Wnt3a調控大鼠骨髓間充質干細胞向膽堿能神經元分化的實驗研究

王淑輝　王薇　張海廷　程杉　尚延昌　張擁波　李繼梅

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·論著·

Wnt3a調控大鼠骨髓間充質干細胞向膽堿能神經元分化的實驗研究

王淑輝王薇張海廷程杉尚延昌張擁波李繼梅

目的探討經典Wnt/β-catenin通路對大鼠MSCs在體外分化為神經元和膽堿能神經元的調節作用。方法取SD大鼠股骨和脛骨的骨髓，利用差速貼壁法分離、擴增及純化MSCs，繪制生長曲線；應用免疫熒光和Western-Blot的方法檢測Wnt3a處理后β-catenin蛋白的分布變化；取第4代MSCs分為3組；A組為空白對照組，用空白DMEM培養基培養細胞；B組為誘導分化對照組，用含100 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast grown factor, bFGF)、5 umol/L維甲酸(retinoic acid, RA)的DMEM誘導培養基培養細胞；C組為Wnt3a誘導分化組，在上述誘導培養基中加入50 ng/mL Wnt3a培養細胞；用形態學觀察和Western-Blot的方法比較各組對MSCs向神經元及膽堿能神經元分化的影響；應用形態學觀察和Western-Blot的方法比較各組對MSCs向神經元及膽堿能神經元分化的影響。結果利用差速貼壁法細胞傳至P3代時形態趨于一致，呈均勻分布生長。P3代細胞的生長曲線顯示，接種后的第1、2 d細胞處于潛伏期；第3、4 d細胞進入對數生長期；第5 d進入平臺期。P4代細胞高度表達CD29和CD44(陽性率分別為99.9%和73.2%)。Wnt3a處理組細胞的β-catenin在細胞核的分布較對照組細胞顯著增多(P<0.01)。誘導分化細胞組中A組細胞可檢測到少量神經元的標記物，但未檢測到膽堿能神經元的標志物，B組和C組細胞均可檢測到神經元和膽堿能神經元的標志物，B組和C組分化為神經元的比例較A組顯著增高(P<0.01)；C組分化為膽堿能神經元的比例較B組顯著增高(P<0.01)。結論Wnt3a能夠促進MSCs內的β-catenin的核轉移激活經典Wnt信號通路，促進體外培養的MSCs向膽堿能神經元分化。

骨髓間充質干細胞Wnt3a膽堿能神經元阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)又稱為老年性癡呆，嚴重影響了老年人的生活能力。流行病學調查顯示65歲以上人群中AD的發病率為5%～10%，85歲以上的老年人中發病率增長為25%[1]。隨著我國人口老齡化的發展，AD的患病率將逐漸增高，成為威脅人類生命健康的主要疾病之一。

AD的主要病理特征是β淀粉樣蛋白(amyloid-β protein, Aβ)聚集成的老年斑(senile plaque, SP)和過度磷酸化的微管相關蛋白tau蛋白組成的神經纖維纏結(neurofibrillary tangle, NFT)，兩者的存在均會產生神經毒性，最終導致海馬神經元的大量缺失。在AD早期內源性海馬神經前體細胞分裂、增殖、分化為成熟神經元來補充缺失的海馬神經元，具有一定的自我修復作用，可以對抗疾病進展[2]。但疾病后期新生的海馬神經元數量不斷減少，不能得到代償，最終出現臨床癥狀。如果能糾正海馬神經元的缺失，恢復其正常生理結構，將對改善AD癥狀有重要意義[3]。

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類來源于骨髓的多能干細胞，具有自我更新及多向分化的潛能，目前已成為研究干細胞移植治療多種疾病的種子細胞。已有研究表明MSCs在特定微環境下能分化為神經干細胞及多種有功能的神經元，并能通過移植改善AD大鼠模型的認知功能。如何調控MSCs向神經干細胞及特定神經元分化成為了研究的難點[4]。相關研究表明Wnt信號通路在神經發生中起著重要的作用[5]。

本實驗通過體外分離及培養SD大鼠的MSCs，利用Wnt3a蛋白及其他誘導分子對MSCs進行干預，觀察Wnt3a對MSCs向神經元及膽堿能神經元分化的影響，為干細胞移植治療阿爾茨海默病提供一定的實驗及理論依據。

1　材料與方法

1.1SD大鼠MSCs的培養、擴增

5周健康雄性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；引頸處死大鼠，無菌條件下分離出大鼠的股骨和脛骨，顯露骨髓腔；用10 mL注射器吸取含10%胎牛血清的DMEM培養基，沖出骨髓腔中的細胞，制成單細胞懸液，接種于底面積為25 cm2的培養瓶中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養；48 h后首次全量換液，以后每3 d全量換液1次，7 d左右細胞生長至融合；融合后按1∶2或1∶3比例進行傳代培養；其后一般3 d傳代1次。

1.2細胞生長曲線的繪制

取生長良好的P3代MSCs，消化后按3×104/孔接種于24孔板中，分7組，每組各3個孔；37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養7 d，其間逐日計數一組細胞，取均值，將7 d所得數值繪制成細胞的生長曲線。

1.3流式細胞儀檢測細胞的表面標志物

取生長良好的P4代MSCs，用0.25%胰酶+0.03%EDTA消化后離心，PBS洗3次，MSCs中加入飽和濃度FITC標記的CD11b、CD29、CD44、CD45抗體，室溫下避光孵育30 min，再用PBS清洗去除未結合抗體，10 g/L多聚甲醛固定15 min，流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達。

1.4β-catenin蛋白細胞內分布檢測

取生長良好的P4代MSCs分為2組，1組為空白對照組，含10%FBS的DMEM培養基培養細胞；2組為Wnt3a組，用含50 ng/ml Wnt3a蛋白和10%FBS的DMEM培養基培養細胞，用間接免疫熒光和Western-Blot檢測β-catenin蛋白的分布變化。抗β-catenin抗體購于英國Abcam公司。

1.5MSCs向神經元及膽堿能神經元細胞的誘導分化檢測

取生長良好的P4代MSCs分為3組，A組為空白對照組，用空白DMEM培養基培養細胞；B組為誘導分化對照組，用含100 ng/ml bFGF、5 umol/L RA的DMEM誘導培養基培養細胞；C組為Wnt3a誘導分化組，在上述誘導培養基中加入50 ng/mLWnt3a蛋白培養細胞。上述3組細胞培養過程中每3 d換液1次，每天于倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態的變化并照相；應用Western-Blot方法鑒定神經元特異性核蛋白(neuron-specific nuclear protein, NeuN)和膽堿乙酰基轉移酶(choline acetyltransferase, ChAT)的表達；抗ChAT抗體和抗NeuN抗體均購于英國Abcam公司。

1.6 統計學處理

采用SPSS 18.0進行統計學分析，對于正態分布資料使用均數±標準差表示其平均水平。2組均數的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，各組均數的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2　結　果

2.1MSCs的形態學及生長特點

利用差速貼壁法進行MSCs原代培養，接種4 h后細胞開始貼壁， 48 h后大量MSCs貼壁，形態為多角形或梭形，7 d左右細胞生長至融合后可傳代。原代和P1代細胞呈克隆樣生長，一般傳代后3 d細胞生長至融合，P2代以后細胞呈均勻分布生長，細胞傳至P3代時形態趨于一致，呈短梭形。細胞傳至P6、P7代時生長變得緩慢。本研究應用P4代細胞進行后續實驗(圖1)。

圖1 MSCs形態學檢測(100×倍)

P3代MSCs生長曲線顯示，接種后的第1、2 d細胞處于潛伏期，增殖緩慢；第3、4 d細胞進入對數生長期，增殖旺盛；第5 d進入平臺期，增殖減慢(圖2)。

圖2 SD大鼠MSCs的生長曲線

2.2MSCs表面標志物的檢測

經流式細胞儀檢測，體外傳代培養的P4代細胞具有較好的均一性。其中絕大部分細胞CD11b、CD34和CD45表達為陰性(陽性率分布為6.6%、4.6%、1.9%)，高度表達CD29和CD44，兩者陽性率分別為99.9%和73.2%(圖3)。

圖3 流式細胞儀檢測P4代MSCs的表面抗原標志

2.3Wnt3a蛋白處理MSCs細胞后胞內β-catenin的分布變化

應用含50 ng/mL Wnt3a蛋白和10%FBS的DMEM培養基培養MSCs48 h后間接免疫熒光顯示Wnt3a組在細胞核的位置可見β-catenin的聚集(圖4)，而對照組未見β-catenin在細胞核位置聚集。為進一步驗證上述結果，采用蛋白核質分離Western-Blot結果顯示，經Wnt3a處理48 h后胞核內的β-catenin的含量較對照組顯著增多，對照組和實驗組胞核內β-catenin/HDAC的比值分別為0.541±0.157和1.181±0.158。2組之間有明顯差異(P<0.01)(圖5)。

圖4 間接免疫熒光檢測β-catenin在胞內的分布變化Wnt3a組培養48h后間接免疫熒光顯示Wnt3a組在細胞核的位置可見β-catenin的聚集(箭頭所示),而對照組未見β-cate-nin在細胞核位置聚集

圖5 Western-Blot檢測細胞蛋白核質分離后β-catenin的水平與空白對照組比較,**P<0.01

2.4MSCs向神經元及膽堿能神經元誘導分化的檢測

將P4代MSCs經不同誘導培養基進行誘導分化7 d后形態學觀察顯示空白對照組細胞呈梭形，誘導分化對照組和Wnt3a誘導分化組細胞長出突起，呈神經元樣細胞，而Wnt3a誘導分化組細胞形態學變化更明顯(圖6)。

圖6 MSCs的誘導分化細胞形態改變(200×倍)

誘導分化12 d后應用Western-Blot檢測發現，空白對照組可見少量NeuN的表達而未見ChAT的表達，誘導分化對照組和Wnt3a誘導分化組均可見NeuN和ChAT的表達。空白對照組、誘導分化對照組和Wnt3a誘導分化組的NeuN/actin的比值分別為0.218±0.012、0.712±0.042和0.736±0.039，空白對照組與誘導分化對照組，空白對照組與Wnt3a誘導分化組之間有明顯差異(P<0.01)，而誘導分化對照組與Wnt3a誘導分化組之間無明顯差異。Wnt3a誘導分化組較誘導分化對照組的ChAT表達增多，2組ChAT/actin的比值分別為0.208±0.018和0.112±0.012，兩組之間有明顯差異(P<0.01)(圖7)。

3　討　論

本研究發現，利用差速貼壁法分離純化的MSCs細胞傳至P3代時形態趨于一致，呈均勻分布生長。生長曲線顯示接種后的第1、2 d細胞處于潛伏期；第3、4 d細胞進入對數生長期；第5 d進入平臺期。P4代細胞高度表達CD29和CD44。應用Wnt3a處理MSCs后細胞漿中β-catenin轉移至細胞核，細胞形態發生顯著變化，NeuN和ChAT的表達顯著增多。上述研究發現Wnt3a能夠促進體外培養的MSCs向膽堿能神經元分化。

MSCs具有自我更新及多向分化的潛能，在不同的微環境下可以分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和神經元等多種細胞[6]，因此被認為是細胞移植治療多種疾病的種子細胞[7]。但骨髓中MSCs的含量很低，約占細胞總數的0.001%～0.01%。本實驗通過差速貼壁法成功分離培養了MSCs，并對其進行了鑒定，P4代經流式細胞儀檢測細胞具有較好的均一性，表達CD29和CD44，而不表達CD11b、CD34和CD45，符合MSCs的特點。細胞生長曲線顯示傳代后第3、4 d細胞處于對數生長期，增殖旺盛[8]。

已有研究表明MSCs在適當條件下能在體內外誘導分化為多種類型的神經元。但MSCs向神經元分化的調控機制尚未明確。研究表明Wnt信號通路對MSCs的分化有一定的調控作用[9-10]。根據細胞內β連環蛋白(β-catenin)是否參與信號通路，將Wnt信號傳導通路分為經典Wnt信號傳導通路和非經典Wnt信號傳導通路。其中Wnt3a蛋白與細胞膜上的相應受體結合，可以激活經典Wnt信號通路，促進未被磷酸化的β-catenin入核并啟動靶基因的轉錄，產生多種細胞效應[11]。Ping 等分離正常人及AD患者皮層的膠質祖細胞(glial progenitor cells, GPCs)，研究這些細胞分化為神經元的能力，發現相對于正常人，AD患者的GPC自我更新能力及神經發生能力明顯下降，AD患者的GPC中有功能的β-catenin水平顯著下降，而即將降解的磷酸化的β-catenin水平增高[12]。表明經典Wnt信號通路對AD患者的神經發生具有一定的調節作用。Wexler 等應用鋰劑來激活Wnt通路，能夠刺激成年小鼠體內海馬前體細胞增殖，并能促進海馬前體細胞分化為表達微管相關蛋白β-Ⅲ-Tubulin (Tuj1) 的神經元[13]。本實驗通過加有Wnt3a蛋白的培養基培養細胞，細胞免疫熒光和Western-Blot檢測均證實了Wnt3a蛋白可以促進MSCs的β-catenin入核，說明Wnt3a蛋白可以激活MSCs的經典Wnt信號通路。

通過維甲酸等的誘導作用MSCs可以分化為膽堿能神經元，且分化的膽堿能神經元Wnt3a蛋白表達增加[14]。本實驗采取了維甲酸和堿性成纖維細胞因子聯合誘導MSCs向膽堿能神經元分化的方法，Wnt3a組另外加入Wnt3a蛋白誘導分化，結果表明3組均有神經元標記物的表達，表明MSCs培養過程中可能存在自然分化現象，但其分化量遠少于誘導分化組。相對于空白對照組，維甲酸和堿性成纖維細胞因子聯合誘導可以使MSCs向膽堿能神經元分化，并且Wnt3a組對MSCs分化為膽堿能神經元有促進作用。Wnt3a蛋白可以激活MSCs的經典Wnt信號通路，推測經典Wnt信號通路對MSCs向膽堿能神經元分化具有調節作用。

圖7 Western-Blot檢測各組細胞神經元NeuN和膽堿能神經元ChAT的表達水平A組為空白對照組,B組為誘導分化對照組,C組為Wnt3a誘導分化組;直方圖顯示各組NeuN/actin和ChAT/actin的比值,與A組比較,**P<0.01;與B組比較,△P<0.01

本實驗結果證實MSCs在體外誘導條件下可以分化為膽堿能神經元，并且經典Wnt信號通路的激活可以促進這一過程，推測移植經Wnt3a激活的MSCs，在動物體內同樣可以促進其向膽堿能神經元的分化，提高MSCs移植治療阿爾茨海默病的療效。

[1]Bateman RJ,Xiong CJ,Benzinger TL,et al.Clinical and biomarker changes in dominantly inherited alzheimer's disease[J].N Engl J Med,2012,367(9):795-804.

[2]Moon M,Cha MY,Mook-Jung I.Impaired hippocampal neurogenesis and its enhancement with ghrelin in 5XFAD mice[J].Journal of Alzheimers Disease,2014,41(1):233-241.

[3]Aimone JB,Li Y,Lee SW,et al.Regulation and function of adult neurogenesis: from genes to cognition[J].Physiol Rev,2014,94(4):991-1026.

[4]Liang CM,Weng SJ,Tsai TH,et al.Neurotrophic and neuroprotective potential of human limbus-derived mesenchymal stromal cells[J].Cytotherapy,2014,16(10):1371-1383.

[5]Hussaini SM,Choi CI,Cho CH,et al.Wnt signaling in neuropsychiatric disorders: ties with adult hippocampal neurogenesis and behavior[J].Neurosci Biobehav Rev,2014,47:369-383.

[6]Sharma RR,Pollock K,Hubel A,et al.Mesenchymal stem or stromal cells:a review of clinical applications and manufacturing practices[J].Transfusion,2014,54(5):1418-1437.

[7]Sutton MT,Bonfield TL.Stem cells: innovations in clinical applications[J].Stem Cells Int,2014,2014:516278.

[8]Shang YC,Wang SH,Xiong F,et al.Wnt3a signaling promotes proliferation, myogenic differentiation, and migration of rat bone marrow mesenchymal stem cells[J].Acta Pharmacol Sin,2007,28(11):1761-1774.

[9]Bhaskar B,Mekala NK,Baadhe RR,et al.Role of signaling pathways in mesenchymal stem cell differentiation[J].Curr Stem Cell Res Ther,2014,9(6):508-512.

[10]Zhu D,Kang Q,Huang PY,et al.Neurogenesis-related genes expression profiling of mouse fibroblastic stem cells induced by Wnt signaling[J].Neurol Res,2009,31(2):200-203.

[11]Andersson T,Duckworth JK,Fritz NA,et al.Noggin and Wnt3a enable BMP4-dependent differentiation of telencephalic stem cells into GluR-agonist responsive neurons[J].Molecular and Cellular Neuroscience,2011,47(1):10-18.

[12]He P,Shen Y.Interruption of beta-catenin signaling reduces neurogenesis in Alzheimer's disease[J].J Neurosci,2009,29(20):6545-6557.

[13]Wexler EM,Geschwind DH,Palmer TD.Lithium regulates adult hippocampal progenitor development through canonical Wnt pathway activation[J].Mol Psychiatry,2008,13(3):285-292.

[14]王晉麗,王春芳,王曉霞,等.Wnt3a在大鼠骨髓源性膽堿能神經元中的表達[J].山西醫科大學學報,2008,39(1):7-10, 95.

(2016-03-05收稿)

Experimental study of Wnt3a regulating the cholinergic neuron differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells

WangShuhui，WangWei，ZhangHaiting,etal.

DepartmentofNeurology,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050

ObjectiveTo investigate the effects of canonical Wnt/β-catenin signaling pathway on differentiation of MSCs into neuron and cholinergic neuron. MethodsRat MSCs were isolated and purified through differential anchoring method. Observe the morphological changes of cells under optical microscope, drew the cell growth curves, and detect the surface antigens by FACScan. The distribution of β-catenin was detected by Western blot and immunofluorescence stain after Wnt3a treatment. Then the fourth generation of MSCs was divided into three groups. Group A: cells were cultured in DMEM; Group B: cells were cultured in DMEM supplemented with 100 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF) and 5 umol/L retinoic acid (RA); Group C: cells were cultured in DMEM supplemented with 100 ng/ml bFGF, 5 umol/L RA and 50ng/ul Wnt3a. The morphological changes of the cells were observed and the markers of neurons and cholinergic neurons were detected by Western blot after inducing neuronal differentiation. ResultsMSCs were purified after passage 3 through differential anchoring method. The growth kinetics of MSCs showed cells grew slowly in the first two days. After inoculation, entered a logarithmic phase from the third day and became slowly in the fifth day. Positive rate of CD29 and CD44 was 99.9% and 73.2%. Compared with control group, Wnt3a treated MSCs showed a higher level of β-catenin in the nucleus (P<0.01). The marker of neurons was detected in Group A, but the marker of cholinergic neurons couldn’ t be detected. The marker of both neuron and cholinergic could be detected in Group B and Group C. Compared to Group A, the level of the neurons' marker was higher in both Group B and Group C (P<0.01). Compared with Group B, the level of the cholinergic neurons' marker was significantly higher in the Group C (P<0.01). ConclusionWnt3a could induce beta-catenin nuclear translocation and activate the canonical Wnt pathway in MSCs. The canonical Wnt signaling pathway enhances the differentiation of MSCs into cholinergic neurons.

MSCsWnt3aCholinergic neuronAlzheimer's disease

國家自然科學基金(81100237)；北京市自然科學基金(7142042)

100050北京，首都醫科大學附屬北京友誼醫院神經科[王淑輝王薇(共同第一作者)張海廷張擁波李繼梅]；首都醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系(程杉)；解放軍總醫院老年神經科(尚延昌)

R741

A

1007-0478(2016)05-0309-06

10.3969/j.issn.1007-0478.2016.05.001