緊密連接蛋白occludin和claudin-1在豬機體不同組織的分布研究

駱曉蕾，郭龍軍，谷偉紅，馮力，王玉娥

（中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150001）

緊密連接蛋白occludin和claudin-1在豬機體不同組織的分布研究

駱曉蕾，郭龍軍，谷偉紅，馮力，王玉娥

（中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150001）

緊密連接蛋白有維持上皮屏障完整性的功能，主要的組成蛋白有occludin和claudin-1。為研究豬體內緊密連接蛋白occludin和claudin-1的表達分布情況，首先用GenBank中發表的豬源occludin和claudin-1的序列，設計并合成了針對occludin和claudin-1的特異性引物，然后從無特定病原（SPF）豬體不同組織中提取總RNA，反轉錄成cDNA，用半定量方法測定SPF豬不同組織緊密連接蛋白的mRNA水平。結果發現，occludin和claudin-1在不同組織的分布存在差異。進一步測序發現，occludin序列相對保守，而claudin-1則變異較大。

緊密連接蛋白；claudin-1；occludin

緊密連接蛋白是廣泛存在于上皮細胞和內皮細胞之間的細胞連接復合體［1］，其功能是封閉細胞間隙，阻止上皮層內外物質的自由進出，是上皮細胞選擇通透作用的物質基礎，緊密連接蛋白在生理狀態下通過調控作用，能有效的阻止腸腔內細菌、毒素等物質的胞旁轉運，維持上皮屏障功能的完整［2］。緊密連接蛋白為多種蛋白相互作用下形成的復合結構［3］，主要由跨膜蛋白和胞質蛋白組成，其中主要跨膜蛋白有occludin和claudin-1等，occludin和claudin-1都是四次跨膜蛋白，有兩個胞外環，結構十分相似［4］。occludin是第一個被發現的膜內緊密連接蛋白，其在細胞膜上分布最廣，在細胞間主要發揮粘附分子的作用，具有維持和調節緊密連接蛋白屏障功能［5］。緊密連接蛋白另一個重要的組成蛋白claudins是一個多基因家族，不同的claudins成員在不同的組織細胞中的分布和功能具有差異性，主要有細胞信號轉導和調節細胞連接處選擇滲透性的功能［6］。緊密連接蛋白表達及分布的異常與很多疾病都相關，occludin和claudin-1功能的多樣性也許與他們的組織特異性有關，目前還沒有關于occludin和claudin-1在正常豬體不同組織分布情況的研究，本研究主要檢測了這兩種緊密連接蛋白在豬體不同組織分布情況，為occludin和claudin-1在不同組織的功能研究奠定了基礎。

1材料與方法

1.1試驗試劑Golden MLV Reverse Transcriptase，購自?；锟萍加邢薰荆籘4 DNA連接酶、TaKaRa LA Taq和Premix Taq，均購自于TaKa-Ra生物科技有限公司；膠回收試劑盒和質粒小劑量提取試劑盒，購自于AXYGEN公司；LB、PBS試劑為自己實驗室配制；瓊脂，購自于BIOWEST公司。

1.2實驗器材電子天平，購自Sartorius公司；PCR儀器，購自SENSQUEST公司；小型離心機、和-80冷藏箱，均購自Thermo公司；DK-8D型電熱恒溫水箱是由上海一恒科技有限公司生產；醫用冷藏箱、醫用低溫保存箱，均購自海爾公司；Allegra X-22R離心機，購自BECKMAN公司；HDL潔凈工作臺由北京哈文制造公司制造；生化培養箱，購自Blue pard公司；WD-9405B型水平搖床、DYY-6C型電泳儀，購自北京六一儀器廠；UV tuansilluminator，購自WEALTEC公司。

1.3RNA的提取取SPF豬的肝、心、脾、肺、腎等15種不同組織加PBS研磨后將組織研磨混合液放-80℃儲存后反復凍融3次，取不同組織研磨液提取總RNA，置-80℃保存。

1.4RNA的反轉錄以SPF豬不同組織的總RNA為模板，Oligo d（T）為引物反轉錄獲得cDNA，反轉錄體系為20 μL，其反應體系及反轉錄條件如表1所示，反轉錄所得的cDNA可直接用于PCR反應。

1.5引物設計和PCR擴增根據GenBank中的豬源occludin和claudin-1全長序列設計特異性引物（表2），以提取的豬不同組織總RNA反轉錄得到的cDNA為模板擴增occludin和claudin-1的編碼序列，PCR產物純化回收后克隆到pMD18-T載體上，經過PCR和雙酶切鑒定為陽性的重組質粒由上海華大基因科技股份有限公司測序驗證。

表1cDNA反轉錄體系及反應條件

表2PCR引物

1.6半定量PCR法測定occludin和claudin-1在豬不同組織的分布情況根據全長序列，用Oligo 7軟件設計occludin和claudin-1的定量引物以及內參β-actin如表3所示，并根據半定量PCR的方法測定這兩種蛋白在豬不同組織中的mRNA水平。豬的不同組織分別取自3只不同的SPF豬，試驗結果均獨立重復3次而得出，試驗結果用軟件Image J進行分析。

表3定量PCR引物

2結果

2.1用半定量RT-PCR測定occludin和claudin-1在豬不同組織中的mRNA水平從SPF豬不同組織，如肝、心、脾、肺、腎、不同腸段等，分別提取RNA，反轉錄成cDNA，用設計的特異性針對occludin、claudin-1以及內參β-actin的定量引物以cDNA為模板進行半定量PCR，結果表明，occludin和claudin-1在不同組織的分布存在差異。緊密連接蛋白occludin在肝、脾、肺、腦、十二指腸、回腸、腮腺等組織中含量較高，在淋巴結和胸腺中含量較低，claudin-1在肝、肺、腎、十二指腸、腮腺中含量較高，在淋巴結和胸腺中含量較低。以上結果表明，兩者均在部分腸段和一些實體組織，如：肝、肺、腎等組織中mRNA水平較高，在淋巴結和一些腺體等免疫組織中含量較低。見圖1和圖2。

2.2豬源不同組織中occludin和claudin-1全長序列比對結果從SPF豬體不同組織，如肝、心、脾、肺、腎、不同腸段等，分別提取RNA，反轉錄成cDNA，用設計針對occludin和claudin-1的全長引物擴增這兩種蛋白的編碼序列，并克隆到pMD18-T上，經測序結果發現，occludin在豬體不同組織的分布相對保守，與GenBank中的序列無明顯差別，而claudin-1則變異較大，如圖3所示，在小腸和肝、脾等一些組織，claudin-1序列的第252個堿基G被替換成了A，第255位和257位堿基A和T分別被替換成了G和C，第298位和297位堿基T和G分別被替換成了C和A，第310位堿基T被替換成了A，并且在小腸和肝、脾、心、腮腺和淋巴結中存在部分堿基的缺失，這可能是claudin-1存在不同組織的突變體，這些突變體也許與claudin-1的組織特異性和功能有關。

圖1occludin在豬體不同組織的分布情況

圖2為claudin-1在豬體不同組織的分布情況

3討論

緊密連接蛋白創造了細胞轉運屏障，具有維持細胞完整性的功能，緊密連接蛋白的異常表達可以增加細胞膜的滲透性，從而引起腸道等器官的疾病以及系統性疾病［7］，因此緊密連接蛋白的正常表達對于機體的生存至關重要。有研究表明，在正常情況下，緊密連接蛋白是構成血腦屏障的重要組分，而occludin是大腦內皮細胞的重要組分，維持血腦屏障的完整性，在人腦自發性顱內出血的研究中，循環的和血液中的occludin表達水平明顯升高，因而occludin成為診斷該疾病的一個重要的生物指標［8］；在各種癌癥中，與正常組織相比claudin-1的表達水平發生改變，而這種改變可以診斷一些癌癥的復發，因此，claudin-1可作為診斷癌癥復發的因素和藥物治療靶點［9］。有關人的緊密連接蛋白表達水平與疾病的聯系越來越多的被發現，而豬源的很少研究和報道，所以檢測正常豬體中緊密連接蛋白在不同組織中的正常水平可以為以后進一步的功能研究奠定基礎。本研究表明，occludin在豬體各個組織中的存在形式比較保守，而在各個組織中的mRNA水平存在差異，說明occludin在各個組織中功能的差異也許與它的含量存在一定的聯系；claudin-1在豬體各個組織中的含量和序列存在形式都存在差異，說明claudin-1在各個組織的功能也許不僅與它的含量有關，還與它的存在形式有關。occludin和claudin-1在免疫細胞豐富的淋巴結和胸腺中的mRNA水平較低，在免疫細胞較少的肝、脾、腎和腦等一些實體組織中的含量較高，說明緊密連接蛋白在這些實體組織中也許補償了免疫細胞的一些功能，對機體發揮著重要的屏障作用。

圖3豬不同組織中全長claudin-1的測序結果

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Thedistribution of tight junction proteins occludin and claudin-1 in porcinedifferent tissues

LUO Xiao-lei，GUO Long-jun，GU Wei-hong，FENG Li，WANG Yu-e
（State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150001，China）

Tight junctions are highly specialized membrane domains，which maintain the integrity of the epithelial barrier.The main components of tight junction proteins include occludin and claudin-1.To study the distribution of occludin and claudin-1 in porcine tissues，we designed specific primers according to the published sequences in GenBank.Total RNA was extracted from different SPF pig tissues，and then semi-quantitative RT-PCR was performed to measure both occludin and claudin-1 transcripts level from different porcine tissues.The results showed that the distribution of occludin and claudin-1 in porcine tissues was different. Full-length sequencing revealed that occludin was highly conserved among different tissues，while claudin-1 showed relative differences in tissue distribution.

Tight junction portines；occludin；claudin-1

WANG Yu-e

R 730.2

A

0529-6005（2016）08-0021-04

2016-01-18

國家自然科學基金面上項目（31572497）；黑龍江省自然科學基金項目（LC201418）

駱曉蕾（1989-），女，碩士，主要從事動物疫苗與分子免疫學研究，E-mail：1203765310@qq.com

王玉娥，E-mail：wangyue@caas.cn