鴿源鼠傷寒沙門菌分離鑒定及藥敏試驗

程旭，沈欣悅，劉梅，李建梅，姜逸，趙寶華，戴亞斌

（中國農業科學院家禽研究所，江蘇揚州225125）

鴿源鼠傷寒沙門菌分離鑒定及藥敏試驗

程旭，沈欣悅，劉梅，李建梅，姜逸，趙寶華，戴亞斌

（中國農業科學院家禽研究所，江蘇揚州225125）

從江蘇省某肉鴿場發生的腹瀉癥狀的死亡鴿中采集病料，分離出1株病原菌，通過PCR鑒定菌株，并進一步做藥敏試驗。結果表明，病原菌分離鑒定為鼠傷寒沙門菌，屬于血清O4群，該菌對20種抗生素均敏感。

鼠傷寒沙門菌；分離；鑒定；藥敏試驗

鼠傷寒沙門菌是一群非適應性或泛嗜性的沙門菌，具有廣泛的宿主，是目前世界各國分離率最高的菌型之一。該菌能引起各種家禽和哺乳動物的傳染病，也可引起人類感染，具有重要的公共衛生意義。

由鼠傷寒沙門菌引起的鴿沙門菌病又稱鴿副傷寒，是鴿子常見的細菌性疾病，也是引起鴿子死亡的主要危害病之一。該病既可水平傳播，也可垂直傳播，病鴿和帶菌鴿是本病的主要傳染源。該病的發生無明顯季節性，各種日齡鴿均可感染發病，但以年老體弱鴿只較為易發，病鴿主要表現下痢、關節炎、運動神經功能障礙等癥狀。特別是與其他疾病合并感染暴發，往往給養鴿業造成巨大經濟損失［1］。抗生素對致病菌是非常有效的治療手段，但近年來抗生素的廣泛應用使許多致病菌包括沙門菌產生了耐藥性。隨著時間的推移，耐藥性不斷增強，并且耐藥譜不斷擴增，從而增加了對沙門菌感染治療的難度。因此，合理選擇抗生素治療沙門菌病對于疾病的康復和控制耐藥性的不斷增強具有重要意義［2］。本作者在發生腹瀉癥狀的鴿群中分離并鑒定了一株鼠傷寒沙門菌，并測定了該菌的耐藥情況，為臨床用藥及本病控制提供理論依據。

1材料與方法

1.1主要試劑普通營養肉湯粉、麥康凱瓊脂為上海博微公司產品；Taq PCR Master Mix、100 bp DNA ladder為百泰克公司產品；沙門菌屬診斷血清為寧波天潤生物藥業有限公司產品；藥敏試紙為英國OXOID公司產品。

1.2細菌分離取病死鴿肝臟、脾臟、小腸，加PBS碾磨后，取上清接種麥康凱平板，均勻涂板后倒置于37℃恒溫培養箱中培養18 h。

1.3細菌鑒定普通營養肉湯培養基參考文獻［3］制備，取平板中單個菌落在肉湯培養基中搖菌培養12 h后，收集1 mL菌液，4℃3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS重懸細菌。將該菌在沸水中煮5 min以裂解菌體，分離DNA用于PCR鑒定。

根據GenBank中鼠傷寒沙門菌的16S rRNA基因序列設計1對引物，P1：5′-GCGTCAGATTAGTTAGTTGG-3′；P2：5′-ACCGCTTGTGCGGGCCCG-3′。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。預期擴增目的片段大小為400 bp。

PCR擴增條件94℃預變性5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30個循環，72℃延伸10 min。1.4血清型鑒定根據沙門菌屬診斷血清說明書，在干凈玻片上滴1滴血清，取少量被檢菌苔與血清混勻，輕輕搖動玻片，1 min內肉眼判斷結果，以生理鹽水作陰性對照。出現凝集者為陽性，呈均勻渾濁者為陰性。

1.5藥敏試驗藥敏試驗采用K-B紙片擴散法進行。將分離菌接種于普通營養肉湯中，37℃搖振培養18 h。吸取一定比例稀釋后的菌液均勻涂抹于普通營養瓊脂，將藥敏試紙均勻粘貼在平板上，在37℃恒溫培養箱中倒置培養16 h，測量抑菌圈大小，按美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）推薦的標準［4］判定結果。

2結果與分析

2.1細菌分離培養16 h可見直徑大約1 mm的隆起菌落，圓形、表面光滑、邊緣整齊灰白色菌落。取單個菌落革蘭染色，可見染成紅色的革蘭陰性短桿菌。

2.2細菌鑒定分離細菌搖菌培養后經PCR擴增，取PCR產物10 μL于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，。結果可見在約400 bp處見到一特異、明顯條帶（圖1），與預期結果相符。將擴增PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果與GenBank中鼠傷寒沙門菌基因組核苷酸序列同源性達100%，證實該分離菌為鼠傷寒沙門菌。

圖1分離菌基因組的PCR擴增

2.3血清型鑒定根據沙門菌屬診斷血清說明書操作流程，該鼠傷寒沙門菌與O4單因子血清混勻后，可見明顯絮狀凝集現象，肉眼觀察與陰性對照區別明顯，因此該鼠傷寒沙門菌為O4血清型。

2.4藥敏試驗分析采用21種常規抗生素藥敏紙片進行藥敏試驗，結果顯示，該株鼠傷寒沙門菌對20種藥物均敏感，只有鏈霉素呈現中介（表1）。

3討論

肉鴿養殖作為廣泛的特種經濟養殖項目，具有較高的經濟效益，一旦發生疫病損失也較為慘重。鴿沙門菌病就是其中一種影響較大的疫病。沙門菌可以水平傳播，也可以通過患鴿或帶菌的親鴿哺乳行為垂直傳播，這給該病的防治帶來一定的難度。目前還沒有可行的疫苗進行免疫，抗生素作為首選預防和治療鴿沙門菌病被廣泛運用，但是在抑制殺滅有害菌的同時，也會抑制一些有益菌，從而導致菌群失調，機體抵抗力下降誘發其他疫病。因此根據藥敏試驗進行藥物的選擇對于有效的治療鴿沙門菌病及防止耐藥性的產生具有重要意義。

作者在一起幼鴿呼吸道癥狀伴有腹瀉的鴿場中分離獲得1株細菌，經PCR鑒定后為鼠傷寒沙門菌，血清型鑒定該鼠沙門菌屬于O4血清群。9類21種常用抗生素進行藥敏試驗顯示，該菌株對20種抗生素均敏感，只對鏈霉素為中介，這與該鴿場較少使用抗生素的情況相符。根據藥敏試驗結果，選用喹諾酮類抗生素治療后，全群狀況轉好，幼鴿死亡率降低。

在目前集約化的養殖情況下，防止鴿沙門菌病的發生，應該做到管理帶動預防的措施。采用科學的檢測方法進行檢疫，掌握飼養場沙門菌流行情況，嚴格遵守衛生防疫措施，按照凈化方案進行檢疫和淘汰，控制和消滅傳染源，防止和減輕沙門菌對種鴿的危害。

表1分離菌株耐藥性結果

［1］周宏贊，張文.肉鴿沙門菌病［J］.中國獸醫雜志，2000，36（1）：36.

［2］況彗星，韋婷.禽沙門菌的檢測與防制［J］.中國家禽，2003，04：1-4.

［3］俞樹榮.微生物學和微生物學檢驗［M］.北京：人民衛生出版社，2002：169-175.

［4］Nccls.孫長貴，譯.Nccls抗微生物藥物敏感性試驗執行標準［DB/OL］.2009.

S836

B

0529-6005（2016）08-0099-02

2015-04-27

公益性行業（農業）科研專項（201303044）；江蘇省科技支撐計劃（BE2014363）；揚州市自然科學基金面上項目（YZ2015103）

程旭（1983-），男，助理研究員，碩士，主要從事禽病研究，E-mail：peterchengxu@126.com

戴亞斌，E-mail：ybdai@163.com