中哈邊境艾比湖濕地游離蜱斑點熱群立克次體的分子流行病學研究

徐軍，王安東，羅丹，徐新龍，戴莉，楊杰，徐建軍，熱依罕古麗，薩尼葉古麗，王麗娜，杜景云，李志遠，王遠志

（1.新疆出入境檢驗檢疫局，新疆烏魯木齊832000；2.石河子大學動物科技學院，新疆石河子832000；3.石河子大學醫學院，新疆石河子832000；4.阿拉山口出入境檢驗檢疫局，新疆阿拉山口833418；5.新疆農業大學動物醫學學院，新疆烏魯木齊830052）

中哈邊境艾比湖濕地游離蜱斑點熱群立克次體的分子流行病學研究

徐軍1，王安東2，羅丹3，徐新龍4，戴莉4，楊杰4，徐建軍5，熱依罕古麗5，薩尼葉古麗5，王麗娜2，杜景云3，李志遠2，王遠志3

（1.新疆出入境檢驗檢疫局，新疆烏魯木齊832000；2.石河子大學動物科技學院，新疆石河子832000；3.石河子大學醫學院，新疆石河子832000；4.阿拉山口出入境檢驗檢疫局，新疆阿拉山口833418；5.新疆農業大學動物醫學學院，新疆烏魯木齊830052）

了解中哈邊境新疆艾比湖濕地游離蜱中斑點熱群立克次體的感染情況。利用斑點熱群立克次體外膜蛋白A（ompA）基因對艾比湖濕地游離亞洲璃眼蜱、邊緣革蜱、血紅扇頭蜱進行PCR檢測，并對陽性樣本進行測序和BLAST序列分析，并應用Mega5.0軟件建立分子系統進化樹。結果中哈邊境地區艾比湖濕地游離蜱斑點熱群立克次體電泳陽性率36.84%（56/152），BLAST分析顯示，艾比湖濕地游離蜱斑點熱群立克次體基因型為Rickettsia raoultii，與從匈牙利患蜱傳染的病人腫大淋巴結中分離獲得的R.raoultii關系最近，處于同一分支（GenBank登錄號為JQ798904）。結論是新疆艾比湖濕地游離蜱斑點熱立克次體感染較為嚴重，存在立克次體自然疫源地，應盡快制定防制措施，以免危機動物及人類健康。

斑點熱立克次體；游離蜱；ompA基因；分子流行病學；艾比湖濕地；阿拉山口口岸；中哈邊境

1材料與方法

1.1標本采集2014年4-8月在新疆艾比湖濕地（44°43′N～45°12′N，82°35′E～83°11′E）用白布旗法采集游離蜱。

1.2蜱形態學鑒定使用體式顯微鏡（LEICA M165 C），以經典的形態學鑒定為主要依據，參照鄧國藩［3］等國內外學者對蜱傳統形態學分類方法對蜱蟲進行形態學鑒定。

1.3斑點熱立克次體核酸檢測

1.3.1蜱蟲DNA提取按照TIANamp Genomic DNA Kit說明書，進行DNA提取（1只/1份），將提取的DNA置于-20℃保存備用。

1.3.2PCR擴增根據Anstead Clare A.［4］已經報道的ompA序列進行PCR。50 μL PCR反應體系包含如下成分：25 μL 2×Taq PCR Master Mix，1 μL 10 mmol/L ompA F，1 μL 10 mmol/l ompA R，2 μL DNA模板，21 μL dd H2O。按照預變性95℃30 s，循環95℃30 s，50℃30 s，72℃30 s，35個循環，總延伸72℃300 s進行PCR擴增。

1.3.3序列分析及分子遺傳進化分析選取PCR陽性產物送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，測序結果與GenBank中進行BLAST進行同源性分析，然后使用Mega6.0軟件進行遺傳進化分析，構建分子系統進化樹。

2結果

2.1標本采集結果經形態學鑒定，本次調查顯示，阿拉山口艾比湖濕地游離蜱隸屬1科3屬3種，分別為：血紅扇頭蜱（3.83%，15/392）、亞洲璃眼蜱（45.66%，179/392）、邊緣革蜱（50.51%，198/392）。2.2立克次體核酸檢測結果選取152份代表蜱種進行PCR檢測，其中陽性56份，陽性率為36.84%（56/ 152）。其中：邊緣革蜱66.67%（54/81）；血紅扇頭蜱8.33%（1/12）；亞洲璃眼蜱1.69%（1/59）。

2.3PCR電泳結果PCR擴增斑點熱群立克次體的產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，可得到533 bp左右的核酸片段，與預期片段大小相符（圖1）。

2.4序列分析BLAST分析顯示，測序結果均為Rickettsia raouhii（R.raoultii）基因型。結合Gen-Bank數據庫中的其他斑點熱群立克次體種類，運用Mega 6.0軟件進行多重序列比對、構建遺傳進化樹顯示：與從匈牙利患蜱傳染的病人腫大的淋巴結中分離獲得的R.raoultii關系最近，處于同一分支（GenBank登錄號為JQ798904）。

表1艾比湖濕地蜱類及斑點熱群立克次體病原體檢測結果

圖1PCR擴增ompA基因

圖2基于立克次體ompA基因的系統進化樹

3討論

本研究發現，阿拉山口地區斑點熱群立克次體陽性率36.84%（56/152），高于疆內夏爾西里森林革蜱陽性率20%（14/70）［5］和博樂、塔城地區邊緣革蜱陽性率16.22%（12/74）［6］，及東北地區森林革蟬中檢出的陽性率3.7%（25/676）［7］和哈薩克斯坦邊緣革蜱陽性率33.3%（6/18）［8］。可見，阿拉山口艾比湖濕地游離蜱斑點熱立克次體具有高感染率，因此應當提醒當地旅游、工作人員做好防護，謹防立克次體感染。

本次調查發現，艾比湖立克次體基因為Rickettsia raoultii，與新疆哈巴、和碩、博樂和塔城地區斑點熱群立克次體基因型相同［5-6］，進一步說明Rickettsia raoultii是新疆廣布種。文獻記載曾在哈薩克斯坦網紋革蜱、邊緣革蜱、草原革蜱中分離到Rickettsia raoultii［9］。阿拉山口作為面向中亞的重要口岸，隨著人員交流的日益頻繁和貨物的運輸，增加了媒介生物隨著人員和貨物進出境的風險。加之阿拉山口境內的艾比湖濕地自然保護區，是新疆境內3條候鳥遷徙路線（南亞路線、印巴路線、北非路線）的樞紐位置，是候鳥遷徙的主要驛站［10］，為蜱和蜱傳染原的傳播提供了非常便利的自然條件。因此該基因型為邊境地區長期“盤踞”還是外來入侵？這有待進一步調查和實驗驗證。隨著“一路一帶”經濟帶的推進，新疆對外貿易將日益增大，因此應增加邊境地區媒介生物監測點，對立克次體隨著貨物、人員、野生動物和候鳥遷徙流動造成的疫病傳播具有重要意義。

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Molecular epidemiological study of thespotted fever group Rickettsia in free-living ticks in thewetlands of Aibi Lake，China-Kazakhstan border

XU Jun1，WANG An-dong2，LUO Dan3，XU Xin-long4，DAI Li4，YANG Jie4，XU Jian-jun5，REYihanguli5，SANiyeguli5，WANG Li-na2，DU Jing-yun3，LI Zhi-yuan2，WANG Yuan-zhi3
（1.Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Authority of the PRC，Urumqi 830000，China；2.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezhi 832000，China；3.College of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832000，China；4.Alashankou Entry-Exit Inspection and Quarantine Authority of the PRC，Alashankou 833418，China；5.College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

To investigate the prevalence of tick-borne spotted fever group Rickettsia（SFGR）in the wetlands of Aibi Lake，China-Kazakhstan border and to provide a scientific basis for the prevention and control of tick-borne SFGR.The OmpA gene ampliflcation was carried out for DNA samples extracted from Hyalomma asiaticum，Dermacentor marginatus，and Rhipicephalus sanguineus collected in the wetlands of Aibi Lake，China-Kazakhstan border and the positive samples were subjected to sequencing and sequence analysis to establish the molecular phylogenetic tree.56（36.84%）of the 152 DNA samples were positive for SFGR. The phylogenetic analysis based on nucleotide sequence showed that all detected SFGR strains were clustered together with（accessionnumbers：JQ798904）；These strains had the highest homology with Rickettsia raoultii（99.02%）.Tick-borne SFGR is prevalent in the wetlands of Aibi Lake on China-Kazakhstan border.Preventive measures should be taken in time to protect humans and animals from this disease.

Spotted Fever Rickettsia；free ticks；ompA gene；Molecular epidemiological；Aibi Lake；Ala-shankou Port；China-Kazakhstan border種立克次體［1-2］。新疆地域遼闊，生境多樣，蜱種豐富，但對其立克次體研究報道相對較少。本研究利用分子生物學方法，對新疆艾比湖濕地游離蜱斑點熱立克次體進行核酸檢測和序列分析。

R 384.4

A

0529-6005（2016）08-0018-02

2015-11-05

新疆維吾爾自治區自然科學基金（201442137-1）；國家質檢總局科技計劃項目（2014IK239）；公益性行業（農業）科研專項（201103008）

徐軍（1969-），男，高級獸醫師，碩士，從事動物檢驗工作，E-mail：alskxj@sina.com

王安東（1990-），男，碩士生，研究方向為獸醫衛生監督與管理，E-mail：wadshzu@163.com

注：王安東與徐軍對本文具有同等貢獻