TTC比色法篩選高存活率的畢赤酵母突變株

劉勝男，張　燕，劉泰瑜，許　可，張建國

(上海理工大學 食品科學與工程研究所，上海 200093)

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TTC比色法篩選高存活率的畢赤酵母突變株

劉勝男，張燕，劉泰瑜，許可，張建國

(上海理工大學 食品科學與工程研究所，上海 200093)

采用TTC比色法篩選高存活率畢赤酵母NTG突變株，探討了pH值、菌體濃度(OD600)、反應時間、細胞存活率等對TTC顯色反應的影響，并與平板計數法進行比較。結果表明，在pH值為4.0～7.0或菌體濃度(OD600)低于50.00時，pH值、OD600均與1,3,5-三苯基甲臜(TPF)生成量(OD485)呈線性正相關關系；反應時間超過9 h后可以保持穩定的TPF生成量；死細胞對TTC顯色反應無干擾，在細胞存活率低于50%時，仍然可以采用TTC比色法測定細胞活性。表明，TTC比色法在一定范圍內可以篩選高存活率畢赤酵母突變株，且操作簡單省時，為篩選高存活率的微生物菌株提供了可靠技術。

TTC比色法；畢赤酵母；存活率；優化；亞硝基胍；篩選

畢赤酵母是一種重要的工業微生物，以畢赤酵母為對象研究工業微生物中的共性問題具有重要的示范意義。畢赤酵母是具有良好應用前景的細胞工廠，尤其是在高效表達外源蛋白質方面受到研究者的重視[1]，目前已報道有600多種外源蛋白質在畢赤酵母中成功表達，畢赤酵母表達的外源蛋白在食品工業的應用潛力巨大[2]。畢赤酵母的優點是：基因操作和培養技術簡單、成熟，可以分泌表達不同來源的基因[3]，有與人相近的蛋白質糖基化系統[4]，高密度發酵(130g·L-1)。

目前，畢赤酵母高密度發酵的主要方式是控制溶氧和流加碳源的濃度：(1)控制溶氧濃度在20%以上可以保證畢赤酵母具有一定的代謝甲醇的能力[5]，但受甲醇濃度、攪拌、通氣等因素的影響，控制穩定的溶氧濃度較困難[6]，若溶氧濃度過高會導致細胞死亡[7]；另外，以傳感器測定甲醇濃度[8]、建立生長模型[9]、調整進氣口的氧分壓[6]等方式控制溶氧濃度會使發酵液變為非牛頓流體而干擾溶氧的測定[7]，導致發酵過程失敗。(2)控制流加碳源(甲醇)濃度。在MutS型畢赤酵母的誘導過程中甲醇濃度一般控制在0.2%～0.8%[10]，Mut+型畢赤酵母的誘導過程中甲醇濃度一般控制在3%[11]。

由于畢赤酵母以甲醇為碳源的比生長速率較低(0.002～0.14h-1)，從而限制了外源蛋白的表達[12]，細胞死亡率達到35%[13]， 提高微生物細胞存活率因此成為近年來的研究重點[14]。不同學者報道的畢赤酵母高密度發酵過程中細胞存活率有所不同。Xiao等[15]在培養畢赤酵母時發現畢赤酵母的細胞存活率在74%～91%之間；Hohenblum等[13]以批式流加方式培養畢赤酵母時，畢赤酵母的細胞存活率低于70%；Routledge等[16]搖瓶培養畢赤酵母時，細胞存活率達到100%，這可能與分批培養畢赤酵母的培養時間較短有關。

目前，提高細胞存活率的方法有很多，如利用轉錄因子提高細胞適應耐受環境的壓力、利用TATA結合蛋白和σ70提高釀酒酵母耐受酒精的能力[17]、利用產物泄露的方式降低產物對細胞的毒性、動態控制蛋白質的表達和平衡細胞中的代謝過程，但這些方法都需要復雜的技術[17]。而亞硝基胍(NTG)誘變方法較為成熟，操作簡單[18]，是提高細胞存活率的有效途徑。采用人工細胞計數篩選高存活率突變株工作量大、誤差大，因此，需要尋找一種簡單的篩選方法。基于2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)可利用細胞呼吸鏈中的脫氫酶還原為紅色的1,3,5-三苯基甲臜(TPF)[19]，可用TTC比色法篩選[20]。為此，作者采用TTC比色法篩選高存活率的畢赤酵母NTG突變株，探討了pH值、菌體濃度、反應時間、細胞存活率等對TTC顯色反應的影響，并與平板計數法進行了比較。

1　實驗

1.1菌種與培養基

畢赤酵母GS115，購于生命科學公司(Waltham,MA,USA)。

YPD培養基：酵母粉 10g·L-1，蛋白胨 20g·L-1，葡萄糖 20g·L-1，瓊脂粉15g·L-1(平板培養時添加)。

BMGY培養基: 酵母粉 10g·L-1，蛋白胨 20g·L-1，磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)100mmol·L-1，甘油 20g·L-1，硫酸銨 20g·L-1，生物素4×10-4g·L-1。

1.2畢赤酵母的培養

將25% 甘油保存的畢赤酵母轉接到YPD平板培養基上，30 ℃培養3d；然后轉接到含有25mLYPD培養基的250mL三角瓶中，30 ℃、200r·min-1培養18～20h；再以4%接種量轉接到含有25mLBMGY培養基的250mL三角瓶中，30 ℃、200r·min-1培養2d后每24h加入1.0%甲醇誘導3d。

1.3畢赤酵母的NTG誘變

參照文獻[21]進行NTG誘變：10mL畢赤酵母經BMGY培養2d后的菌體濃度(OD600)約為30.00；用100mmol·L-1檸檬酸緩沖液(pH值5.5)洗滌2次后，重懸于10mL100mmol·L-1檸檬酸緩沖液中；加入NTG使終濃度為500μg·mL-1，誘變30min，得到致死率約為88%的畢赤酵母細胞。

1.4TTC顯色反應條件探討

1.4.1pH值對TTC顯色反應的影響

取1.0 mL菌液，10 000 r·min-1離心1 min，去上清，加入1.0 mL含0.4%TTC的pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的100 mmol·L-1Tris緩沖液，振蕩混勻，置于搖床上12 h；10 000 r·min-1離心1 min，去上清，加入1.0 mL的85%二甲基亞砜，振蕩混勻；10 000 r·min-1離心1 min，取上清液測OD485。

1.4.2菌體濃度對TTC顯色反應的影響

分別取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL菌液(菌體濃度在5.71～57.12之間)，10 000 r·min-1離心1 min，去上清，加入1.0 mL含0.4%TTC的pH值為8.0的100 mmol·L-1Tris緩沖液，振蕩混勻，置于搖床上12 h；10 000 r·min-1離心1 min，去上清，加入1.0 mL的85%二甲基亞砜，振蕩混勻；10 000 r·min-1離心1 min，取上清液測OD485。

1.4.3反應時間對TTC顯色反應的影響

取1.0 mL菌液于2.0 mL離心管中，10 000 r·min-1離心1 min，去上清，加入1.0 mL含0.4%TTC的pH值為8.0的100 mmol·L-1Tris緩沖液，振蕩混勻，置于搖床上12 h，期間每隔1 h對菌液進行10 000 r·min-1離心，去上清，加入1.0 mL的85%二甲基亞砜后振蕩混勻；10 000 r·min-1離心1 min，取上清液測OD485。

1.4.4細胞存活率對TTC顯色反應的影響

將畢赤酵母活細胞和高溫滅活的酵母死細胞混合，得到不同存活率的菌液，畢赤酵母細胞的終體積為2.0 mL。按上述方法進行TTC顯色反應，測OD485。

1.5TTC比色法篩選高存活率畢赤酵母NTG突變株

首先測定NTG誘變后畢赤酵母菌株的TTC顯色反應的吸光度(OD485)，再利用OD485值和活細胞數目之間的關系計算活細胞數目，最后計算畢赤酵母細胞的存活率。

2　結果與討論

2.1pH值對TTC顯色反應的影響(圖1)

圖1　pH值對TTC顯色反應的影響Fig.1　Effect of pH value on TTC colorimetric reaction

由圖1可以看出，畢赤酵母生長的pH值范圍為4.0～8.0，在此范圍內，TPF的生成量(OD485)隨著pH值的升高而升高；其中，在pH值為4.0～7.0范圍內pH值與OD485呈線性正相關關系(OD485=0.1007×pH值-0.3019，R2=0.9922)。表明，低pH值條件下畢赤酵母細胞的呼吸活性較低，升高pH值有利于提高畢赤酵母細胞的呼吸活性。由圖1還可以看出，在畢赤酵母可以生長的pH值范圍內都可以用TTC顯色反應來測定細胞活性。

2.2菌體濃度對TTC顯色反應的影響(圖2)

由圖2可以看出，pH值8.0條件下，OD485隨著畢赤酵母菌體濃度(OD600)的升高(從5.71升高到57.12)而升高，且OD485與OD600呈線性正相關關系(OD485=0.0089×OD600+0.0615，R2=0.9264)。表明，菌體濃度(OD600)在5.71～57.12范圍內都可以用TTC顯色反應測定畢赤酵母細胞活性。由于畢赤酵母在搖瓶中培養的菌體濃度(OD600)最高為50.00[22]，所以采用TTC比色法可以不稀釋菌體濃度直接測定畢赤酵母細胞活性，簡化了操作步驟。

圖2　菌體濃度對TTC顯色反應的影響Fig.2　Effect of OD600 value on TTC colorimetric reaction

2.3反應時間對TTC顯色反應的影響(圖3)

圖3　反應時間對TTC顯色反應的影響Fig.3　Effect of reaction time on TTC colorimetric reaction

由圖3可以看出，隨著反應時間的延長，OD485不斷升高；當反應時間超過9 h后，OD485保持不變。表明，反應時間超過9 h可以保持穩定的TPF生成量，也可以避免后續操作中反應時間對TTC顯色反應的影響。

2.4細胞存活率對TTC顯色反應的影響(圖4)

圖4　細胞存活率對TTC顯色反應的影響Fig.4　Effect of cell viability on TTC colorimetric reaction

由圖4可以看出，在細胞存活率小于50%的情況下，隨著細胞存活率的升高，OD485逐漸升高，且OD485與細胞存活率呈線性正相關關系(OD485=0.0127×細胞存活率-0.0483，R2=0.9589)。表明采用TTC比色法可以在細胞存活率低于50%的條件下測定畢赤酵母細胞活性，說明死細胞對TTC比色法的干擾不明顯。

2.5TTC比色法篩選高存活率畢赤酵母NTG突變株

隨機選取20株NTG誘變的畢赤酵母菌株，用TTC比色法測定OD485/OD600值(表征細胞存活率)，結果如圖5所示。

由圖5可知，OD485/OD600值的最低值為37.82，最高值為69.13。

將OD485/OD600值最高的14#突變株培養后分別畢赤酵母的OD485/OD600值采用TTC比色法和平板計數法測定細胞存活率，并與畢赤酵母GS115進行比較，結果見圖6。

圖5TTC比色法測定NTG誘變后的

Fig.5OD485/OD600value ofPichiapastorismutated by NTGviaTTC colorimetric method

圖6　TTC比色法(a)與平板計數法(b)測定的畢赤酵母細胞存活率Fig.6　Cell viability of Pichia pastoris via TTC colorimetric method(a) and plate counting method(b)

由圖6可以看出，采用TTC比色法測得GS115菌株和14#NTG誘變菌株的OD485/OD600值分別為53.00、58.23；采用平板計數法測得GS115菌株和14#NTG誘變菌株的存活率分別為48.10%、61.68%。表明TTC比色法能準確描述畢赤酵母細胞的存活率。

2.6討論

誘變和篩選具有耐受環境或者特殊形狀的工業微生物是目前的研究熱點。誘變法分為化學法、物理法、空間技術、基因工程等。通過各種誘變手段改變菌體的遺傳性狀后，從數量龐大的突變菌種庫中篩選目標菌種是最關鍵的步驟，決定能否得到目的突變株，也決定了誘變效率。由于微生物種類和誘變篩選的目的形狀的多樣性，篩選方法也有所不同，主要有抗性篩選、熒光標記篩選、PCR技術篩選。對篩選菌株活性的測定大多采用稀釋涂平板法，該方法非常費時費力。本研究以TTC比色法代替稀釋涂平板法，簡單省時；利用酶標儀可以同時測定近百個樣品，提高了測定效率，但TTC比色法仍需要對每一個菌株進行測定，這也是需要進一步改進的地方。

3　結論

采用TTC比色法篩選高存活率畢赤酵母NTG突變株，探討了pH值、菌體濃度(OD600)、反應時間、細胞存活率等對TTC顯色反應的影響，并與平板計數法進行了比較。結果表明，在pH值為4.0～7.0、菌體濃度(OD600)低于50.00時，pH值、OD600均與1,3,5-三苯基甲臜(TPF)生成量(OD485)呈線性正相關關系；反應時間超過9 h后可以保持穩定的TPF生成量；死細胞對TTC顯色反應無干擾，在細胞存活率低于50%時，仍然可以采用TTC比色法測定細胞活性。表明，TTC比色法在一定范圍內可以篩選高存活率畢赤酵母突變株，且操作簡單省時，為篩選高存活率的微生物菌株提供了可靠技術。

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Screening of High Cell ViabilityPichiapastorisMutant by TTC Colorimetric Method

LIU Sheng-nan,ZHANG Yan,LIU Tai-yu,XU Ke,ZHANG Jian-guo

(InstituteofFoodScienceandEngineering,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China)

HighcellviabilityPichia pastorismutantwasscreenedbyTTCcolorimetricmethod.TheeffectsofpHvalue,celldensity(OD600),reactiontime,cellviabilityonTTCcolorimetricreactionwereinvestigated,andcomparedwiththeplatecountingmethod.ResultsindicatedthatOD485of1,3,5-triphenylformazan(TPF)wasproportionalrelatedtothepHvalue(4.0～7.0)orOD600(below50.00).AndtheproductionofTPFremainedstableafterreactionfor9h.Deadcellsdidnotinterferewithcolorimetricreaction.SoTTCcolorimetricmethodcouldbeusedtodetectcellactivityevenwhenthecellviabilitywasbellow50%.TTCcolorimetricmethodcouldbeappliedinscreeningofhighcellviabilityPichia pastorismutantwithinacertainrange,anditwassimpleandtime-saving.Insummary,TTCcolorimetricmethodprovidedareliableapproachforscreeningofhighcellviabilitystrain.

TTCcolorimetricmethod;Pichia pastoris;viability;optimization;NTG;screening

國家自然科學基金資助項目(21306112)，上海市自然科學基金資助項目(13ZR1429100)，上海高校青年教師培養資助計劃項目(slg14037)，教育部留學回國人員科研啟動基金資助項目，上海理工大學研究生創新基金資助項目，微創勵志創新基金資助項目(YS30808007)

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.10.004

Q 815

A

1672-5425(2016)10-0018-05

劉勝男，張燕，劉泰瑜，等.TTC比色法篩選高存活率的畢赤酵母突變株[J].化學與生物工程，2016，33(10)：18-22.