猴頭菇多糖對小鼠脾淋巴細胞體外NO分泌及iNOS mRNA表達的影響

鄭乃珍，鄭小香，檀新珠，任喆，馬玉芳，黃一帆

（福建農林大學動物科學學院中西獸醫結合與動物保健福建省高校重點實驗室，福建福州350002）

猴頭菇多糖對小鼠脾淋巴細胞體外NO分泌及iNOS mRNA表達的影響

鄭乃珍，鄭小香，檀新珠，任喆，馬玉芳，黃一帆

（福建農林大學動物科學學院中西獸醫結合與動物保健福建省高校重點實驗室，福建福州350002）

為了研究猴頭菇多糖（Hericium erinaceus polysaccharide，HEP）對小鼠脾淋巴細胞NO生成及iNOS mRNA表達的影響。采用Griess法測定HEP單獨或協同ConA誘導脾淋巴細胞分泌NO含量；RT-PCR法檢測脾淋巴細胞iNOS mRNA表達量。結果與細胞對照組比較，HEP在25～400 μg/mL的濃度范圍內能單獨誘導脾淋巴細胞NO分泌及iNOS mRNA表達（P＜0.05）；與ConA對照組比較，HEP在100～400 μg/mL濃度范圍內能協同ConA誘導脾淋巴細胞NO分泌及iNOS mRNA表達（P＜0.05）。表明HEP能單獨或協同ConA誘導小鼠脾淋巴細胞分泌NO，此作用可能是通過促進iNOS mRNA表達而實現。

猴頭菇多糖；脾淋巴細胞；一氧化氮；誘導型一氧化氮合酶

猴頭菇是一種大型真菌，具有助消化、利五臟、潤六肺的功能。猴頭菇多糖（Hericium erinaceus polysaccharide，HEP）的藥理作用研究是近年來研究熱點。目前國內外研究表明，HEP具有抗腫瘤［1］、抗病毒［2］、抗氧化和保肝護肝［3］、促進樹突狀細胞的免疫調節［4］、促進巨噬細胞的免疫調節［5］、促進體內脾淋巴細胞的免疫調節［6］等藥理作用。

前期研究發現，HEP能單獨或協同ConA促進脾淋巴細胞增值、誘導淋巴細胞DNA從G0/G1期進入S期［7］。NO是細胞間信息傳遞的重要調節分子，是殺滅病原微生物的主要效應分子，介導細胞免疫和炎癥毒性的功能［8］。但關于HEP對體外脾淋巴細胞分泌NO及iNOS mRNA的表達鮮見報道。為進一步研究HEP的免疫調節作用機制，本研究通過檢測HEP單獨或協同ConA對小鼠脾淋巴細胞分泌NO量及iNOS mRNA表達量，旨在探討HEP的調節免疫作用機理進一步豐富HEP的免疫藥理學內容。

1材料與方法

1.1材料與試劑胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；刀豆蛋白（ConA），美國Sigma公司；RPMI-1640培養液，美國Hyclone公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、紅細胞裂解液均為北京索萊寶科技有限公司；RNAiso Plus、RNA反轉試劑盒、SYBR Rremic EX TaqTM均為Japan TaKaRa公司產品；青霉素、鏈霉素、Griess試劑盒均為上海碧云天生物技術有限公司；猴頭菇多糖由上海朝翔技術有限公司提供，經本校中西獸醫結合與實驗動物保健實驗室純化，多糖含量為76.7%。

1.2實驗動物健康昆明系小鼠，雄性，體重20± 2 g，福建醫科大學實驗動物中心提供。

1.3試驗儀器CO2培養箱（美國Thermo Electron公司）；PCR儀（美國BIO-RAD公司Thermal Cycler型號C1000）；Real-time PCR系統（美國BIORAD公司CFX96TMReal-time System）；臺式冷凍離心機（美國Beckman coulter公司ALLEGRA X-22R）；酶標儀（美國BIO-RAD公司）。

1.4試驗方法

1.4.1小鼠脾淋巴細胞懸液的制備頸椎脫臼法處死小鼠，75%乙醇浸泡5 min，取出脾臟后用PBS清洗脾臟，玻璃針芯研磨脾臟并擠壓過200目篩網，收集細胞懸液，1 500 r/min（4℃）離心3 min，棄上清液后加入2 mL紅細胞裂解液，靜置5 min，離心，棄上清液，RPMI-1640培養液重復洗滌兩遍，RPMI-1640培養液（含10%血清）重懸細胞，靜置培養6 h，取懸浮細胞，臺盼藍染色，鏡檢計數，RPMI-1640完全培養液調整細胞濃度至5×106個/mL。

1.4.2HEP單獨或協同ConA對脾淋巴細胞釋放NO的影響取1.4.1制備的細胞懸液，接種到24孔板，每孔500 μL；試驗設計組如下：HEP單獨組（每孔加入500 μL HEP，HEP終質量濃度分別為0、25、50、100、200、400 μg/mL）；HEP協同ConA組（每孔加入500 μL HEP和ConA，HEP終質量濃度分別為0、25、50、100、200、400 μg/mL，ConA終質量濃度為1 μg/mL）；每組均設4個復孔。培養24 h后，收集各組上清液，Griess法檢測NO的含量，具體操作按照試劑盒說明書要求進行。

1.4.3HEP單獨或協同ConA對小鼠脾淋巴細胞iNOS mRNA表達量的影響取1.4.1制備的細胞懸液，接種到6孔板，每孔2 mL；試驗組設計如下：HEP單獨作用組（每孔加入2 mL HEP，HEP終質量濃度分別為0、25、50、100、200、400 μg/mL）；HEP協同ConA組（每孔加入2 mL HEP和ConA，HEP終質量濃度分別為0、25、50、100、200、400 μg/mL，ConA終質量濃度為1 μg/mL）。培養24 h后，收集脾淋巴細胞，按RNAiso Plus法推薦步驟提取細胞總RNA。應用RT-PCR試劑盒，按其操作程序反轉成cDNA。RT-PCR反應體系為6.25 μL ddH2O，1 μL cDNA，上游和下游引物各1 μL，6.25 μL SYBR Rremic EX TaqTM，混勻，離心，擴增。擴增程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，退火至63℃，延伸30 s，40個循環；65℃延伸5 s。引物的序列及擴增長度見表1。

表1引物序列及擴增長度

1.5數據分析各組數據應用SPSS17.0軟件統計處理。采用one-way ANOVA方法分析比較各試驗組間差異顯著性。

2結果與分析

2.1HEP對小鼠脾淋巴細胞分泌NO的影響由圖1可知，在HEP濃度為25～400 μg/mL范圍內，其OD值均顯著高于細胞對照組（P＜0.05）。

圖1HEP對脾淋巴細胞分泌NO的影響

2.2HEP協同ConA對小鼠脾淋巴細胞分泌NO的影響由圖2可知，在HEP濃度為100～400 μg/mL范圍內，與ConA具有協同作用，其OD值均顯著高于ConA對照組（P＜0.05）。

2.3HEP對小鼠脾淋巴細胞iNOS mRNA表達量的影響由圖3可知，在HEP濃度為25～400 μg/mL范圍內，其OD值均顯著高于細胞對照組（P＜0.05）。

2.4HEP協同ConA對小鼠脾淋巴細胞iNOS mRNA表達量的影響由圖4可知，在HEP濃度為200～400 μg/mL范圍內，與ConA具有協同作用，其OD值均顯著高于ConA對照組（P＜0.05）。

圖2HEP協同ConA對脾淋巴細胞分泌NO的影響

圖3HEP對脾淋巴細胞iNOS mRNA表達的影響

圖4HEP協同ConA對脾淋巴細胞iNOS mRNA表達的影響

3討論

一氧化氮（NO）是一種具有生物活性的氣體分子，具有生物信使分子和細胞毒分子的雙重作用。少量NO具有抗腫瘤［9］、提高免疫力［10］等多種免疫作用。山豆根多糖可以促進小鼠脾淋巴細胞分泌NO［11］；黃芪多糖可以通過促進小鼠淋巴細胞中NO-cGMP信號系統的效應，提高信息傳遞［12］；硒化乳酸菌胞外多糖可以協同ConA刺激小鼠脾淋巴細胞分泌NO［13］。本研究結果表明，HEP可以單獨或協同ConA促進小鼠脾淋巴細胞釋放NO，說明HEP可以通過促進NO的釋放，增強機體的免疫力。

NO是由L-精氨酸在一氧化氮合酶作用下生成，其含量與NOS的活性呈正相關［1］。因此測定NOS是研究NO生理病理作用的重要環節。NOS可分為神經型（nNOS）、誘導型（iNOS）、內皮型（eNOS）3種類型。研究表明，金櫻子多糖通過提高小鼠脾淋巴細胞中NOS活性，促進NO的產生［24］。本研究結果表明，HEP可以單獨或協同ConA促進iNOS mRNA的表達，說明HEP可以通過促進iNOS mRNA的表達，刺激小鼠脾淋巴細胞釋放NO。

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Effect ofHericium erinaceuspolysaccharideon theproduction of NO and the expression of iNOS mRNA of murinesplenic lymphocytein vitro

ZHENG Nai-zhen，ZHENG Xiao-xiang，TAN Xin-zhu，REN Zhe，MA Yu-fang，HUANG Yi-fan
（Fujian Agriculture and Forestry University，Key Laboratory for Combination with Chinese and Western Veterinary and Animal Health of Fujian Province University，Fuzhou 350002，China）

To investigate the regulating effects of polysaccharides from Hericium erinaceum on nitric oxide（NO）releasing and inducible nitric oxide synthase（iNOS）expression in murine splenic lymphocyte.The production of NO treated with the single stimulation of HEP or the synergistical stimulation of HEP with ConA was determined by Griess，and the expression of iNOS mRNA was detelcted by RT-PCR.HEP at a concentration ranging from 25～400 μg/mL could elevate the production of NO and the expression of iNOS mRNA（P＜0.05）.HEP at a concentration ranging from 100～400 μg/mL could elevate the production of NO and the expression of iNOS mRNA after sensitization with ConA（P＜0.05）.The single stimulation of HEP or the synergistical stimulation of HEP with ConA could significantly increase NO production through elevating inducible NO synthase（iNOS）expression.

Hericium erinaceus polysaccharide；Spleen lymphocyte；NO；iNOS

s：MA Yu-fang；HUANG Yi-fan

R 285.5

A

0529-6005（2016）08-0032-03

2015-05-20

國家自然科學基金面上項目（31372474）

鄭乃珍（1989-），女，碩士生，研究方向為天然藥物的研究與應用，E-mail：821535711@qq.com

馬玉芳，E-mail：myfau850@sohu.com；黃一帆，E-mail：zjhyfang@163.com