4種ELISA試劑盒檢測禽白血病病毒效率比較

楊永立，王培坤，鄒廣珍，吳科敏，焦鵬濤，韋平

（廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病學(xué)研究所，廣西南寧530004）

4種ELISA試劑盒檢測禽白血病病毒效率比較

楊永立，王培坤，鄒廣珍，吳科敏，焦鵬濤，韋平

（廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病學(xué)研究所，廣西南寧530004）

對采集雞蛋清、泄殖腔肛拭子以及蛋清或泄殖腔肛拭子檢測陽性的雞只之血清接種DF-1細胞的上清液，分別采用A、B、C、D 4種ELISA試劑盒進行ALV-P27抗原的3次試驗檢測。結(jié)果顯示，A試劑盒的蛋清和病毒分離的敏感度最高，B試劑盒對肛拭敏感性最高。A試劑盒的3次試驗檢測的符合率都在87%以上，并且較穩(wěn)定，結(jié)果可信度高；C試劑盒的符合率在79%以上，相對穩(wěn)定；B和D試劑盒的符合率都不穩(wěn)定。

禽白血病病毒；酶聯(lián)免疫吸附試驗；蛋清；泄殖腔棉拭子；病毒分離

禽白血病（avian leukosis，AL）是禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）和禽肉瘤病病毒（avian sarcoma virus，ASV）群中的病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。當(dāng)前，主要是采用在種雞場進行規(guī)模化的檢測，淘汰陽性雞群的凈化方式，而ELISA檢測方法是一種特異性好、靈敏度和效率比較高并且方法簡便、容易操作的檢測方法［1-2］，可在規(guī)模化養(yǎng)殖場中推廣。

本研究對從廣西規(guī)模化禽養(yǎng)殖場采集的雞蛋清92份、泄殖腔肛拭子92份，以及蛋清或泄殖腔肛拭子檢測為陽性的雞只抽取血清進行病毒分離收集的上清液92份，共3批樣品，分別用國內(nèi)外四家公司研發(fā)的ELISA試劑盒進行ELISA ALV-P27抗原檢測。通過比較它們對不同樣品的敏感性，檢測結(jié)果的符合率及符合率的穩(wěn)定性，篩選出檢測效率比較高的試劑盒，以便開展禽白血病凈化的養(yǎng)殖場準(zhǔn)確選擇試劑盒，保證凈化雞場的ALV凈化質(zhì)量。

1材料與方法

1.1試驗材料蛋清、泄殖腔肛拭子、血清樣品采集于廣西某雞場；DF-1細胞系本實驗室傳代保存；ELISA檢測試劑盒分別來自國內(nèi)外4家不同的公司，其中A試劑盒來自IDEXX公司；B、C、D試劑盒來自國內(nèi)公司；分別命名為A、B、C、D，4種試劑盒都在有效期內(nèi)，。

1.2樣品處理

1.2.1蛋清、泄殖腔肛拭子處理無菌采集的蛋清樣品，在檢測前凍融3次，待測。無菌棉棒采集的泄殖腔肛拭子加到檢測試劑盒配備的稀釋液中，-80℃冷凍保存，檢測前凍融3次待測。

1.2.2血清處理無菌抽取的血液樣品分離血清。復(fù)蘇實驗室液氮凍存的DF-1細胞，經(jīng)放大培養(yǎng)傳代至4個24孔板，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞對數(shù)生長期接種分離的血清，第3天換液，第9天收集上清液，凍融3次待測。

1.3ELISA檢測對收集蛋清、泄殖腔肛拭子、上清液，用A、B、C、D 4種試劑盒按照試劑盒的使用說明書進行檢測。

2實驗結(jié)果

2.14種試劑盒對蛋清ALV-P27檢測結(jié)果采集廣西某養(yǎng)雞場33周齡母雞的蛋清樣品92份，蛋清凍融3次后每份分成4份。分別使用A、B、C、D試劑盒，按照使用說明書進行檢測，檢測結(jié)果如表1。

表14種試劑盒對蛋清ALV-P27檢測結(jié)果

如表1所示，試劑盒A、B同時檢測出7份陽性，檢出率最高，D試劑盒檢測率最低；陽性符合率方面，A試劑盒的平均符合率最高，為95.24%。

2.24種試劑盒對泄殖腔肛拭子ALV-P27檢測結(jié)果采集廣西某養(yǎng)雞場110日齡雞的肛拭子樣品共92份，分別使用A、B、C、D試劑盒，按照使用說明書進行檢測。檢測結(jié)果如表2。

表24種試劑盒對泄殖腔肛拭子ALV-P27的檢測結(jié)果

如表2所示，試劑盒B檢測陽性率最高，為98.91%，D試劑盒陽性檢出率最低只有40.22%；在陽性符合率上，A試劑盒的平均陽性符合率為96.28%，B試劑盒的為100%，C試劑盒的為93.08%，D試劑盒的最低為43.78%。

2.34種試劑盒病毒分離ALV-P27檢測結(jié)果采集廣西某養(yǎng)雞場110日齡雞的血清樣品共92份，按照經(jīng)典病毒分離方法進行病毒擴大培養(yǎng)；收集上清后使用A、B、C、D試劑盒，按照使用說明書進行檢測。檢測結(jié)果如表3。

表34種試劑盒病毒分離ALV-P27檢測結(jié)果

如表3所示，試劑盒A檢測陽性率最高為18.49%，試劑盒C、D檢測陽性率相同都為14.13%，而B試劑盒檢測陽性率最低為7.61%。4個試劑盒的平均陽性符合率分別為：87.54%、39.97%、82.27%、73.59%。

2.4A、B、C、D 4種試劑盒符合率的比較比較A、B、C、D 4種試劑盒檢測符合率的穩(wěn)定性，如圖1所示，A試劑盒3次試驗中檢測符合率都維持在一個穩(wěn)定的水平；其次是C試劑盒；B、D試劑盒的3次檢測結(jié)果都有較大差異，穩(wěn)定性很低。

圖14種試劑盒在3次試驗檢測中的穩(wěn)定性比較

3討論

目前，禽白血病在我國感染嚴重，我國大多數(shù)省份的禽養(yǎng)殖場中都存在ALV的感染［3-4］。對雞場開展禽白血病凈化，培育無ALV感染的種雞群對我國的禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展來說是刻不容緩的。ELISA、PCR、RT-PCR、RT-qPCR、IFA是常用的ALV檢測方法［5-6］，養(yǎng)殖場凈化主要是采用對原種雞群開展外源性病毒的凈化方法，通過多次的抗原、抗體檢測，了解該原種群的流行亞群并淘汰陽性個體。因此能快速、準(zhǔn)確的在大規(guī)模化養(yǎng)殖場中對ALV進行檢測、操作方法簡單、對試驗人員技術(shù)和實驗條件要求相對不高的ELISA檢測方法是相對其他檢測方法較合適的選擇［7］。

本研究是用國內(nèi)外4種不同的ELISA試劑盒分別對采集的雞的蛋清、泄殖腔肛拭子，以及蛋清或泄殖腔肛拭子檢測為陽性的雞只抽取血清進行病毒分離，進行ALV-P27抗原檢測。從3次的試驗結(jié)果中可以看出，A、B試劑盒對蛋清的敏感度最高；B試劑盒對肛拭子敏感性最高；A試劑盒的病毒分離檢測結(jié)果敏感性最高。從陽性檢出率來看，A和B試劑盒的敏感性相對較好。從3次試驗的檢測符合率來看，A試劑盒的平均符合率是最高的，并且都維持在一個穩(wěn)定的水平，B試劑盒的符合率在第一、第二兩次檢測中都較高，但第3次的符合率極低，不穩(wěn)定，C試劑盒的符合率不高，但都維持在一個穩(wěn)定的水平，D試劑盒的符合率最低，且不穩(wěn)定。檢測結(jié)果顯示，從試劑盒針對不同樣品的檢出率來看，A試劑盒適用于蛋清和病毒分離的檢測，B試劑盒適用于蛋清和泄殖腔肛拭子樣品的檢測。綜合檢出率以及陽性樣品的符合率來看，A試劑盒是最好的選擇，B和C試劑盒次之，D試劑盒的檢測效率和檢測特性有待研究。

通過本次研究試驗的對比可以看出，選擇不同的ELISA檢測試劑盒、不同的樣品，ALV的檢出情況是有很大差異的，可能是檢測試劑盒的特異性差異或是在檢測過程中存在的其他影響因素，同時樣品種類的選擇也會影響ALV的檢出。本試驗研究的目的是通過對比幾種試劑盒的檢測效率，希望在規(guī)模化種禽場凈化過程中，要根據(jù)樣品的種類來選擇敏感性、特異性及符合率高且穩(wěn)定的試劑盒，同時對檢測結(jié)果有疑問的有必要采用ALV的其他檢測方法，如IFA、PCR進行綜合試驗，以保證檢測結(jié)果的質(zhì)量［8-9］。在禽白血病的凈化過程中除了檢測樣品的和試劑盒的選擇外，還有比如雞檢測日齡、檢測指標(biāo)、環(huán)境和生物安全的控制、管理和檢測技術(shù)的水平都會對禽白血病凈化產(chǎn)生重要影響，因此，我們應(yīng)該把對禽白血病凈化產(chǎn)生影響的因素和影響因子降到最低，以達到更好的凈化效果。

［1］葉建強，秦愛建，邵紅霞，等.J亞群禽白血病病毒（ALV-J）ELISA檢測方法的建立［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2006（03）：235-237.

［2］張勝斌，吳天威，韋平，等.地方優(yōu)良雞種禽白血病病毒感染調(diào)查及凈化［J］.中國家禽，2010（12）：11-16.

［3］王培坤，秦麗莉，畢玉彧，等.廣西麻雞感染A亞群與J亞群禽白血病病毒的診斷［J］.中國家禽，2015（05）：56-58.

［4］張志，崔治中，趙宏坤，等.商品代肉雞J亞群禽白血病的病理及病毒分離鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志，2002，38（6）：6-8.

［5］奚德華，梁有志，尹麗萍，等.規(guī)模化種禽場禽白血病檢測方法的比較及初步應(yīng)用［J］.中國家禽，2014（03）：14-17.

［6］莊金秋，梅建國，沈旭，等.禽白血病病毒實驗室檢測方法研究進展［J］.家禽科學(xué)，2012（11）：45-51.

［7］Yun B，Li D，Zhu H，et al.Development of an antigen-capture ELISA for the detection of avian leukosis virus p27 antigen［J］. Journal of Virological Methods，2013，187（2）：278-283.

［8］王鑫，崔治中，龔建森，等.ELISA與IFA用于檢測J亞型禽白血病病毒的比較分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2013，44（09）：1499-1503.

［9］楊飛躍，吳艷，黃翌，等.禽白血病p27抗原檢測陽性與病毒分離的相關(guān)性比較［J］.中國獸醫(yī)雜志，2012，48（5）：26-29.

Thecomparison of detection results of ALV with four ELISA kits

YANG Yong-li，WANG Pei-kun，ZOU Guang-zhen，WU Ke-min，JIAO Peng-tao，WEI Ping
（Institute for Poultry and Health，Guangxi University，Nanning 533033，China）

Four kinds of A，B，C and D commercial ELISA kits were used to detect the ALV-P27 antigen of different samples，albumin samples，cloacal swabs and the DF1 cell supernatants.The results indicated that A ELISA kits was the most sensitive to albumin samples and virus isolation，and B ELISA kit was the most sensitive to cloacal swabs.The A ELISA kit had the highest and most stable coincidence Rate，and the consistent of detection rate in every test were 87%，which are more sensitive and precise than B，C and D.

ALV；ELISA；albumin samples；cloacal swabs；virus isolation

WEI Ping

S852.65+9.3

A

0529-6005（2016）08-0095-03

2015-09-09

國家公益性（農(nóng)業(yè)）行業(yè)科研專項（201203055）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西肉雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（nycytxgxcxtd-04-20-2）

楊永立（1992-），女，碩士生，主要從事禽病學(xué)研究，E-mail：1184397684@qq.com

韋平，E-mail：pingwei8@126.com