜，PBS潤洗后加FITC羊抗兔熒光二抗（1∶100）室溫孵育30 min，潤洗后甘油封片于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

2.5統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0進行統(tǒng)計，計量資料用“x±s”表示。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析；組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnet T3檢驗。

3　結果

3.1解毒化瘀方含藥血漿對PC12細胞增殖的半數(shù)抑制濃度和作用時間

隨著解毒化瘀方含藥血漿濃度的增高，各組IC50均在10%～15%的范圍內，且各組間無差異（P＞0.05），則可確定含藥血漿作用濃度為10%。在12 h時間點，10%濃度含藥血漿與對照組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），24 h與48 h時均可抑制PC12的生長，與對照組相比具有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。因此，含藥血漿的作用時間為24 h。

3.2各組凝血酶原（PAR-1）、MEK1、ERK1/2的m-RNA表達熒光定量實時PCR檢測

結果顯示，PC12細胞凝血酶原（PAR-1）、MEK1、ERK1/2 mRNA表達在模型組與空白組相比顯著升高（P＜0.01），解毒化瘀方含藥血漿組的凝血酶原（PAR-1）、MEK1、ERK1/2的mRNA與模型組相比表達均降低（P＜0.01），與PD98059對照組（MEK抑制劑組）比較差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2　各組PAR-1、MEK1、ERK1/2的mRNA表達（灰度值）（x±s，n=5）

3.3各組ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表達

與無血漿空白組比較，模型組P-ERK1/2與ERK1/2顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較PD98059組和解毒化瘀方含藥血漿P-ERK1/2與ERK1/2表達明顯下降（P＜0.01），含藥血漿組與PD98059組（MEK抑制劑組）比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見表3、圖1-2。

表3　免疫熒光相關信號通路ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表達（灰度值）（x±s，n=5）

圖1　ERK1/2蛋白表達熒光圖（×600）

圖2　P-ERK1/2蛋白表達熒光圖（×600）

4　討論

急性缺血性中風的基本病理生理過程由腦血管阻塞和隨之發(fā)生的腦細胞損傷組成，而凝血酶在這個過程中起了關鍵作用。近年來，凝血酶在AIS發(fā)生發(fā)展中的作用受到了學術界的重視［6］，凝血酶不僅是血液凝固血栓形成的關鍵水解酶，而且也通過與蛋白酶活化受體（protease-activated receptor，PAR）結合發(fā)揮對神經(jīng)細胞的毒性作用，因此，以凝血酶為靶點來研究AIS具有重要價值［7］。PAR介導的凝血酶反應在腦損傷中具有雙重作用，凝血酶在低濃度時誘導腦耐受性，在高濃度時對腦細胞產(chǎn)生毒性效應而加重對腦組織的損害，以上過程是通過信號轉導來實現(xiàn)的。ERK1/2信號傳導通路是一條可以被多種因素廣泛激活的有絲分裂原活化蛋白激酶通路。MAPK具有誘導ERK磷酸化的作用，ERK1/2磷酸化可促進神經(jīng)細胞存活，但持續(xù)的磷酸化能導致細胞的凋亡［8］。PD98059為ERK上游激酶MEK1特異性阻斷劑，能夠阻斷ERK1/2信號通路的傳導，可消除凝血酶誘導的ERK1/2激活作用，阻斷凝血酶誘導的腦耐受；在體外用凝血酶處理也能活化ERK1/2，而用PD98059可以完全阻斷用凝血酶預處理后的細胞保護作用［9］。

中醫(yī)認為，缺血性中風多是在內傷積損的基礎上，復因勞逸失度、情志不遂、飲酒飽食或外邪侵襲等觸發(fā)，引起臟腑陰陽失調，氣血逆亂。病理因素多為風、火、痰、氣、瘀［10］。王永炎院士［11］認為本病為毒損腦絡，導致腦絡破損，經(jīng)絡、氣血瘀滯不通，腦脈、神機失養(yǎng)，而出現(xiàn)神昏、肢體麻木、言語不利、半身不遂等癥狀。從臨床發(fā)病特點看，缺血性中風可分為兩個階段，第一階段發(fā)生在腦脈閉阻前，該階段時程較長，是缺血性中風發(fā)病的基礎。由于人體正氣逐漸虧虛，而痰濁、瘀血等多種致病因素也因之緩慢形成，當正虛邪實達到一定程度后，在誘因的作用下導致臟腑陰陽失調、氣血逆亂而致腦脈閉阻。第二個階段發(fā)生在腦脈閉阻后，這個階段時程較短，病情變化迅速。腦脈閉阻，腦髓失養(yǎng)，進而毒邪內生，損絡傷髓，神明失養(yǎng)。腦脈閉阻多責之于瘀，絡損髓傷、神明失養(yǎng)多責之于毒，因此可以認為AIS的基本病機為瘀血阻滯、毒損腦絡，臨床治療當以化瘀解毒為法。

本實驗結果顯示，凝血酶合并缺氧PC12細胞的MEK1、PAR1和ERK1/2的mRNA表達明顯升高，而采用解毒化瘀方含藥血漿干預后能明顯降低細胞MEK1、PAR1和ERK1/2的mRNA表達，含藥血漿組和PD98059阻斷劑組下降程度相當，表明解毒化瘀方能干預ERK信號通路的傳導并有效降低凝血酶原的表達。免疫熒光結果表明，凝血酶合并缺氧可以使P-ERK1/2和ERK1/2的蛋白表達上調，加重細胞的損傷。解毒化瘀方含藥血漿和PD98059均可減少P-ERK1/2和ERK1/2的蛋白表達，抑制神經(jīng)細胞的凋亡。

我們可以推論ERK1/2信號通路參與了神經(jīng)細胞凋亡的過程，是急性缺血性中風的一條重要信號轉導通路。而凝血酶原很可能是其作用的有效靶點。通過阻斷信號通路可以有效的降低細胞損傷。綜上所述，解毒化瘀方對PC12細胞損傷具有保護作用，可為臨床上對急性缺血性中風的治療提供實驗依據(jù)。

［1］中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會，腦血管病學組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國急性缺血性腦卒中診治指南2010［J］.中國全科醫(yī)生，2011，14（12B）：4013-4017

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［8］李強，楊桂英，李峰，等.ERK信號通路在神經(jīng)細胞凋亡中的雙重作用［J］.齊齊哈爾醫(yī)學院報，2014，35（22）：357-59.

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（本文編輯楊瑛）

Effect of Jiedu Huayu Fang on the Expression of ERK1/2 Signaling Pathway in PC12 Cells Injuried by Thrombin and HyPoxia

DENG Yihui，CHENG Shaowu，YI Yaqiao，QIN Hongyu，LI Yin，LI Dingxiang*
（Hunan Provincial Key Laboratory of Prevention and Treatment of Cardio-cerebral Diseases by Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，the Key Laboratory of Cell Biology and Molecular Technology，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

Objective To investigate the molecular mechanism of cerebral vascular occlusion and the mechanism of brain cell damage induced by acute ischemic stroke（AIS）and the protective effect of Jiedu Huayu Fang.Methods（1）PC12 cells were used to establish acute ischemic stroke in vitro.（2）The cells were divided into blank group，model group，Jiedu Huayu Fang serum group and PD98059 group（MEK inhibitor group）.The mRNA expression of MEK1，PAR-1 and ERK1/2 was detected by Real-time PCR，and the protein expression of P-ERK1/2 and ERK1/2 was detected by immunofluorescence assay.Results PCR results indicated that the expression of MEK1，PAR-1 and ERK1/2 mRNA in the model group was significantly higher than that in the blank control group（P＜0.01）.The MEK1，PAR-1 and ERK1/2 mRNA expression in Jiedu Huayu Fang group and PD98059 group was much lower than that of model group（P＜0.01）.Immunofluorescence results show that:the ERK1/2，p-ERK1/2 protein expression of JieDuHuaYuFang group and PD98059 group was much lower than that of model group（P＜0.01）.ConclusionJiedu Huayu Fang，as the molecular targets of thrombin，can significantly reduce the expression of ERK1/2 signaling pathway in acute ischemic stroke.

Jiedu Huayu Fang；acute ischemic stroke；thrombin；ERK1/2 signaling pathway；Huanglian Jiedu Decoction

R285.5；R255.2

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.10.005

2016-03-27

國家自然科學基金（81373508）；湖南省自然科學基金（14JJ2113）；湖南省教育廳項目（16K063）；湖南省中醫(yī)藥科研基金（201606）；中西醫(yī)結合基礎湖南省重點學科資助。

鄧奕輝，女，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，博士研究生導師，研究方向：中西醫(yī)結合防治糖尿病血管并發(fā)癥。

*李定祥，男，副教授，醫(yī)學博士，碩士研究生導師，E-mail：ldxlzy@hotmail.com。