副溶血性弧菌16S rRNA基因序列變異規(guī)律分析

馮　博，　藍(lán)　英，　孫曉紅，　張煒佳，　潘迎捷，　趙　勇*

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306）

副溶血性弧菌16S rRNA基因序列變異規(guī)律分析

馮博1，2，3，藍(lán)英1，2，3，孫曉紅1，2，3，張煒佳1，2，3，潘迎捷1，2，3，趙勇*1，2，3

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306）

通過對(duì)副溶血性弧菌16S rRNA基因序列進(jìn)行深度分析，研究其序列變異特點(diǎn)，為開發(fā)新的分型溯源靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。對(duì)111株分離自生鮮水產(chǎn)品的副溶血性弧菌16S rRNA基因測(cè)序，與GenBank中已有的副溶血性弧菌16S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)分析，對(duì)變異度比較大的序列建立了系統(tǒng)發(fā)育樹，深入分析了基因的變異規(guī)律，并使用ERIC-PCR方法加以驗(yàn)證。不同副溶血性弧菌菌株16S rRNA基因變異主要集中在可變區(qū)V1和V2區(qū)，50～270 bp的區(qū)域內(nèi)有38個(gè)堿基的相似度小于30%，103個(gè)堿基的相似度在30%～100%。另外，在V3區(qū)和V8區(qū)也各有1個(gè)堿基有比較明顯的差異。副溶血性弧菌16S rRNA基因序列具有一定的變異性，該結(jié)果為副溶血性弧菌菌株分型溯源分析提供新的靶點(diǎn)奠定研究基礎(chǔ)，同時(shí)為其微進(jìn)化研究奠定理論基礎(chǔ)。

副溶血性弧菌；16S rRNA基因序列；ERIC-PCR聚類分析；變異規(guī)律分析

副溶血性弧菌（Vibiro parahaemolyticus）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛分布于各種淡水、海水、河口等水生環(huán)境，是水產(chǎn)品中最主要的食源性致病菌之一，極易引起腸道疾病［1-2］。自從1950年在日本首次發(fā)現(xiàn)V.parahaemolyticus以來，世界各地尤其是沿海地區(qū)都出現(xiàn)過不同程度的疾病爆發(fā)，造成了極大的安全隱患。準(zhǔn)確地對(duì)V.parahaemolyticus進(jìn)行分離鑒定，無論對(duì)于預(yù)防和治療疾病、控制病菌傳播還是研究病菌致病機(jī)理都具有重要的意義。

16S rRNA基因序列長(zhǎng)約1.5 kb，具有高度的保守性和特異性，常被用于原核微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)方面的研究［3］。近年來隨著PCR及相關(guān)基因工程技術(shù)的發(fā)展，16S rRNA作為原核生物分類的重要分子標(biāo)記，在細(xì)菌鑒定相關(guān)工作中起到重要作用［4-6］。然而16S rRNA基因區(qū)分細(xì)菌的能力僅限于種的水平［7］，菌株之間的差異往往難以通過16S rRNA基因序列的分析做出判斷。因此，我們?cè)噲D通過分析同種不同株之間V.parahaemolyticus 16S rRNA基因序列的差異，找出可以用于株間差異分析的靶點(diǎn)。為此，對(duì)作者所在實(shí)驗(yàn)室近年來分離自生鮮水產(chǎn)品中的111株V.parahaemolyticus的16S rRNA基因進(jìn)行了測(cè)序分析，通過比對(duì)序列分析基因的變異規(guī)律，并通過ERIC-PCR的方法對(duì)菌株間的差異進(jìn)行了驗(yàn)證，為水產(chǎn)品中副溶血性弧菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分型溯源奠定研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

本研究所用的V.parahaemolyticus O3：K6購自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，其余111株由上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室分離并保藏。

PCR儀：德國(guó)eppendorf公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-rad公司；Synergy多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)Biotek公司；超凈臺(tái)、生物安全柜：荷蘭ESCO公司；Elix/Rios純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司。

1.2副溶血性弧菌的分離和鑒定

生鮮水產(chǎn)品河蝦和南美白對(duì)蝦 （分別記為a，b），于2013年4～7月采集自上海3個(gè)主要的水產(chǎn)市場(chǎng)（分別記為A，B，C）。分別稱取每個(gè)樣品25 g至均質(zhì)袋，加入 225 mL堿性蛋白胨水（Alkaline Peptone Water，APW）培養(yǎng)液拍打2 min，記為樣品原液。吸取1 mL原液至9 mL APW中，依次10倍稀釋7個(gè)梯度，每個(gè)梯度3個(gè)平行，37℃、170 r/min搖床培養(yǎng)18 h。每支試管挑取一環(huán)劃線至科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)24 h。每個(gè)平板挑取3個(gè)菌落劃線至胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（Tryptic Soy Agar，TSA）平板，37℃倒置培養(yǎng)24 h。每個(gè)TSA平板挑取1個(gè)單菌落至胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（Tryptic Soy Broth，TSB）試管中，37℃、170 r/min搖床培養(yǎng)12 h。吸取2mL菌液提取細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行tdh、trh和tlh基因PCR鑒定。鑒定為陽性的TSB管吸取1mL菌液，混入1 mL甘油凍入-80℃冰箱保存。

1.3細(xì)菌基因組DNA的制備

實(shí)驗(yàn)用菌株使用前由-80℃冰箱中取出，室溫解凍，用含3%NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）液體培養(yǎng)基活化兩次，劃線于TCBS瓊脂培養(yǎng)基平板，37℃倒置培養(yǎng)至有單菌落形成。挑取單菌落至含3%NaCl的TSB液體培養(yǎng)基，180 r/min、37℃過夜培養(yǎng)。使用TIANgen細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株基因組DNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和酶標(biāo)儀對(duì)獲得基因組DNA進(jìn)行簡(jiǎn)要的定性定量分析。

1.4細(xì)菌16S rRNA基因的制備及系統(tǒng)發(fā)育分析

細(xì)菌 16S rRNA基因擴(kuò)增使用常用的 27F/ 1492R引物對(duì)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)數(shù)為25。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物純化后交由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。使用Geneious軟件對(duì)所得序列進(jìn)行拼接、比對(duì)工作。將測(cè)序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得基因登錄號(hào)，通過BLAST進(jìn)行相關(guān)的序列搜索，獲得相似基因的序列。用MEGA v.5.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)化距離采用neighboor-joining法，進(jìn)化樹分支的置信度采用bootstrap法，重復(fù)次數(shù)為1 000。

1.5細(xì)菌基因組ERIC-PCR分型

在對(duì)所測(cè)111株V.parahaemolyticus 16S rRNA基因序列分析的基礎(chǔ)上，選取變異度較大的8株、保守性較好的7株V.parahaemolyticus以及O3：K6作為研究對(duì)象，對(duì)其基因組進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增，比較菌株之間的差異。ERIC-PCR引物序列為ERIC-F：ATGTAAGCTCCTGGGATTCAC；ERIC-R：AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。ERIC-PCR ERIC-PCR擴(kuò)增所用引物由生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性7min，94℃變性1min，52℃退火1min，65℃延伸8min，循環(huán)數(shù)為30。ERIC-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2 g/dL瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，120 V、30min，溴化乙錠染色15 min，Bio-Rad凝膠成像儀進(jìn)行拍照，用Image Lab軟件分析圖譜。上述實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)一次。電泳結(jié)果使用Image lab軟件進(jìn)行條帶分析，同一位置條帶陽性記為“1”，陰性記為“0”，NTSYS 2.10e軟件進(jìn)行聚類分析。

2　結(jié)果與分析

2.116S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果及分析

將實(shí)驗(yàn)室分離自生鮮水產(chǎn)品的111株V.parahaemolyticus的 16S rRNA基因序列與V.parahaemolyticus標(biāo)準(zhǔn)菌株RIMD2210633 strain O3：K6的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示在整個(gè)16S rRNA基因長(zhǎng)1 465 bp的區(qū)域內(nèi)，所有序列的相似度均在97%以上，證明所有分離的菌株均為副溶血性弧菌。相似度較低的序列（97%～99%）為：514（Ab422）、516（Ab533）、517（Ab431）、518（Ba221）、523（Ba222）、556（Bb331）、557（Ab523）、567（Bb413），見圖1。

觀察序列比對(duì)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，大部分序列差異主要集中在16S的V1（69～99 bp）和V2（137-242）區(qū)。由于序列間的差異較大，序列拼接結(jié)果中有多個(gè)空位存在，在50～270 bp的區(qū)域內(nèi)，有38個(gè)位點(diǎn)的堿基的相似度＜30%，103個(gè)位點(diǎn)的堿基的相似度在30%～100%之間。在V3區(qū)519 bp處 （對(duì)應(yīng)V.parahaemolyticus 16S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)序列中464 bp，下同）的堿基85.7%為G，22.3%為A。V8區(qū)1 326 bp（1 266 bp）的堿基也有比較明顯的差異，為49.4%的序列在此的堿基為A，其余50.6%的序列在此為G。另外，由于少數(shù)菌株的序列差異，在比對(duì)形成的保守序列中有多處空位的存在。其中比較有特點(diǎn)的除了上述8株（identity低于99%）在V1和V2區(qū)形成的多處空位之外，還有 531（Cb411）、615（Cb421）和644（Bb311），由于它們?cè)赩3區(qū)的序列差異，分別在522 bp（467 bp）和535 bp（479 bp）處形成了2個(gè)明顯的gap。菌株621（Aa311）在987 bp（928 bp）和992 bp（933 bp）處也有明顯的兩處空位。

目前在研究菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析方面，多采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析，大多數(shù)研究都是擴(kuò)增16S rRNA的V3可變區(qū)進(jìn)行DGGE指紋圖譜分析［8-13］。近年來，也有關(guān)于比較擴(kuò)增16S rRNA不同區(qū)域進(jìn)行DGGE分析的報(bào)道［14］。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在副溶血性弧菌的分型和多樣性研究工作中，V1和V2區(qū)比V3區(qū)具有更好的變異性，可能更適合PCR-DGGE的分型和多樣性分析工作。

2.2變異度較大菌株變異規(guī)律分析及其ERICPCR聚類分析

通過16S序列比對(duì)，編號(hào)為514（Ab422）、516（Ab533）、517（Ab431）、518（Ba221）、523（Ba222）、556（Bb331）、557（Ab523）、567（Bb413）的8株菌與包括RIMD2210633標(biāo)準(zhǔn)菌株在內(nèi)的其他菌株具有較大差異。此8株副溶血性弧菌的相似度均在97% -99%之間，而其他菌株的相似度均在99%以上。另外，從菌株16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果也能明顯看出，此8株菌的16S rRNA基因序列在V1和V2區(qū)與其他序列具有較大差異。對(duì)此，我們通過建立系統(tǒng)發(fā)育樹比較其序列的差異性。選取此8株菌和其他7株差異較小的菌株（相似度＞99%）以及O3：K6標(biāo)準(zhǔn)菌株，基于這16株菌的16S rRNA基因序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。實(shí)驗(yàn)中所選取的差異較小的 7株菌株編號(hào)分別為：648（Ab421）、623（Ba532）、638（Aa211）、651（Bb621）、566（Ab613）、564（Cb611）、513（Ca521）。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，此16株菌均屬于弧菌屬，與它們親緣關(guān)系較近的多數(shù)為副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和天藍(lán)色弧菌（Vibrio azureus）。雖然在這16株菌雖然存在不同程度的序列變異，但是通過16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，它們?nèi)钥杀粴w為弧菌屬的菌種。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)菌株RIMD2210633與111株V.parahaemolyticus 16SrRNA基因序列比對(duì)結(jié)果Fig.1　A lignment of 16S rRNA gene of V.parahaemolyticus RIMD2210633 and 111 strains of V.parahaemolyticus isolated from aquatic products

選取此8株菌和其他7株差異較小的菌株（相似度＞99%）以及O3：K6標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增。ERIC-PCR經(jīng)過一次重復(fù)，兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為一致。ERIC-PCR電泳結(jié)果條帶清晰，大部分菌株的相似度系數(shù)在0.9以下，菌株間區(qū)分度較好，見圖3。結(jié)果表明，這些菌株在基因組的水平上也存在較大的差異，通過ERIC-PCR的方法也能較好的對(duì)這些菌株加以區(qū)分，也說明分離自不同樣品中的副溶血性弧菌的16S rRNA基因序列存在相對(duì)較大程度的差異。另外，我們發(fā)現(xiàn)使用ERIC-PCR對(duì)全基因組進(jìn)行聚類分析時(shí)，聚類結(jié)果和樣品采集地、樣品種類也存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。若以相似性系數(shù)0.75為閾值，可將16株菌分為4大類，其中E1包含的6株菌種有4株分離自市場(chǎng)B，4株分離自南美白對(duì)蝦樣品；E2包含的8株菌種有5株分離自市場(chǎng)A，此5株菌均分離自南美白對(duì)蝦樣品。此規(guī)律有可能為菌株溯源工作提供一條新的思路。

圖2　基于16株副溶血性弧菌16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2　Phylogenetic tree of 16 strains of V.parahaemolyticus and related bacterial species constructed according to 16S rRNA gene sequence

圖3　ERIC-PCR指紋圖譜及聚類分析樹狀圖Fig.3　ERIC-PCR fingerprints and cluster analysis results

3　結(jié)語

16S rRNA基因序列常被用來鑒定細(xì)菌的種類［15-16］、推斷細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育［17-18］和進(jìn)化關(guān)系以及進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性分析［19-20］等，但是目前很少有針對(duì)同種不同株細(xì)菌的16S rRNA進(jìn)行變異規(guī)律分析的研究。因此，通過比較不同株V.parahaemolyticus 16S rRNA基因之間的差異，總結(jié)其變異規(guī)律，為副溶血性弧菌菌株分型工作提供新的研究靶點(diǎn)。通過16s rRNA基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)V.parahaemolyticus 16S rRNA基因序列的變異主要集中在50～270 bp的區(qū)域，也就是16S rRNA基因的V1和V2可變區(qū)，有將近一半的堿基位點(diǎn)相似度低于50%。而其他區(qū)域的保守性相對(duì)較高，只有V3和V8區(qū)的兩個(gè)堿基位點(diǎn)有相對(duì)明顯的變異規(guī)律。綜上所述，雖然同為副溶血性弧菌，不同株的16S rRNA基因序列仍具有一定的變異性，尤其在V1和V2區(qū)的序列具有較為明顯的變異。在開發(fā)副溶血性弧菌菌株分型研究新靶點(diǎn)時(shí)，可以在V1和V2區(qū)的位點(diǎn)加以嘗試。V1和V2區(qū)的序列特征在涉及副溶血性弧菌16S rRNA基因序列的工作中，特別是討論不同菌株之間的差異時(shí)具有重要的意義。

作者對(duì)分離自不同樣品和采集地的大量的副溶血性弧菌進(jìn)行了16S rRNA序列分析以及ERICPCR聚類分析，發(fā)現(xiàn)了16S rRNA基因變異規(guī)律，以及ERIC-PCR的聚類分析結(jié)果與樣品采集地、樣品種類的對(duì)應(yīng)關(guān)系，或可為副溶血性弧菌的溯源及進(jìn)化分析提供新的線索，為水產(chǎn)品中副溶血性弧菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分型溯源奠定研究基礎(chǔ)。

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會(huì)議信息

會(huì)議名稱（中文）：第十三屆全國(guó)生物無機(jī)化學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議

所屬學(xué)科：無機(jī)化學(xué)，化學(xué)生物學(xué)，生物物理學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)

開始日期：2016-10-13結(jié)束日期：2016-10-16

所在城市：上海市黃浦區(qū)

主辦單位：中國(guó)化學(xué)會(huì)、國(guó)家自然科學(xué)基金委

協(xié)辦單位：

承辦單位：上海師范大學(xué)

全文截稿日期：2016-08-15

聯(lián)系人：楊紅、周治國(guó)、田啟威、安璐

聯(lián)系電話：021 64322343、64328981

E-MAIL：cbic2016@163.com

會(huì)議網(wǎng)站：http://www.chemsoc.org.cn/news/？hid=1720

會(huì)議背景介紹：由中國(guó)化學(xué)會(huì)和國(guó)家自然科學(xué)基金委主辦、上海師范大學(xué)承辦的“中國(guó)化學(xué)會(huì)第十三屆全國(guó)生物無機(jī)化學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議”擬定于2016年10月13-16日在上海市召開。會(huì)議主題為“化學(xué)與健康”，以學(xué)術(shù)交流為平臺(tái)，通過大會(huì)報(bào)告、邀請(qǐng)報(bào)告、口頭報(bào)告和墻報(bào)展講等形式，充分展示和回顧近兩年來我國(guó)生物無機(jī)化學(xué)及相關(guān)研究領(lǐng)域取得的新方法和新成果，加強(qiáng)生物無機(jī)化學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)術(shù)交流，討論生物無機(jī)化學(xué)未來發(fā)展的新思路、新領(lǐng)域和新趨勢(shì)，促進(jìn)各方面的合作和創(chuàng)新。內(nèi)容涵蓋金屬酶模擬和性質(zhì)研究、金屬（離子）在生命體的作用、納米材料的生物作用等各個(gè)方面。熱忱歡迎廣大化學(xué)工作者積極參加，踴躍投稿。同時(shí)，歡迎相關(guān)企業(yè)、高校、科研院所積極參與會(huì)展。

Sequence Variation Regularity Analysis of 16S rRNA Gene of Vibrio parahaemolyticus

FENG Bo1，2，3，LAN Ying1，2，3，SUN Xiaohong1，2，3，ZHANGWeijia1，2，3，PAN Yingjie1，2，3，ZHAO Yong*1，2，3
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Shanghai EngineeringResearchCenter of Aquatic-Product Processing&Preservation，Shanghai 201306，China；3. Laboratory of Quality&Safety Risk Assessment for Aquatic-Products on Storage and Preservation（Shanghai），M inistry of Agriculture，Shanghai 201306，China）

In order to lay a foundation for the developmentof new targets for typing and tracing，we investigated the characteristics of the variations based on the analysis of 16S rRNA gene sequences of Vibrio parahaemolyticus.We sequenced 16S rRNA gene of 111 strains of Vibrio parahaemolyticus which were isolated from fresh aquatic products，and aligned w ith standard sequence in GenBank. We also established phylogenetic tree of sequences which had a great variation，and verified the variation regularity of thegenesby ERIC-PCR.The variability of different Vibrio parahaemolyticus of 16S rRNA genes was discovered.The variation mainly centralized in variable region V1 and V2.There were 38 base siteswhich sim ilarity were less than 30%in the region of 50～270 bp，and 103 base siteswhich sim ilarity ranged from 30%to 100%.In addition，therewas one basewhich showed difference both at V3 and V8.The variability of different Vibrio parahaemolyticus of 16S rRNA genes can lay a foundation for the development of new targets for typing and tracing of Vibrio parahaemolyticusand for the study ofmicro-evolution.

Vibrioparahaemolyticus，16SrRNAgene，ERIC-PCRclusteranalysis，variation regularity analysis

TQ 920.6

A

1673—1689（2016）09—0928—07

2014-09-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271870）；上海市科委部分地方院校能力建設(shè)項(xiàng)目（11310501100）；上海市科委科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目 （12391901300）；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目 （滬農(nóng)科攻字2014第3-5號(hào)）；上海市科委工程中心建設(shè)項(xiàng)目（11DZ2280300）。

馮博（1989—），男，安徽蚌埠人，食品科學(xué)與工程博士研究生。E-mail：fengbo0509@126.com

趙勇（1975—），男，湖北黃岡人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品安全方面的研究。E-mail:yzhao@shou.edu.cn