保護(hù)劑對(duì)重組大腸桿菌NMN轉(zhuǎn)移酶穩(wěn)定性的影響

段琳琳， 李紅梅

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 楊浦 200093

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保護(hù)劑對(duì)重組大腸桿菌NMN轉(zhuǎn)移酶穩(wěn)定性的影響

段琳琳， 李紅梅*

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 楊浦 200093

通過向NMN轉(zhuǎn)移酶(Nmnat)中添加保護(hù)劑以提高其熱穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性，擴(kuò)大酶的使用范圍。研究了固體醇類(山梨醇、甘露醇)、糖類(海藻酸鈉、蔗糖、甘露糖)和有機(jī)溶劑(DMSO、丙二醇-單甲醚、乙醇、甘油)對(duì)Nmnat的穩(wěn)定性的作用，通過正交實(shí)驗(yàn)得到一種復(fù)合保護(hù)劑，并研究復(fù)合保護(hù)劑對(duì)Nmnat最適反應(yīng)溫度、pH穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，山梨醇、海藻酸鈉和DMSO能夠顯著提高Nmnat的熱穩(wěn)定性。復(fù)合保護(hù)劑配方為山梨醇1.5 g/L，海藻酸鈉1.0 g/L，DMSO 0.5%。復(fù)合保護(hù)劑的添加使Nmnat的最適反應(yīng)溫度從37 ℃提高到50 ℃；50 ℃保溫2 h酶活提高了24.5%；pH使用范圍由7.0～8.0擴(kuò)大到6.0～8.0；4 ℃儲(chǔ)存28 d后，酶活保留率提高了15.65%。

NMN轉(zhuǎn)移酶； 保護(hù)劑； 熱穩(wěn)定性； 正交實(shí)驗(yàn)

NMN轉(zhuǎn)移酶(Nmnat)是一類在蛋白折疊過程中與ATP相耦聯(lián)，利用NMN生成NAD和NAAD，維持體內(nèi)NAD的平衡的酶類，也是一種指示蛋白和應(yīng)激反應(yīng)蛋白，可作為生物藥劑的靶標(biāo)和調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄合成，在生物體生命活動(dòng)中起著十分重要的作用[1-3]。大量研究表明，Nmnat在自然界中來源極為廣泛，主要是植物、動(dòng)物以及微生物。如此豐富的資源，以及人類對(duì)Nmnat研究的不斷深入，使得Nmnat在醫(yī)藥、生物、工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[4]。

Nmnat作為一種同源性蛋白，在生產(chǎn)、加工和貯存過程，由于外界因素，如溫度、有機(jī)溶劑、pH和金屬離子等影響，易導(dǎo)致酶穩(wěn)定性降低，甚至失活[5]。Medicina和Ranieri等研究發(fā)現(xiàn)來源于人類胎盤組織的Nmnat在37 ℃保溫30 min后，酶活下降約70%[6]; 來源于大腸桿菌的Nmnat在60 ℃時(shí)半衰期也僅有2.5 min[7]。因此，提高Nmnat的熱穩(wěn)定性、減少失活率和延長(zhǎng)貯存期是當(dāng)前研究重點(diǎn)。目前提高酶穩(wěn)定性的方法主要有篩選耐熱菌株、固定化、化學(xué)修飾和添加保護(hù)劑等。其中添加保護(hù)劑法操作簡(jiǎn)單、成本較低，成為提高酶穩(wěn)定性的最有效最直接的手段，其研究也日益增多[8]。如劉彩琴等發(fā)現(xiàn)加入10%的甘油可以使α-半乳糖苷酶的酶活保留率由52.48%提高到78.44%[9]；Costa S A等通過研究不同添加物質(zhì)對(duì)過氧化氫酶穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)加入聚乙二醇可以使過氧化氫酶在60 ℃保存10 min后，酶活保留率高達(dá)64.5%，相比對(duì)照組23.5%提高了41%[10]。

本課題通過基因工程手段已成功構(gòu)建產(chǎn)Nmnat的重組大腸桿菌，并對(duì)Nmnat的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)該酶熱穩(wěn)定性差、耐酸堿能力低且儲(chǔ)存時(shí)間短[7]。鑒于添加保護(hù)劑對(duì)改善酶熱穩(wěn)定性具有積極作用，本研究通過添加不同保護(hù)劑，考察其對(duì)Nmnat穩(wěn)定性的影響，尋找提高酶穩(wěn)定性的新方法提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 山梨醇、甘露醇、乙醇、甘油、海藻酸鈉、蔗糖、甘露糖、DMSO、丙二醇-單甲醚和硼酸均為分析純。

1.1.2 Nmnat酶液 由本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵純化制得。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 離心機(jī)、冷凍冰箱、恒溫水浴鍋。

1.2 方法

1.2.1 酶活力的測(cè)定方法

反應(yīng)體系:1 mol/L pH 7.5 Tris-HCl緩沖液，300 mmol/L NMN，50 mmol/L ATP，50 mmol/L Mn2+，乙醇2%，0.955 g/mL酶液，7U的ADH(乙醇脫氫酶)混勻。所有液體都用ddH2O配制。然后置于37 ℃的恒溫水浴鍋中振蕩反應(yīng)2 h，加入0.155 mol/L的EDTA反應(yīng)5 min，終止酶反應(yīng)，反應(yīng)液冰浴冷卻8 000 r/min離心1 min，取上清液并在340 nm處測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值OD340，代表Nmnat酶活力大小。酶活定義為：在37 ℃，1 mL反應(yīng)體系中，每分鐘催化得到1 μmol NMN的酶量為1 U，比酶活用U/mg或U/g表示。

1.2.2 不同濃度的保護(hù)劑配制

山梨醇、甘露醇、乙醇和甘油濃度分別為0.0%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%；海藻酸鈉、蔗糖和甘露糖濃度分別為0.0 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L和2.0 g/L；DMSO、丙二醇-單甲醚和硼酸濃度分別為0.0%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%。

1.2.3 不同濃度的保護(hù)劑對(duì)酶活的影響

將不同類型的保護(hù)劑和酶液按照一定的比例混合，于37℃下按照酶活的測(cè)定方法測(cè)定酶活力大小，以不加任何添加物的酶活為相對(duì)酶活，其計(jì)算公式如下：Ar=(Ap-A0)/A0

其中：Ar為相對(duì)酶活%，AP為加入保護(hù)劑的酶活，A0為未加入保護(hù)劑的酶活。

1.2.4 復(fù)合保護(hù)劑的配比

選出3種效果較好的單一保護(hù)劑，進(jìn)行正交復(fù)配實(shí)驗(yàn)，以1.0 g/L(1.0%)為中間水平，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交配比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果為其平均值。

1.2.5 復(fù)合保護(hù)劑對(duì)Nmnat最適反應(yīng)溫度的影響

將不同類型的保護(hù)劑和酶液按照一定的比例混合，在不同溫度(20 ℃、30 ℃、37 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃)下，測(cè)定酶活力，以未處理的酶液的酶活為100%。

1.2.6 不同溫度下復(fù)合保護(hù)劑對(duì)Nmnat熱穩(wěn)定性的影響

將正交實(shí)驗(yàn)測(cè)得的最佳保護(hù)劑(復(fù)合保護(hù)劑)按照一定的比例加入到酶液中(處理組)和未加入保護(hù)劑的酶液(對(duì)照組)分別置于不同的溫度下(20 ℃、30 ℃、37 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃)水浴保溫1 h和2 h，立即冰浴冷卻，測(cè)定其酶活力，以未經(jīng)任何處理的酶液的酶活為對(duì)照，計(jì)算其酶活的保留率(%)。

1.2.7 復(fù)合保護(hù)劑對(duì)Nmnat pH穩(wěn)定性的影響

配制1 mol/L醋酸-醋酸鈉pH 4.0～6.0的緩沖液，1 mol/L的磷酸鹽pH 6.0～7.0的緩沖液，1 mol/L Tris-HCl pH 7.5～9.0的緩沖液，將酶液放置在不同的pH中4 ℃放置24 h，測(cè)定Nmnat和加入復(fù)合保護(hù)劑的Nmnat的酶活，檢測(cè)pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響。

圖7為在相同的運(yùn)動(dòng)加速度情況下,應(yīng)用本文提出的基于加速度分離算法的改進(jìn)卡爾曼濾波進(jìn)行姿態(tài)解算的姿態(tài)誤差曲線。

1.2.8 低溫條件下保護(hù)劑對(duì)Nmnat儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響

研究4 ℃條件下，加入復(fù)合保護(hù)劑的酶液(處理組)和未加入保護(hù)劑的酶液(對(duì)照組)，在不同的保存時(shí)間(0 d、7 d、14 d、21 d和28 d)內(nèi)，測(cè)定酶活的保留率，以0 d時(shí)的最初酶活力為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一保護(hù)劑對(duì)Nmnat穩(wěn)定性的影響

2.1.1 固體醇類保護(hù)劑對(duì)Nmnat穩(wěn)定性的影響

醇類屬于羥基化合物，其羥基可以和酶的酰胺基形成氫鍵，有研究表明酰胺鍵的形成能加強(qiáng)酶分子熱穩(wěn)定性，提高酶的活力；此外多元醇類還可以與水分子相互作用，改變水的表面張力，減少介質(zhì)的介電常數(shù)，加強(qiáng)酶分子的疏水作用，使酶液體系更加均一，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[11]。因此，本研究采用山梨醇、甘露醇作為保護(hù)劑，考察其對(duì)Nmnat穩(wěn)定性的影響。

結(jié)果如圖1所示，固體醇對(duì)Nmnat的穩(wěn)定作用隨著濃度的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中，山梨醇對(duì)Nmnat穩(wěn)定作用效果較好，當(dāng)濃度為1.0%時(shí)，相對(duì)酶活力達(dá)到了73.68%，相比對(duì)照組提高了65.78%。歸結(jié)其原因可能是山梨醇的多羥基和酶分子發(fā)生作用，減少了酶分子的水合作用，從而加強(qiáng)酶分子的穩(wěn)定性。Back等研究也發(fā)現(xiàn)多羥基物質(zhì)中山梨醇對(duì)多種蛋白質(zhì)都有著比較好的保護(hù)作用[12]。甘露醇的保護(hù)效果較弱，最適濃度下相對(duì)酶活為53.46%，且當(dāng)甘露醇濃度大于2.0%時(shí)，相對(duì)酶活反而低于對(duì)照組，可是其溶解吸熱和吸濕性造成酶結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。

圖1 固體醇類保護(hù)劑對(duì)Nmnat 穩(wěn)定性的影響

2.1.2 糖類保護(hù)劑對(duì)Nmnat穩(wěn)定性的影響

眾多研究表明糖類的多羥基會(huì)與酶的水溶液相互作用，使酶與水之間溶劑化，且其氫鍵能夠改變酶分子折疊的驅(qū)動(dòng)力，降低酶分子的自由能，增強(qiáng)酶分子的穩(wěn)定性[13]，因此糖類被認(rèn)為是保護(hù)酶熱穩(wěn)定性的一種有效保護(hù)劑。

本實(shí)驗(yàn)選擇海藻酸鈉，蔗糖以及甘露糖三種糖類進(jìn)行研究，其結(jié)果如圖2所示。三種糖對(duì)Nmant穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其原因可能歸功于低濃度的糖更容易與水分子相互作用，穩(wěn)定酶分子結(jié)構(gòu)，而高濃度的糖將增加溶液滲透壓，改變酶分子構(gòu)象從而導(dǎo)致酶活降低。從圖2中可以看出，海藻酸鈉的保護(hù)作用最強(qiáng)，當(dāng)濃度為1.0 g/L時(shí)，相對(duì)酶活較對(duì)照組提高了65.45%；蔗糖和甘露糖在最適宜的濃度1.5 g/L時(shí)，相對(duì)酶活分別較對(duì)照組提高50.12%和41.38%。對(duì)此可能的解釋是在二糖中海藻糖含有的羥基數(shù)目最多，與水分子形成氫鍵可以降低蛋白質(zhì)的自由能，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

圖2 糖類保護(hù)劑對(duì)Nmnat穩(wěn)定性的影響

2.1.3 有機(jī)溶劑對(duì)Nmnat穩(wěn)定性的影響

Griebenow提出適當(dāng)濃度的有機(jī)溶劑可以減少蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低水分子的活度，增加溶液的粘稠性，從而降低水合作用對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)的影響，起到保護(hù)酶穩(wěn)定性的作用，但濃度增大時(shí)，維持酶的活性構(gòu)象變化所需的柔性減小，反而導(dǎo)致酶分子抵抗失活的能力減弱[14]。

本實(shí)驗(yàn)考察了DMSO、丙二醇-單甲醚、乙醇和甘油對(duì)Nmnat酶活的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著濃度的增大，三種有機(jī)溶劑對(duì)Nmnat的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與Griebenow研究結(jié)果相符合。其中，DMSO對(duì)酶活的穩(wěn)定作用較大，當(dāng)濃度為1.0%時(shí)，相對(duì)酶活提高了70.02%，而丙二醇-單甲醚、乙醇和甘油相對(duì)酶活較對(duì)照組僅提高了39.31%、45.34%和43.18%。四種有機(jī)溶劑，DMSO的極性最高，將影響酶分子側(cè)鏈間的相互作用，使維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的作用力發(fā)生變化，從而使酶活性部位柔性增加，利于酶功能發(fā)揮，因此對(duì)酶的激活作用也更強(qiáng)烈[15]。

圖3 有機(jī)溶劑對(duì)Nmnat穩(wěn)定性的影響

2.2 復(fù)合保護(hù)劑配方的優(yōu)化

由表1結(jié)果可得，保護(hù)劑的最佳配比為山梨醇1.5 g/L，海藻酸鈉1.0 g/L，DMSO 0.5%。在此條件下，復(fù)合保護(hù)劑優(yōu)于單一保護(hù)劑，Nmnat相對(duì)酶活達(dá)到114.23%，由對(duì)照組的12.4%提高了101.83%，顯著提高了酶的穩(wěn)定性。

表1 復(fù)合保護(hù)劑正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 復(fù)合保護(hù)劑對(duì)Nmnat最適反應(yīng)溫度的影響

反應(yīng)溫度是影響酶活性的重要因素，保護(hù)劑的加入可能會(huì)改變酶液的最適反應(yīng)溫度，也可以擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義[16]。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了反應(yīng)溫度-殘余相對(duì)酶活曲線的測(cè)定，如圖4所示。反應(yīng)溫度相同時(shí)，添加復(fù)合保護(hù)劑的Nmnat的殘余相對(duì)酶活均高于對(duì)照組；未加保護(hù)劑時(shí)，Nmnat最適反應(yīng)溫度為37 ℃，添加復(fù)合保護(hù)劑后，Nmnat最適反應(yīng)溫度由37 ℃提高到50 ℃，提高了13 ℃。顯然，保護(hù)劑的加入的確能顯著提高酶的熱穩(wěn)定性，提高其最適反應(yīng)溫度。

圖4 復(fù)合保護(hù)劑對(duì)Nmnat最適反應(yīng)溫度的影響

2.4 不同溫度下復(fù)合保護(hù)劑對(duì)Nmnat熱穩(wěn)定性的影響

復(fù)合保護(hù)劑對(duì)Nmnat熱穩(wěn)定性的影響結(jié)果如表2所示。從表2可看出，50 ℃保溫1 h時(shí)，對(duì)照組酶活保留率為13.6%，而處理組仍然保留有46.8%；50 ℃保溫2 h后，對(duì)照組酶活保留率僅為9.8%，而處理組仍保留34.3%；60 ℃保溫2 h后，對(duì)照組已經(jīng)檢測(cè)不到酶活力，而含有保護(hù)劑的酶制劑樣品仍保留20.9%，說明復(fù)合保護(hù)劑的添加起到了很好的保護(hù)作用，使Nmnat的耐熱溫度提高了10 ℃左右，此結(jié)果與徐瑩等研究復(fù)合保護(hù)劑的添加使彈性蛋白酶的耐熱溫度由50 ℃提高到60 ℃[8]以及陳天祥等研究發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合保護(hù)劑后，菊粉酶的耐熱溫度提高了10 ℃[17]結(jié)果相吻合。

表2 復(fù)合保護(hù)劑對(duì)Nmnat熱穩(wěn)定性的影響

2.5 復(fù)合保護(hù)劑對(duì)Nmnat pH穩(wěn)定性的影響

有研究表明保護(hù)劑的加入可以影響酶溶液的pH穩(wěn)定性和酶活力大小，如復(fù)合保護(hù)劑的加入使α-半乳糖苷酶的pH穩(wěn)定范圍由4～6擴(kuò)大為3～6[9]。

由圖5可知，無論是否含有復(fù)合保護(hù)劑，Nmnat在pH 7.0～8.0之間都有良好的穩(wěn)定性，而且加入保護(hù)劑的Nmnat活性明顯高于對(duì)照組，尤其是在pH 6.0～7.5時(shí)，提高幅度為45.1%～47.8%，說明保護(hù)劑的加入使Nmnat的pH穩(wěn)定范圍擴(kuò)大為6.0～8.0，將利于擴(kuò)大Nmnat的應(yīng)用范圍。

圖5 復(fù)合保護(hù)劑對(duì)酶pH穩(wěn)定性的影響

2.6 低溫條件下保護(hù)劑對(duì)Nmnat儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響

酶在低溫條件下會(huì)由于凍結(jié)速率、低溫效應(yīng)以及微生物污染等因素，導(dǎo)致其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而變性失活[18]。有研究表明保護(hù)劑可以提高酶在低溫條件下的穩(wěn)定性，比如含有0.2%黃原膠、30 mmolNaCl和3%甘油的復(fù)合保護(hù)劑對(duì)糖化酶儲(chǔ)存6個(gè)月的酶活相比對(duì)照組(60.2%)提高了24.6%[19]。

本研究將Nmnat在4 ℃下保存7 d、14 d、21 d和28 d，定期測(cè)定殘余酶活，結(jié)果如圖6所示。對(duì)照組和處理組酶活均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。其中，處理組酶活明顯高于對(duì)照組。Nmnat在4 ℃儲(chǔ)存效果較好，4 ℃儲(chǔ)存28 d后，酶活保留率為18.47%,處理組酶活保留率高達(dá)34.12%，相比對(duì)照組提高了15.65%，說明低溫下保護(hù)劑起到了一定的保護(hù)作用。據(jù)此推測(cè)降低溫度保存時(shí), 含有保護(hù)劑的酶制劑的保存期限會(huì)更長(zhǎng)。

圖6 4 ℃下復(fù)合保護(hù)劑對(duì)Nmnat儲(chǔ)存

3 結(jié)論

溫度的升高、保存時(shí)間的延長(zhǎng)都會(huì)使酶的活性降低。酶在純的溶液中比在不純的溶液中更容易變性，因此，一般在酶液中加入一定的保護(hù)劑可以適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)酶的活性。本研究得出以下結(jié)論：

(1)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示山梨醇、海藻酸鈉以及DMSO可以顯著提高Nmnat的活性。復(fù)合配方正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)山梨醇、海藻酸鈉以及DMSO復(fù)合添加量分別為 1.5 g/L，1.0 g/L和0.5%時(shí)，酶活提高幅度最大，相對(duì)酶活達(dá)到 114.23%，與對(duì)照組相比提高101.83%，且均優(yōu)于單一保護(hù)劑的保護(hù)作用。

(2)復(fù)合保護(hù)劑的加入使酶的最適反應(yīng)溫度由37 ℃提高到50 ℃，pH的使用范圍從7.0～8.0擴(kuò)大到 6.0～8.0；60 ℃保溫2 h后，對(duì)照組已經(jīng)檢測(cè)不到酶活力，而含有保護(hù)劑的酶制劑樣品仍保留20.9%，說明復(fù)合保護(hù)劑對(duì)酶起到了較好的保護(hù)作用；低溫保存實(shí)驗(yàn)證明，4 ℃儲(chǔ)存28 d后，添加復(fù)合保護(hù)劑的酶活保留率高達(dá)34.12%，相比對(duì)照組提高了15.65%。

總之，本研究通過添加保護(hù)劑顯著提高了Nmnat的穩(wěn)定性，后續(xù)研究可通過酶的固定化、酶修飾等技術(shù)來進(jìn)一步提高Nmnat的熱穩(wěn)定性。

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Effects of protective agents on stability of NMN

adenylyltransferase fromEscherichiacoli

DUAN Lin-lin, LI Hong-mei

University of Shanghai for Science and Technology, School of Medical Instrument and

Food Engineering,Yangpu 200093，Shanghai，China

In order to enhance the stability and storage stability of NMN adenylyltransferase (Nmnat)，protective additives were added into the preparation of Nmnat, thereby expanding the scope of the use of enzymes. Some kinds of protective agents: solid alcohols (sorbitol, mannitol), sugar (sodium alginate, sucrose, mannose) and organic solvent (DMSO, propylene glycol-single ether, ethanol, glycerol) were investigated. The optimal combination additive (1.5 g/L sorbitol, 1.0 g/L alginate, 0.5% DMSO) was obtained using the orthogonal experimental design. And the thermal stability, optimum reaction temperature, optimum reaction pH, the storage stability of Nmnat with combination additive were discussed. These additives might increase the optimal reaction temperature from 37 ℃ to about 50 ℃ due to their good protection effects, the activity increased by 24.5% after preservation for 2 hours at 50 ℃, the range of pH stability from 7.0～8.0 expanded to 6.0～8.0, the residual activity of Nmnat containing combination additive increased 15.65% after storing at 4 ℃ for 28 days.

Nmnat; protective agents; thermal stability; orthogonal experiment

段琳琳(1990～)，女，碩士研究生。研究方向：微生物資源利用。E-mail:duanlinlin0303@163.com。

*通訊作者: 李紅梅，博士，碩士生導(dǎo)師。Tel：021-55271117，E-mail: sunnysand@126.com。