溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶基因cbs的克隆、生物學信息分析及原核表達

陳樹河，常云勝，劉暉暉，周 維，丁 燏

（廣東海洋大學水產學院 // 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東 湛江 524088）

溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶基因cbs的克隆、生物學信息分析及原核表達

陳樹河，常云勝，劉暉暉，周 維，丁 燏

（廣東海洋大學水產學院 // 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東 湛江 524088）

提取溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的總DNA，克隆溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶基因cbs，對其進行生物信息學分析。結果表明，所克隆溶藻弧菌cbs基因的開放閱讀框為1 095 bp，編碼364個氨基酸。氨基酸序列比對發現，溶藻弧菌的CBS蛋白與其他弧菌的CBS相似性極高，與副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）CBS氨基酸序列相似性達98%；CBS蛋白質的二級結構為典型的“α+β”折疊模式，無跨膜結構及信號肽。構建cbs基因表達載體（pGEX-cbs）以表達重組蛋白，結果顯示，cbs基因在大腸桿菌BL21中高效表達，可表達出分子質量約為66.4 ku的融合蛋白。對表達條件進行優化，發現在37℃、IPTG濃度0.6mmol/L的條件下誘導5 h后，CBS蛋白的表達量較多，該蛋白主要以包涵體形式存在。

溶藻弧菌；胱硫醚-β-合成酶；基因克隆；生物學信息分析；原核表達

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）隸屬于弧菌科弧菌屬，可引起人類和水產養殖動物患?。?-2］。溶藻弧菌病的暴發對魚、蝦及貝類等水產養殖動物危害極大［3-5］，給水產養殖業所造成的損失難以估量。目前，水產養殖上主要使用抗生素防治溶藻弧菌病。然而，抗生素的長期使用可增加耐藥菌的出現頻率，導致抗生素抑菌效果明顯下降甚至消失［6］。在弧菌對抗抗生素的過程中，抗氧化系統發揮著重要的作用。研究發現，H2S作為信號分子，在植物抗環境脅迫［7］、動物促炎［8］等方面有獨特功能，在細菌抗氧化過程中有重要作用［9］。Qabazard等［10］研究發現，H2S在上調秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）抗氧化基因表達的同時，亦可能維持其呼吸鏈復合體Ⅱ的活性，從而調節其氧化系統以對抗農藥的毒害，延長壽命。對細菌而言，內源性H2S亦可提高超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶活力，從而提高其抗氧化能力，減輕抗生素的毒害［9］。

除植物外，在生物細胞中內源性H2S的生成有兩支途徑。一支是由胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）直接以半胱氨酸等含硫氨基酸為底物生成 H2S，另一支則是半胱氨酸經半胱氨酸轉氨酶轉氨作用生成 3-巰基丙酮酸后，再由 3-巰基丙酮酸硫基轉移酶（3-MST）進一步催化生成H2S。CBS、CSE和3-MST均為磷酸吡哆醛依賴酶，在動物體內的分布具有組織特異性［11-16］，在細菌中也不同時存在［9］。CBS在微生物細胞中可參與含硫氨基酸的生理代謝［17］和H2S的生物合成，提高微生物抗環境脅迫能力。目前在溶藻弧菌中僅發現編碼CBS蛋白的基因，推斷該酶在弧菌抵抗抗生素過程中發揮著不可替代的作用。因此，分析溶藻弧菌的CBS蛋白，對進一步闡明H2S在溶藻弧菌抗氧化系統中的作用與地位有重要意義。

本研究克隆溶藻弧菌 cbs基因，并運用生物信息學方法對其所編碼的蛋白進行序列分析和結構預測，同時構建cbs基因大腸桿菌BL21重組表達菌株，對CBS蛋白的表達條件進行優化，這將有助于了解弧菌的抗氧化機制，為水產病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus HY9901）強毒株分離自湛江市海域的患病紅笛鯛傷口處，經分子生物學鑒定后由廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室（下稱“本實驗室”）保存［18］，Escherichia coli DH5α和E.coli BL21購自全式金公司。

1.1.2 質粒 克隆質粒pMD18-T購自TaKaRa公司，表達質粒pGEX-6p-1由本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 細菌基因組取試劑盒購自全式金公司，DNA凝膠回收純化試劑盒購自Thermo公司，PCR引物由上海生工合成，T4連接酶、BamHI和XhoI購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 溶藻弧菌總DNA的提取 溶藻弧菌在TSA培養基于28℃的搖床中培養10 h，按照細菌基因組提取試劑盒說明書提取溶藻弧菌的總 DNA，于- 20℃條件下保存。

1.2.2 cbs基因的克隆 從GenBank中下載溶藻弧菌cbs基因序列（登錄號WP_005389952.1），設計引物cbs（s）（5' -CGGGATCCATGTGTACTGACC ACAATTG-3'）和cbs（a）（5' -CCGCTCGAGTTA AGCGTTAGTTGAGCCGC-3'），下劃線部分分別為BamHI和XhoI酶切位點。以溶藻弧菌總DNA為模板擴增cbs基因，擴增程序：94℃ 4 min；94℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 1.5 min，35循環；72℃ 10 min。擴增產物經10 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收，于- 20℃條件下保存。

1.2.3 pMD18-cbs克隆載體的構建 連接成功后轉化至E.coli DH5α感受態細胞中，將轉化產物涂布于Amp+的LB瓊脂平板，37℃條件下培養8 h。挑單菌落，接種于Amp+的LB液體培養基中，于搖床中以37℃、200 r/min條件培養0.5～1.0 h，經菌落PCR檢測，將陽性菌送生工生物工程股份有限公司廣州分公司測序。

1.2.4 pGEX-cbs表達載體的構建 經測序確認序列正確后，分別提取質粒pGEX-6p-1和pMD18-cbs，經BamHI和XhoI雙酶切后用T4DNA連接酶將酶切的 pGEX-6p-1和目的片段重組，構建重組質粒pGEX-cbs，轉化至E.coli BL21感受態細胞，參照1.2.3的步驟，將陽性菌送測。

1.2.5 pGEX-cbs重組質粒的誘導表達 將含有pGEX-cbs表達載體的大腸桿菌 BL21接種于Amp+的LB液體培養基中，在37℃的搖床200 r/min擴培至D（600 nm）值達0.4～0.6時加入IPTG，使其終濃度為1mmol/L，繼續培養4 h。菌體預處理后全菌蛋白后經 SDS-PAGE分析。以含空載質粒pGEX-6p-1的 E.coli BL21作為空白組，同時從IPTG濃度、時間和溫度3個方面優化胱硫醚-β-合成酶的表達條件。

1.2.5.1 最佳誘導濃度的確定 在其他培養條件一致的前提下，IPTG誘導濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L，菌體預處理后進行SDS-PAGE分析。

1.2.5.2 最佳誘導時間的確定 在最佳誘導濃度條件下，其他培養條件保持一致，分別誘導1、2、3、4、5、6、7 h，菌體預處理后進行SDS-PAGE分析。

1.2.5.3 最佳誘導溫度的確定 在最佳誘導濃度和誘導時間條件下，分別在 16、29、37℃下誘導培養，收集菌體后超聲波破碎至菌液澄清，離心收集上清和沉淀采用SDS-PAGE進行分析。

2 結果與分析

2.1 cbs基因的克隆

PCR擴增后經瓊脂糖凝膠電泳檢測出約1 200 bp的條帶（圖1：A），連接pMD18-T克隆載體后轉化至大腸桿菌DH5α感受態中，挑單菌落進行菌落PCR得到與其大小一致的條帶（圖1：B）。

2.2 CBS蛋白的生物信息學分析

2.2.1 CBS蛋白的理化性質 用 NCBⅠ上的 ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.Gov/gorf/gorf.html）分析cbs基因序列，發現該基因包含長度為1 095 bp的開放閱讀框（ORF），可編碼364個氨基酸（圖2）。在ExPASy（http：//web.expasy.Org/compute_pi/）網站上對溶藻弧菌HY9901的CBS蛋白進行分析，顯示原子總數為5 629，理論分子質量為40.410 ku，蛋白質分子式為C1788H2787N491O548S15，理論等電點為 5.65，在大腸桿菌中表達的半衰期大于 10 h，脂肪指數（Aliphatic index）為81.76，親水性平均值（GRAVY）為-0.304，不穩定指數 ［instability index（ⅠⅠ） ］為39.63。此外，該蛋白中正（Arg+Lys）、負（Asp+Glu）電荷氨基酸殘基數分別為37 和 45，使得整個蛋白分子對外呈酸性。

圖1 cbs基因克隆及菌落PCR產物Fig.1 Cloning and identification PCR of cbs gene

2.2.2 與其他弧菌的CBS蛋白序列同源性分析通過 Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.Gov/Blast.cgi）對溶藻弧菌的 CBS蛋白序列與副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、創傷弧菌（V.vulnificus）、燦爛弧菌（V.splendidus）、霍亂弧菌（V.cholerae）等進行同源性對比，結果顯示，其同源性分別為98%、94%、89%、83%、80%，表明 CBS蛋白在弧菌中高度保守（圖 3）。運用MEGA 6.0軟件將各弧菌及其他細菌的CBS蛋白氨基酸序列以NJ法構建的構建系統進化樹，結果顯示果溶藻弧菌 HY9901與副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）聚為一支，表明兩種弧菌間的親緣關系最為接近（圖4）。

圖3 藻弧菌CBS氨基酸序列與其他細菌的同源性比較Fig.3 Homology comparing of amino acid sequences of CBS protein among the bacteria

2.2.3 CBS蛋白的功能位點、親疏水性、跨膜區和亞細胞定位預測 經 SoftBerry-Psite（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=psite&group=programs&subgroup=proloc）預測，CBS蛋白含有4個蛋白激酶C磷酸化位點、5個酪蛋白激酶II磷酸化位點和1個酪氨酸激酶磷酸化位點等10個磷酸化位點，此外還具有N-糖基化位點、酰胺化位點、內質網靶信號位點和Prenyl group binding site（CAAX box）各1個（圖2）。由ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）預測的CBS蛋白親疏水性結果（圖5）可知，CBS蛋白質序列的第99個氨基酸分值最高達2.522，表明該處疏水性最強，第304個氨基酸分值最低達 - 2.411，表明該處親水性最強。由圖5可知，整個CBS蛋白序列的親水氨基酸殘基數目從整體上大于疏水氨基酸殘基數目，且該蛋白的親水區集中分布在第106～337位氨基酸間，表明CBS蛋白為可溶性蛋白，與ExPASy的親水性預測一致。經 TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測發現，該蛋白不存在跨膜區（圖6）。利用SignalP 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）對CBS蛋白進行信號肽序列預測，發現剪切位置分值C、信號肽分值S和綜合值Y均在0～0.2之間，大大低于0.5的閾值，說明其無明顯的信號肽切割位點，表明該蛋白不屬于分泌型蛋白（圖 7）。用 PSORT II Prediction（http://psort.hgc.jp/form.html）對CBS蛋白進行亞細胞定位預測，結果顯示，該蛋白僅分布于細菌細胞質中，可能性為38.1%，這與該蛋白不存在跨膜區和不屬于分泌型蛋白的預測結果相互印證。

圖4 鄰接法構建的CBS氨基酸序列系統進化樹Fig.4 Hylogenetic tree of amino acid sequence of CBS protein by neighbour-joining method

2.2.4 CBS蛋白質的功能域及高級結構的預測在NCBI保守結構域數據庫CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi）網站上分析該蛋白序列中的功能結構域（圖8），結果均發現第23～336位存在Trp-synth-beta-II superfamily的保守結構域。經SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）預測，CBS蛋白中的二級結構中存在由140個氨基酸組成α螺旋（Alpha helix）、66個 氨 基 酸組成伸展片段（Extended strand）、40個氨基酸組成β轉角（Beta turn）、118個氨基酸組成無規則卷曲（Random coil），分別占CBS蛋白序列的 38.46%、18.13%、10.99%、32.42%（圖9）。以SWISS-MODEL網站（http://swissmodel.expasy.org/）對CBS蛋白進行同源建模后，得到 CBS三級結構。結果顯示，CBS結構比較復雜，且與果蠅（Drosophila）的CBS蛋白A鏈有著極其相似的構型（圖10）。

2.3 原核表達

cbs基因在IPTG誘導下，表達出約66.4 ku的融合蛋白，其中 pGEX-6p-1表達的標簽蛋白約為26 ku，則CBS蛋白的分子質量為40.4 ku，與所預測的分子質量相一致?？瞻捉M未發現融合蛋白的條帶，說明表達載體的構建及原核表達成功（圖11）。

圖5 CBS蛋白親疏水性預測Fig.5 Predicted hydrophobicity of CBS protein

圖6 溶藻弧菌CBS蛋白質跨膜結構預測Fig.6 TMHs prediction of CBS protein in Vibrio alginolyticus HY9901

圖7 溶藻弧菌CBS蛋白質的信號肽/序列預測Fig.7 TMHs prediction of CBS protein in V.alginolyticus

圖8 預測的CBS蛋白保守結構域Fig.8 Conserved domain prediction of CBS protein

圖9 溶藻弧菌CBS蛋白質對應的二級結構Fig.9 Secondary structure prediction domains of CBS protein in Vibrio alginolyticus HY9901

圖10 溶藻弧菌（A）、果蠅（B） CBS的三級結構Fig.10 Three-dimensional structure of CBS in Vibrio alginolyticus（A） and Drosophila（B）

圖12可知，IPTG濃度0～1.0mmol/L時，cbs表達量先增加后回落，0.6mmol/L時表達量最高（圖12）；在最佳誘導濃度條件下，誘導5 h后CBS的表達量達到最大（圖 13）；在最佳誘導濃度和誘導時間條件下，CBS的最適誘導溫度為37℃（圖14）。

在最佳的IPTG濃度、時間條件下誘導CBS表達，發現在 16、29、37℃誘導時沉淀和上清中均有融合蛋白條帶，但在3個溫度下上清液的融合蛋白條帶均不明顯，在 29、37℃條件下誘導時沉淀中有較明顯蛋白條帶，且 37℃條件下誘導時沉淀中蛋白條帶最亮，說明CBS蛋白在這2個溫度下表達時以包涵體形式存在于E.coli 中（圖14）。

圖11 CBS原核表達分析Fig.11 Analysis of CBS prokaryotic expression

圖12 IPTG誘導濃度的優化Fig.12 Optimization of induction concentration

圖13 IPTG誘導時間的優化Fig.13 The optimization of induction time

圖14 IPTG誘導溫度的優化以及沉淀和上清中蛋白含量的比較Fig.14 Optimization of induction temperature and comparison of protein concentration between the precipitation and the supernatant

3 討論

3.1 溶藻弧菌CBS蛋白的生物信息學分析

CBS蛋白作為合成H2S的酶類，可催化信號分子的形成，在生物機體的硫代謝過程中扮演著重要的角色。本研究以NCBI 網站上所公布的cbs基因序列為模版設計特異性引物，擴增得1 095 bp的cbs基因序列，可編碼含364個氨基酸的CBS蛋白。比對各弧菌CBS蛋白的氨基酸序列，發現CBS蛋白在弧菌中高度相似，說明該蛋白在弧菌進化歷程中比較穩定，可能與弧菌適應環境有關?；?CBS的氨基酸序列構建系統進化樹表明，各弧菌聚為一大族，其中溶藻弧菌HY9901與副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）聚為同一亞族，表明它們之間親緣關系較近，這與形態學和生化特征分類結果基本一致。根據氨基酸序列比對結果，推測CBS蛋白可能作為弧菌屬的共同抗原，在弧菌致病過程中發揮著作用。

本研究發現，CBS蛋白含有4個蛋白激酶C磷酸化位點、5個酪蛋白激酶II磷酸化位點和1個酪氨酸激酶磷酸化位點等多個磷酸化位點，此外還具有N-糖基化位點、酰胺化位點、內質網靶信號位點和Prenyl group binding site（CAAX box） 各1個。磷酸化是生物最為常見的蛋白翻譯后修飾［19-20］，可提高蛋白作用的專一性的效率。雖然溶藻弧菌中缺乏對翻譯后蛋白深加工的內質網和高爾基體，無法進行翻譯后糖基化位或酰胺化等修飾，但其蛋白質的磷酸化修飾并不受此影響［21］，這為CBS在合成內源性H2S的生理過程中提供精確的調控。在后續的研究中，可以通過構建磷酸化位點缺失的突變株來對CBS蛋白進行更為詳盡的功能分析。進一步分析發現，該蛋白為可溶性蛋白，不存在跨膜區，亦無明顯的信號肽切割位點，說明該蛋白僅在細胞周質中發揮生理作用，這與亞細胞定位預測結果相吻合，但目前并無直接證據表明CBS蛋白與溶藻弧菌的致病性無關。

本研究預測，CBS蛋白的二級結構含有由140個氨基酸組成的α螺旋（Alpha helix）和40個氨基酸組成的β轉角（Beta turn），這符合“α+β”的折疊模式［22］。該二級結構進一步折疊成介于二級和三級結構的Trp-synth-beta-II superfamily（色氨酸合成酶β-II超家族）的保守結構域。色氨酸合成酶可以L-半胱氨酸和吲哚為原料合成L-色氨酸［23］，這表明CBS蛋白可作為多功能酶在H2S生成量過高時通過消耗L-半胱氨酸含量以下調H2S的生物合成，從而防止細胞過度抗氧化。從CBS的三級結構可發現，該蛋白的三級結構與果蠅的CBS蛋白A鏈極為相似，說明其在微生物和動物的進化歷程中極其保守，推測溶藻弧菌與果蠅的CBS蛋白可能來自相同的遠古基因。

3.2 溶藻弧菌cbs 基因的原核表達

目的基因在大腸桿菌中的表達主要受誘導物濃度、誘導時間和誘導溫度等因素影響。IPTG雖可誘導CBS蛋白的表達，但其本身有一定毒性［24］，誘導物濃度過高反而抑制蛋白的表達，使目的蛋白的表達水平隨誘導物濃度增加呈現先上升后下降的趨勢，在誘導物濃度0.6mmol/L時CBS蛋白表達量最大。雖然IPTG可在菌體中穩定存在并持續誘導啟動子的轉錄，但基因表達水平存在相應的閾值，到達這一閾值后，基因轉錄會受到負反饋調節［25］。隨著表達蛋白的積累，蛋白的表達水平受到調控［26］，誘導5 h后CBS蛋白表達量不再增加。對大腸桿菌而言，其最適生長溫度接近37℃［27］。本研究中，在該溫度下CBS蛋白表達量最大，且以包涵體形式存在。王利群等［28］研究表明，較低溫度更利于大腸桿菌（DE3）增加目的蛋白的可溶性，可能與低溫環境下可增加蛋白構象的準確性［29］、促使其疏水和親水側鏈基團正確排布有關，但本研究顯示，較低溫度下（16、29℃）上清液中目的蛋白含量并不顯著增加，說明通過降低溫度而增加可溶性蛋白的方法并不適用于所有大腸桿菌。因此，可通過在原核表達過程中使用融合標簽［30］、目的蛋白與分子伴侶共表達［31］以及在培養基中加入山梨醇等穩定蛋白三維構象的物質［32］等方法提高可溶性蛋白產量，便于后續的回收和純化。

4 小 結

本研究克隆出溶藻弧菌cbs基因。生物信息學分析顯示，溶藻弧菌的 CBS 蛋白序列與各種細菌的相似性較高，其三級結構與果蠅的CBS蛋白A鏈相似性極高，表明CBS蛋白在生物的進化歷程中極其保守。原核表達結果發現，在37℃、IPTG 濃度0.6mmol/L的條件下誘導5 h目的蛋白的表達量最高，主要以包涵體形式存在。在純化蛋白時，應注意在溶解包涵體的過程中保持蛋白的生物活性。今后可利用純化的 CBS蛋白開展相關的免疫抗原研究，以制備高效的弧菌疫苗。

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［32］李丹，姜新民，嚴拯宇.熒光光譜法研究山梨醇與牛血清白蛋白的相互作用［J］.光譜學與光譜分析，2008（6）:1312-1316.

（責任編輯：劉慶穎）

Cloning，Bioinformatics Analysis and Prokaryotic Expression of Cystathionine-β-Synthase Gene cbs from Vibrio alginolyticus

CHEN Shu-he，CHANG Yun-sheng，LIU Hui-hui，ZHOU Wei，DING Yu
（Fisheries College of Guangdong Ocean University // Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemilogy for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088，China）

The cystathionine-β-synthase gene cbs from Vibrio alginolyticus was cloned，and then the CBS protein was analyzed by bioinformatics method.The result shows that the open reading frame（ORF） of gene cbs is 1 095 bp and encodes 364 amino acids.The amino acid sequence alignment shows that there exists the higher homology of the CBS between V.alginolyticus and other Vibrios，with close relations to those of V.parahaemolyticus with about 98% homology.The secondary structure of CBS protein is a typical fold of “α + β” without signal peptide and transmembrane.A prokaryotic expression vector（pGEX-cbs） is constructed to express recombinant protein，and then the gene cbs is expressed highly in the recombinant E.coli BL21，with approximately 66.4 ku exogenous proteins in SDS-PAGE.The optimal induction conditions shows that it can achieve higher protein expressions when induced by 0.6mmol/L of IPTG at 37℃ for 5 h.

Vibrio alginolyticus； cystathionine-β-synthase； gene cloning； bioinformatics analysis；prokaryotic expression

Q75

A

1673-9159（2016）03-0020-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.03.004

2015-01-08

廣東省自然科學基金（2014A030313604）；廣東海洋大學“創新強校工程”項目［Q14196（2013050207）］

陳樹河，男，碩士研究生，研究方向為海洋生物學。E-mail：cshgdou@163.com

丁 燏（1971-），男，博士，教授，研究方向為海洋微生物與水產病害，E-mail：dingy@gdou.edu.cn