咳喘寧對RSV誘發哮喘大鼠ICAM-1表達的影響

唐力瓊，李英*，羅銀河*，王孟清，舒蘭，譚維，龔細妹，陶洪，彭昕欣

（1.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007）

咳喘寧對RSV誘發哮喘大鼠ICAM-1表達的影響

唐力瓊1，李英2*，羅銀河2*，王孟清2，舒蘭2，譚維1，龔細妹1，陶洪2，彭昕欣2

（1.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007）

目的研究咳喘寧對RSV誘發哮喘大鼠氣道重塑形態學及ICAM-1表達的影響，闡明其防治哮喘的作用機制。方法將60只幼年SD雄性大鼠隨機分為6組，即正常組，模型組，潑尼松與沙丁胺醇治療組（簡稱潑+沙治療組），咳喘寧大、中、小劑量組，每組10只。用卵清蛋白復制大鼠哮喘模型，并予呼吸道合胞病毒（RSV）激發哮喘。大鼠處死后肺組織行HE染色觀察炎癥反應；圖像分析軟件測定支氣管壁厚度及氣道壁面積；免疫組化pv-9000二步法檢測ICAM-1表達水平。結果與模型組相比，各治療組炎癥反應較輕。各治療組支氣管壁厚度及氣道壁面積改變較小，與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；咳喘寧中劑量組較潑+沙治療組作用略差，但差異無統計學意義（P＞0.05）；咳喘寧大、小劑量組與潑+沙治療組相比，其作用明顯較差，有統計學意義（P＜0.05）。各治療組與模型組比較，其肺組織中ICAM-1表達均降低，有顯著性差異（P＜0.01）；潑+沙治療組ICAM-1表達稍低于咳喘寧中劑量組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。結論咳喘寧可有效抑制氣道重塑，其機制可能與降低肺組織中ICAM-1表達有關。

哮喘；咳喘寧；氣道重塑；RSV；ICAM-1；五虎湯；大青葉；黃芪；桃仁

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是小兒常見的呼吸道疾病，在全球范圍內其發病率與死亡率呈逐年上升趨勢。其中85%的兒童哮喘急性發作與病毒感染有關［1］，且呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染所致者可高達78.49%［2］。研究發現，細胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）是多種病毒的受體［3］，ICAM-1上調能增加炎癥的易感性，促進炎癥細胞如嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞通過血液進入炎癥部位，通過促進炎癥因子的黏附和遷移作用介導過敏部位的炎癥反應［4］，從而促進氣道炎癥與氣道高反應性。氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的兩個主要病理學特征。為此，本實驗研究了咳喘寧對哮喘大鼠氣道重塑形態學及ICAM-1表達的影響，觀察咳喘寧對哮喘氣道重塑的直觀效果，闡明其防治哮喘的可能機制。

1　材料

1.1動物

幼年SD雄性大鼠，體質量120～150 g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：4300470011386。

1.2主要試劑與藥物

咳喘寧口服液（湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供，生藥含量0.5 g/mL）；卵清蛋白（OVA，上海麗珠東風公司（sigma分裝），RSV病毒（武漢市武昌區華東試驗試劑公司），ICAM-1血清試劑盒、DAB顯色劑（武漢搏士德生物公司）。

1.3主要儀器

402AI超聲霧化器（江蘇魚躍醫療設備股份有限公司）；NYD 1000型圖文分析儀（同濟醫科大學千屏影像科技公司）。

2　方法

2.1分組及造模

60只大鼠隨機分為6組，即PBS對照組（又稱正常組），模型組，潑尼松與沙丁胺醇治療組（簡稱潑+沙治療組），咳喘寧治療組又分為咳喘寧大、中、小劑量組，每組10只。參照文獻［5］，除正常組外，余五組大鼠分別于第1天和第8天分3處注射共1 mL含10 mg卵清白蛋白和100 mg氫氧化鋁凝膠的無菌抗原液（兩下肢內側皮下各注射0.25 mL，腹腔注射0.5 mL）致敏；第9天至第21天為激發階段，將大鼠放入容積為10 L的霧化箱內，罩的頂面及兩側面分別開一直徑約2.5 cm的圓孔，以1%卵清白蛋白生理鹽水溶液20 mL霧化，每次20 min，隔天霧化1次，連續2周；如發現大鼠精神變差、飲食減少、活動減少、呼吸頻率加快的的現象，提示激發成功，停止激發；第21、35、49天以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后再以滴度為1.0×106空斑形成單位的RSV 50滋L經鼻腔滴入使大鼠感染RSV誘發哮喘，經RSV滴鼻的大鼠出現噴嚏、鼻腔有少量卡他樣無色透明分泌物、弓肩聳背、點頭樣呼吸、腹肌抽搐、甚至站立不穩時即為哮喘急性發作，提示造模成功。正常組以PBS緩沖液代替卵清白蛋白進行腹腔注射、霧化及RSV滴鼻。

2.2治療方法

各治療組在造模完成當天（即第49天）開始灌胃給藥，每日1次，連續7 d，直至處死。用藥劑量按體表面積-劑量換算法將人臨床用藥劑量折算為大鼠用藥劑量，潑尼松、沙丁胺醇治療組予混懸液醋酸潑尼7.0 mg/（kg·d）、沙丁胺醇片劑1.1 mg/（kg·d），咳喘寧大劑量組5.0 g/（kg·d），咳喘寧中劑量組2.5 g/（kg·d），小劑量組1.25 g/（kg·d），正常組及模型組予蒸餾水灌胃，每日灌胃1次。各治療組藥物均以蒸餾水稀釋，各組灌胃容量均為10 mL/（kg·d）。

2.3標本制備

治療7 d后所有大鼠予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔內注射麻醉，麻醉完立即開腹，行腹主動脈取血后，迅速分離氣管，并做氣管切開插管固定，結扎右主支氣管，予左支氣管肺組織內灌入PBS緩沖液，反復抽吸，收集肺泡灌洗液后，取右肺。將右肺下葉予4%甲醛固定保存，脫水，透明，包埋，切片厚約4～5滋m，每個標本制備兩份切片。

2.4觀測指標

2.4.1病理觀察取一份切片行蘇木精-伊紅（HE）染色，干后光學顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織的病理形態學變化。采用NYD 1 000型圖像分析軟件測定完整小氣道支氣管內周長（Pi）、管壁厚度（d）、外腔面積（Ao）、內腔面積（Ai）、氣道壁面積（WA）。其中WA= Ao-Ai。測量結果用內周長（Pi）進行標準化，支氣管壁厚度表示為d/Pi（%），氣道壁面積表示為WA/Pi2（%）。

2.4.2ICAM-1的測定取另一份切片用免疫組化pv-9 000二步法檢測ICAM-1含量：脫蠟、水化組織切片；3%雙氧水室溫孵15 min以阻斷內源性過氧化物酶；PBS修復液置微波爐修復抗原及漂洗；滴加一抗兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗體1∶100稀釋；加二抗Envision兔鼠通用型檢測系統，稀釋濃度亦為1∶100。二氨基聯苯胺（DAB）顯色，鏡下控制，蘇木精復染，脫水、透明、封片。高倍鏡下觀察，棕黃色為陽性顯色。運用圖文分析儀測定ICAM-1陽性表達所占面積百分比即平均光密度值（OD）。

2.5統計學方法

實驗數據運用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，各分組所得計量數據采用“x±s”表示，對樣本數據進行正態性及方差齊性檢驗，方差齊時用單因素方差分析及組間的多重比較進行統計分析；方差不齊時，用非參數秩和檢驗，P＜0.05為有統計學意義，P＜0.01為差異有統計學意義。

3　結果

3.1病理觀察

模型組可見支氣管壁及其周圍有大量炎癥細胞浸潤，支氣管黏膜水腫、增厚，上皮細胞壞死脫落，細胞排列紊亂，管腔變窄，管腔內分泌物增多。正常組、潑+沙治療組及咳喘寧治療組炎癥反應較模型組明顯減輕。正常組、潑+沙治療組及咳喘寧治療組小氣道支氣管壁厚度及氣道壁面積較模型組相比均降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；咳喘寧中劑量組較潑+沙治療組作用略差，但差異無統計學意義（P＞0.05）；咳喘寧大、小劑量組與潑+沙治療組相比，其作用明顯較差，有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

3.2肺組織中ICAM-1水平的比較

正常組及各治療組與模型組比較，其肺組織中ICAM-1表達均降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；從肺組織免疫組化DAB染色切片中可看出ICAM-1主要表達于內皮細胞、上皮細胞及成纖維細胞，其中以內皮細胞表達增加最為明顯。潑+沙治療組與咳喘寧中劑量組優于咳喘寧大、小劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）；潑+沙治療組與咳喘寧中劑量相比，ICAM-1表達稍低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖2。

表1　各組大鼠小氣道支氣管壁厚度、氣道壁面積及肺組織中ICAM-1平均光密度均值的比較（x±s）

圖1　各組肺組織HE染色光鏡圖（×400）

圖2　各組肺組織ICAM-1免疫組化DAB顯色光鏡圖（×400）

4　討論

支氣管哮喘是由多種細胞包括氣道的炎性細胞和結構細胞（如嗜酸粒細胞（EOS）、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等）和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。氣道重塑是哮喘發病的病理性改變，是不可逆性氣流阻塞、氣道高反應（AHR）及肺功能持續性、進行性損傷的主要原因，并可形成頑固性哮喘。研究表明，哮喘患者氣道壁面積及厚度均較正常組明顯升高，且其氣道壁厚度與哮喘嚴重程度呈正相關［6］。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員，廣泛表達于白細胞、內皮細胞、上皮細胞及成纖維細胞。靜息狀態下ICAM-1呈低水平表達或不表達，炎癥發生時分泌釋放的多種炎性介質、細胞因子都會不同程度地刺激上皮細胞、內皮細胞活化，使ICAM-1表達增加，其主要作用是維持機體器官的結構穩定和參與機體的免疫反應［7］。ICAM-1在肺組織有表達。在OVA致敏的哮喘大鼠實驗中，ICAM-1基因缺陷的大鼠與野生型大鼠相比較，氣道以及肺組織的炎癥明顯減輕，氣道高反應性顯著降低［8］。降低肺組織中ICAM-1表達，可抑制哮喘氣道炎癥細胞浸潤及氣道高反應性。既往的研究認為ICAM-1作為“痰證”變化的指標，“血瘀證”與血液流變學密切相關。喻氏等［9］測定大鼠哮喘模型血漿ICAM-1、血液流變學全血黏度等西醫學指標，直觀地展現出來其與氣道重塑指標的相關性，表明中西醫對哮喘發病機制的認識是吻合的，提示“痰瘀伏肺”與哮喘氣道重塑的相關性，賦予哮病“痰瘀伏肺”宿根理論科學內涵。袁雪晶認為哮喘治療中，及早察覺到血瘀之征，靈活運用活血化瘀藥物，痰瘀并治，使痰祛瘀化，氣道暢通，哮喘乃平［10］。實驗證明痰瘀同治具有減輕和控制咳嗽變異性哮喘氣道重塑的作用，且對大鼠血清中IL-1，TGF-β1及NF-κB表達的抑制，痰瘀同治組優于模型組、輔舒酮組、健脾化痰組、行氣化瘀組，差異均有統計學意義（P＜0.05）［11］。

咳喘寧是以清熱化痰平喘的傳統古方五虎湯為基本方，加大青葉、黃芪、桃仁組成。方中炙麻黃乃“喘家圣藥”，入肺、膀胱經，可外開皮毛之郁閉，以使肺氣宣暢，內降上逆之氣，以復肺司肅降之常，善平咳喘；苦杏仁味苦性微溫，能降肺氣平喘止咳，《藥性論》謂之：“主咳逆上氣喘促”，且杏仁助麻黃止咳平喘，疏肺利氣。二藥有宣有降，可祛除外邪，暢通氣道，從而降低氣道反應性，共為本方君藥。生石膏味辛甘性大寒，歸肺、胃經，功在清瀉肺熱以生津，辛散解肌以透邪；大青葉味苦性寒，能清泄內熱；黃芪味甘性微溫，歸肺、脾經，功在補氣健脾、扶正祛邪，三藥合用可清熱健脾益氣，共為本方臣藥。桃仁功在活血化瘀，且可止咳平喘；細茶葉功在醒神化痰；甘草鎮咳平喘，并可調和諸藥，共為本方佐使。諸藥合用，共奏發表清熱，化痰平喘，活血化瘀等功效。前期研究表明，咳喘寧治療病毒誘發兒童哮喘具有較好療效，無論是總有效率還是臨床控制率，均明顯優于對照組［12］。本實驗結果顯示：咳喘寧可有效抑制哮喘大鼠支氣管內及其周圍肺組織的炎癥細胞浸潤，減少支氣管黏膜水腫及其管腔內分泌物，并可抑制哮喘大鼠的支氣管壁增厚及氣道壁面積增大，從而抑制氣道重塑。另一方面咳喘寧可通過抑制肺組織中ICAM-1表達，抑制炎癥因子的黏附和遷移，從而改善RSV誘發哮喘的氣道炎癥及氣道重塑。無論是從支氣管形態學角度還是從抑制氣道重塑機制方面而言，咳喘寧中劑量組明顯優于咳喘寧大、小劑量組（P＜0.05）；咳喘寧大劑量組稍優于咳喘寧小劑量組，但兩者差異無統計學意義。

綜上表明，咳喘寧可抑制肺組織中ICAM-1在細胞上的表達，使之與病毒的結合減少，從而降低氣道高反應性；同時由于上皮細胞和內皮細胞中ICAM-1表達降低，減少了炎癥細胞如嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞通過血液進入炎癥部位，抑制了炎癥因子的黏附和遷移作用，阻礙了黏附因子直接參與變態反應的炎癥反應中，從而緩解氣道慢形炎癥、抑制氣道重塑。同時本實驗為哮病“痰瘀伏肺”宿根理論提供依據及為痰瘀并治法在病毒誘發哮喘中的作用提供可行性證據。

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（本文編輯楊瑛）

Effect of KeChuanNing on Expression of ICAM-1 in Asthma Rats Induced by RSV

TANG Liqiong1，LI Ying2*，LUO Yinhe2*，WANG Mengqing2，SHU Lan2，TAN Wei1，GONG Ximei1，TAO Hong2，PENG Xinxin2
（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410218，China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China）

Objective To explore the effect of KeChuanNing on airway remodeling morphology and the expression of ICAM-1 in asthma rats induced by RSV，and clarify the mechanism of prevention and treatment.Methods The 60 SD male rats were randomly divided into 6 groups:normal group，model group，prednisone and salbutamoll treatment group（PS treatment group）and KeChuanNing high，medium and low dose groups，with 10 rats in each group.The asthma rats models were copied by ovalbumin and the asthma was stimulated by respiratory syncytial virus.The lung tissue pathological changes were observed by HE staining.The bronchial wall thickness and airway wall area were setermined by image analysis software. The expression of ICAM-1 was detected by using immunohistochemistry pv-9000 method.Results Compared with the model group，the inflammatory reaction in treatment groups was less；the bronchial wall thickness and airway wall area were smaller，the difference was statistically significant（P＜0.01）.The function of KeChuanNing medium dose group was slightly weak than the PS treatment group，but the difference was not statistically significant（P＞0.05）.Compared with PS treatment group，the effect of the KeChuanNing high，low dose group was poor and had statistical significance（P＜0.05）.Compared with the model group，the lung tissue ICAM-1 expression in the treatment groups was decreased，the difference was significant（P＜0.01）.The expression of ICAM-1 in PS treatment group was slightly lower than KeChuanNing medium dose group，but the difference was not statistically significant（P＞0.05）.Conclusion KeChuanNing could effectively inhibit airway remodeling，the mechanism may be related with inhibiting the expression of ICAM-1 in lung tissue.

asthma；Kechuanning；airway remodeling；respiratory syncytial virus；intercellular adhesion molecule-1；Wuhu Decoction；folium isatidis；Astragalus membranaceus；peach seed

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.10.007

2016-04-03

國家自然科學基金（81674025）；湖南省自然科學基金資助項目（14JJ3120）。

唐力瓊，女，在讀碩士研究生，主要研究方向：小兒呼吸系統疾病。

*李英，女，主治醫師，E-mail:120812828@qq.com；羅銀河，女，副教授，碩士研究生導師，E-mail:1286313109@qq.com。