Agrobacteriumtumefaciens OAH-01產脲酶發酵培養基優化

侯恩玲， 劉良禹， 林金雪嬌， 毛相朝

中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003

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AgrobacteriumtumefaciensOAH-01產脲酶發酵培養基優化

侯恩玲， 劉良禹， 林金雪嬌， 毛相朝*

中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003

氨基甲酸乙酯(EC)是大多數發酵制品中的潛在致癌物，而尿素是EC的最主要前體物質之一，因此需要采取相關措施控制發酵制品中尿素的含量。向酒體中添加脲酶具有安全、高效和處理條件溫和等優點，是FDA推薦的降低EC 含量的優先方法。微生物是脲酶的主要來源，可利用其實現脲酶的大規模生產。本文以產脲酶根癌農桿菌AgrobacteriumtumefaciensOAH-01為研究對象，考察了該菌株的生長曲線和產酶曲線，證明該菌株產脲酶屬生長關聯型，且能在較短時間內達到最大產酶量，此外還研究了發酵培養基組成對該菌發酵產酶的影響，通過單因素及正交試驗優化確定了最佳發酵培養基組成(g/L)：蛋白胨20，酵母粉5，葡萄糖5，FeCl30.54，Na2HPO40.5，KH2PO40.5，NiSO40.1，起始pH 7.0。在最適條件下發酵16 h，菌懸液中脲酶酶活可達1.077 U/mL，為優化前的2.4倍。超聲破碎后細胞上清中的脲酶活性為0.419 U/mL，為優化前的4.4倍。

氨基甲酸乙酯； 根癌農桿菌； 脲酶； 發酵優化

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)是一種致癌物質，廣泛存在于發酵食品如醬油、面包、奶酪及酒精飲料中，是發酵過程中的天然副產物[1,2]。2007年，國際癌癥研究機構將其由第2B組“或可能令人類患癌的物質”改為第2A組“可能令人類患癌的物質”[3]。目前許多國家都制定了EC的限量標準，加拿大是第一個制定酒精飲料中EC限量標準的國家，此后，美國、日本、韓國等國家也相繼制定了部分飲料中EC的限量標準，同時該物質在2002年成為聯合國糧農組織重點監控物質，并制定出國際標準，食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)在第64次會議上建議，應盡可能減少發酵食品和飲料中的EC含量，同時世界衛生組織也提議應該制定酒類飲料中EC含量限量標準[4]。在酒精制品的發酵和存儲過程中，尿素被認為是EC的主要前體物質，它可以同乙醇反應而轉化成EC[5, 6]。因此，控制酒精飲料中的尿素含量是減少EC含量的關鍵。

根據相關報道及實際應用情況，可從3個方面控制尿素的含量：(1)對原料進行處理。尿素常用于作為肥料，糧食原料中會有尿素殘留，而通過精制加工，可以有效減少尿素和精氨酸(尿素的前體物質)含量[7]；(2)降低發酵過程中尿素的生成。通過控制發酵過程中尿素的合成代謝途徑從而達到降低尿素含量的目的。例如，Kitamoto等構建了一株工程清酒酵母，該酵母在發酵過程中不產生尿素和EC[8]，Suizu等則發現當敲除酵母Saceharomycescerevisiae的CAR1基因后，將不再有尿素的積累[9]。(3)通過添加脲酶來分解尿素。據報道，通過添加酸性脲酶可以有效降低尿素含量[10]。Liu等報道一株Enterobactersp.，其產生的酸性脲酶可以去除黃酒中66.5%的尿素[11]。Zhou等也報道市售的酸性脲酶可以去除黃酒中80%的尿素[12]。微生物是脲酶的主要來源。雖然關于細菌、真菌和放線菌產脲酶的報道較多，但不同菌種所產脲酶的性質及其產酶能力存在很大差異，從中尋找能適用于發酵食品生產的脲酶，具有現實意義。目前將微生物來源脲酶應用于降解發酵食品中的尿素，從而降低EC含量的相關研究仍較少見。本實驗室自主篩選得到一株產脲酶的根癌農桿菌AgrobacteriumtumefaciensOAH-01，以該菌株為研究對象，通過單因素及正交試驗對其發酵培養基組成進行優化，確定了該菌株的最佳產酶條件，提高了菌株的產酶量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

根癌農桿菌AgrobacteriumtumefaciensOAH-01由本實驗室篩選并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC NO.10914。

1.1.2 主要試劑

蔗糖、D-果糖、麥芽糖、α-乳糖、硫酸銨、FeCl3、KH2PO4、Na2HPO4、MnSO4·4H2O、NiSO4·6H2O、MgSO4·7H2O等購自國藥集團化學試劑有限公司，蛋白胨、酵母粉購自Oxoid公司，瓊脂、尿素購自Sigma公司。

1.1.3 培養基及主要試劑

LB培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.0。

脲酶選擇培養基(g/L)：蛋白胨1，NaCl 5，葡萄糖0.1，KH2PO42，尿素2，酚紅0.012，瓊脂15，pH 6.80。121 ℃滅菌20 min。

復篩培養基(g/L)：不添加瓊脂，其余同脲酶選擇培養基。

發酵培養基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖5，KH2PO40.5，Na2HPO40.5，MnSO4·4H2O 0.055，NiSO4·6H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0。121 ℃滅菌20 min。

顯色劑Ⅰ：稱取15.0 g苯酚加 0.625 g 亞硝基鐵氫化鈉，加水溶解，定容至 250 mL。

顯色劑Ⅱ：稱取13.125 g 氫氧化鈉，加適量水溶解，再向其中加入7.5 mL 次氯酸鈉，定容至 250 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶活測定方法

底物為3%尿素，反應緩沖液為0.05 mol/L 檸檬酸緩沖液(pH 4.5)，將50 μL適當稀釋的發酵液加入1 mL反應體系中，在37 ℃下反應15 min后，加1 mL 10%三氯乙酸終止反應，再加1 mL顯色劑I和1 mL顯色劑II。37 ℃反應15 min后定容至25 mL，測OD625。酶活單位定義(U)：在上述條件下反應，每分鐘釋放1 μmol氨定義為一個酶活單位。

1.2.2 菌株生長和產酶特性測定

為研究菌株A.tumefaciensOAH-01的生長和產酶特性。將保藏的菌種接種至LB培養基中37 ℃、180 r/min震蕩培養24 h，然后將活化后的菌液按照2.5%的接種量接入上述發酵培養基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養。24 h內每隔4 h取樣測定搖瓶發酵液中的菌體濃度和酶活性，每次測三個平行樣。

1.2.3 碳源對菌株發酵產酶的影響

(1)不同碳源對菌株發酵產酶的影響：配制不同碳源(葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖、α-乳糖，濃度均為5 g/L)的發酵培養基，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于含不同碳源的發酵培養基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養16 h后，測定菌懸液中的脲酶活力，比較不同碳源對菌株發酵產酶的影響。

(2)碳源濃度對菌株發酵產酶的影響：選擇發酵產酶水平最高的碳源為最優碳源，將其在發酵培養基中的濃度分別調整為0.5 g/L、1 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L和20 g/L，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于含不同濃度碳源的發酵培養基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養16 h后，測定菌懸液中脲酶活力以確定最佳碳源濃度。

1.2.4 氮源對菌株發酵產酶的影響

(1)不同氮源對菌株發酵產酶的影響：配制不同氮源(蛋白胨，氯化銨、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸鉀濃度均為5 g/L)的發酵培養基，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于含不同氮源的發酵培養基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養16 h后，測定菌懸液中的脲酶活力，比較不同氮源對菌株發酵產酶的影響。

(2)氮源濃度對菌株發酵產酶的影響：選擇最優氮源，將其在發酵培養基中濃度分別調至5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L和80 g/L，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于含不同濃度氮源的發酵培養基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養16 h后，測定菌懸液中的脲酶活力，確定最佳氮源濃度。

1.2.5 酵母粉對菌株發酵產酶的影響

原始發酵培養基中不含酵母粉，通過向初始發酵培養基中添加0 g/L、0.5 g/L、1 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L和25 g/L的酵母粉配制發酵培養基，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于含不同濃度酵母粉的發酵培養基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養16 h后，測定菌懸液的酶活力，考察酵母粉對菌株發酵產酶的影響。

1.2.6 發酵初始pH對菌株產酶的影響

分別配制不同初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)的發酵培養基，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于不同pH的發酵培養基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養16 h后，測定脲酶活力，比較不同初始pH對菌株發酵產酶的影響。

1.2.7 常見金屬離子對菌株發酵產酶的影響

向除去金屬離子的發酵培養基中添加不同濃度的Ni2+、Mn2+、Mg2+、Fe3+、Na2HPO4和KH2PO4離子，按照2.5%的接種量將活化后的菌液接種于含不同濃度金屬離子的發酵培養基(40 mL/250 mL三角瓶)中37 ℃、180 r/min震蕩培養16 h后，測定菌懸液中的脲酶活力，考察不同金屬離子及金屬離子的不同濃度對菌株發酵產酶的影響。

1.2.8 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、FeCl3四因素，以發酵后菌懸液中的脲酶活力為指標，做四因素三水平正交試驗，優化發酵培養基配方。試驗設計如下表1。

表1 正交試驗L27(35)

2 結果與討論

2.1 菌株A.tumefaciensOAH-01的生長及產酶特性

菌株A.tumefaciensOAH-01生長曲線和產酶曲線如圖1所示。4 h內菌體處于延滯期，生長緩慢，產酶量較小。4 h后菌體進入指數生長期，產酶水平也隨著菌體密度增加而迅速提升，說明產酶屬于生長關聯型。16 h時，菌體密度達到最大，之后進入穩定期和衰退期。而16 h脲酶活力也達到最大，表明酶活力和菌體量顯著相關，這與Liu等報道的Enterobactersp.菌株類似[11]。根據前人的文獻報道，Lactobacillusfermentum需30 h～72 h酶活力水平才能達到最高[13]，而Proteusmirabilis則至少需72 h[14]。與之相比，A.tumefaciensOAH-01產酶峰值到來的時間顯著縮短。

圖1 菌株A. tumefaciens OAH-01的

2.2 碳源對菌株發酵產酶的影響

2.2.1 不同碳源對菌株發酵產酶的影響

碳源是組成細胞骨架及菌體生長代謝不可缺少的營養成分，不同菌體中所含有的酶系不同，因此對不同碳源的利用率也不同，菌種利用不同種類的碳源得到的菌體量和產酶量也有很大差異。不同種類的碳源對菌株A.tumefaciensOAH-01發酵產酶的影響如圖2A所示，從圖中可以看出，當葡萄糖為碳源時所得脲酶酶活水平最高，使用其他4種碳源，所得脲酶酶活力相差不大，但均低于葡萄糖，因此選擇葡萄糖作為發酵培養基中的碳源。

2.2.2 碳源濃度對菌株發酵產酶的影響

考察不同葡萄糖濃度對菌株發酵產酶的影響。如圖2B所示，葡萄糖濃度對菌株發酵產酶影響較大。當葡萄糖濃度為0.5 g/L和1.0 g/L時，發酵產酶活力較低，說明碳源濃度低會使菌體營養不足，產酶量少。當葡萄糖濃度增加到5.0 g/L時，酶活顯著增加并達到最大值，進一步增加葡萄糖濃度，酶活開始呈現下降趨勢，說明碳源濃度過高反而會抑制菌體產酶。因此，葡萄糖的最佳濃度為5.0 g/L。

2.3 氮源對菌株發酵產酶的影響

2.3.1 不同氮源對菌株產酶的影響

氮源是菌體細胞和各種含氮物質的構成成分，也是菌體生長合成代謝產物必不可少的營養成分。不同種類氮源對發酵產酶影響如圖2C所示。從圖中可看出，當以蛋白胨作為氮源時，菌株生長狀況良好，而使用其他種類氮源進行發酵，16 h后，發酵液仍保持澄清狀態，菌體沒有明顯生長跡象。這說明菌株A.tumefaciensOAH-01無法有效利用氯化銨、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸鉀等無機氮源進行菌體生長。因此選擇蛋白胨作為發酵培養基氮源。

2.3.2 氮源濃度對菌株產酶的影響

向發酵培養基中添加不同濃度的蛋白胨，考察氮源濃度對菌株發酵產酶的影響。如圖2D所示，當蛋白胨濃度在5 g/L～30 g/L內時，隨蛋白胨濃度升高，脲酶活性逐漸增加，30 g/L時脲酶活性達到最大，繼續增大蛋白胨濃度，脲酶活性開始下降。因此發酵培養基中蛋白胨的最適濃度選擇30 g/L左右。

圖2 碳源、氮源對菌株發酵產酶的影響

2.4 酵母粉對菌株產酶的影響

酵母粉作為菌體生長的營養物質，既可算作碳源，也可作為氮源?？疾煸诔跏及l酵培養基中添加不同濃度酵母粉對菌株發酵產酶的影響，結果如圖3所示。當酵母粉添加濃度在20 g/L以下時，對產酶有促進作用，但隨著添加濃度提高，發酵液中酶活力減弱。當添加量超過20 g/L時，則反而會抑制產酶。因此，酵母粉的適宜添加濃度定為5.0 g/L。

2.5 發酵初始pH對菌株產酶的影響

發酵培養基的初始pH會直接影響菌體的生長代謝。由圖4可知，發酵培養基初始pH對發酵產酶的影響。當初始pH為6.0～9.0時，發酵后獲得的脲酶酶活較高，且當pH為7.0時脲酶酶活力最高。當pH小于6.0或大于9.0時發酵后酶活力較低，說明過酸或過堿都會影響菌體的生長和脲酶的產量。因此，本試驗認為pH 7.0為菌株OAH-01發酵產酶的最適宜pH。

圖3 酵母粉濃度對菌株發酵產酶的影響

圖4 發酵初始pH對菌株產酶的影響

2.6 常見金屬離子對菌株發酵產酶的影響

某些金屬離子是核酸、蛋白質、輔酶和細胞膜的構成元素，同時還有維持細胞滲透壓和調節酸堿度的作用。

2.6.1 Ni2+對菌株產酶的影響

脲酶是一種含鎳的寡聚酶[15]。培養基中的Ni2+對菌株產酶可能會產生促進作用。為考察Ni2+對菌株發酵產酶的影響，分別向發酵培養基中添加終濃度為0 mmol/L、0.008 mmol/L、0.04 mmol/L、0.2 mmol/L和1 mmol/L的Ni2+。不同濃度的Ni2+對菌株產酶的影響如圖5A所示。從圖中可看出，低濃度的Ni2+對菌體產酶有促進作用，但隨著Ni2+濃度升高，逐漸變為抑制。因此，在發酵培養基中添加少量Ni2+可有助于提高脲酶的產量。

2.6.2 Mn2+對菌株產酶的影響

為考察Mn2+對菌株產酶的影響，向發酵培養基中添加了不同濃度的Mn2+，濃度分別為0 mmol/L、0.008 mmol/L、0.04 mmol/L、0.2 mmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L和50 mmol/L，圖5B顯示，隨Mn2+添加量的提高，菌株產酶總體上表現為受抑制。因此以不添加Mn2+為宜。

圖5 金屬離子對菌株產酶的影響

2.6.3 Mg2+對菌株產酶的影響

圖5C顯示了不同Mg2+濃度對菌株產酶的影響。從圖中可看出，在0～50 mmol/L的范圍內，Mg2+濃度高低與脲酶活力無顯著相關性。因此可從發酵培養基配方中去除添加Mg2+。

2.6.4 Fe3+對菌株產酶的影響

向發酵培養基中添加濃度分別為0 mmol/L、0.04 mmol/L、0.2 mmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L和50 mmol/L的Fe3+，結果如圖5D所示。Fe3+濃度對菌株產酶影響較大，當濃度為1 mmol/L時對產酶促進效果最顯著。

2.6.5 初始培養基中Na2HPO4和KH2PO4對菌株OAH-01發酵產酶的影響

為考察Na2HPO4和KH2PO4對菌株產酶的影響，向培養基中分別添加0 g/L、0.1 g/L、0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L和2 g/L的Na2HPO4和KH2PO4。如圖6所示，隨Na2HPO4濃度提高，脲酶酶活先升高后保持穩定，當Na2HPO4濃度為0.5 g/L，脲酶酶活達到最大，再提高濃度，酶活基本保持不變。因此將Na2HPO4濃度定為0.5 g/L。隨KH2PO4濃度的升高，脲酶酶活則逐漸下降。但當濃度為0.1 g/L和0.5 g/L時，發酵后得到的脲酶酶活要高于初始發酵培養基。濃度越小脲酶酶活越高，故選擇KH2PO4的添加濃度為0.1 g/L。

圖6 Na2HPO4和KH2PO4對菌株產酶的影響

2.7 正交試驗優化結果

通過單因素試驗確定了培養基中各組分對菌株產酶的影響及各組分的最適濃度范圍。為進一步確定最佳培養基配方，根據試驗結果，選取對菌株產酶影響較大的四個因素：蛋白胨(A)、酵母粉(B)、葡萄糖(C)、FeCl3(D)，以發酵后菌懸液中脲酶活力為指標，設計四因素三水平正交試驗，結果如表2所示。

表2 正交試驗結果

極差R值分析可知，蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、FeCl3濃度對菌懸液中酶活力影響的主次效應為FeCl3>酵母粉>葡萄糖>蛋白胨。根據圖7可知，這四種組分濃度的最優組合是A1B2C2D3，即蛋白胨20 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，FeCl30.54 g/L，此時發酵后菌懸液中酶活水平最高。

圖7 酶活均值主效應圖

2.8 驗證試驗

采用最佳培養基進行發酵，菌懸液中的脲酶活力水平為1.077 U/mL，是使用初始發酵培養基所得酶活(0.45 U/mL)的2.4倍。將發酵后收獲的菌體進行超聲破碎，離心取上清測脲酶活力，結果顯示，采用最佳培養基配方，上清液中脲酶酶活可達0.419 U/mL，而使用初始培養基，上清中酶活力僅為0.095 U/mL，前者比后者提升了4.4倍。

3 結論

以產脲酶根癌農桿菌A.tumefaciensOAH-01為對象，研究了該菌株的生長曲線和產酶曲線。利用單因素試驗及正交優化確定了最佳發酵培養基組成(g/L)：蛋白胨20，酵母粉5，葡萄糖5，FeCl30.54，Na2HPO40.5，KH2PO40.5，NiSO40.1，起始pH 7.0。在優化后的培養條件下，菌懸液中脲酶活力水平提高2.4倍，而超聲破碎后，細胞上清液中脲酶活性水平提高了4.4倍。

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Optimization of fermentation culture by urease-producing strainAgrobacteriumtumefaciensOAH-01

HOU En-ling, LIU Liang-yu, LIN JIN Xue-jiao, MAO Xiang-zhao

Food science and engineering, Ocean university of China, Shandong, Qingdao, 276000

Urea as the main precursor of ethyl carbamate (EC) is a potential carcinogenic component in most of the fermented foods. The methods for elimination of urea must be taken to control the amount of urea. The preferred method for reducing EC content recommended by FDA is adding urease to the wine, because of its advantages such as efficiency, high safety and mild treatment conditions. Microbes are the main source of urease which can be carried out mass production. In this paper, an urease-producing strainAgrobacteriumtumefaciensOAH-01 was investigated. Its growth curve and urease-producing curve indicated that the production of enzyme was growth associated model and it could reach the maximum yield in a relatively short time. The effects of fermentation medium composition on urease production by OAH-01 were also investigated. The fermentation medium composition was optimized based on single factor experiment and orthogonal experiment. The optimal medium and conditions were as follows (g/L): peptone 20, yeast extract 5, glucose 5, FeCl30.54, Na2HPO40.5, KH2PO40.5, NiSO40.1, pH 7.0 and cultivation 16 h. Under the optimized conditions, the urease activity of cell suspension was 1.08 U/mL, it was 2.4 times than that before optimization. The activity of supernatant after ultrasonic decomposition was 0.419 U/mL, it was 4.4 times than that before optimization.

ethyl carbamate;Agrobacteriumtumefaciens; urease; fermentation optimization

山東省科技重大專項(編號：2015ZDZX05003)。

侯恩玲(1990～)，女，碩士研究生。E-mail：15763908360@163.com。

*通訊作者：毛相朝，男，教授。Tel：0532-82031360，E-mail：xzhmao@ouc.edu.cn。