苦參堿誘導宮頸癌SiHa細胞凋亡的相關機制研究*

周美英 魏林珍 王海琳# 張愛笠 甄潔玉

（1甘肅省人民醫院婦產科 蘭州 730000；2甘肅中醫藥大學 蘭州 730000）

論著

苦參堿誘導宮頸癌SiHa細胞凋亡的相關機制研究*

周美英1魏林珍1王海琳1#張愛笠2甄潔玉1

（1甘肅省人民醫院婦產科 蘭州 730000；2甘肅中醫藥大學 蘭州 730000）

目的：觀察苦參堿體外誘導宮頸癌SiHa細胞凋亡效應并對其可能的作用機制進行初步探討。方法：將不同濃度（0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/ml）的苦參堿分別作用于體外培養的宮頸癌細胞，在不同時間點（24、48、72 h），采用MTT法檢測細胞的增殖情況；采用Annexin-Ⅴ和PI雙染法在流式細胞儀上檢測細胞的凋亡率；采用Western blot檢測細胞中凋亡相關蛋白Caspase-3的表達。結果：各組苦參堿對SiHa細胞的增殖均有抑制作用，MTT和流式細胞結果顯示，不同濃度的苦參堿對細胞生長抑制率與對照組相比存在明顯差異（P＜0.05），呈劑量效應正相關及時間效應正相關。加入Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK后，各組細胞凋亡率與只加苦參堿組相比凋亡率下降。Western blot檢測結果顯示Caspase-3蛋白水平隨苦參堿濃度的提高而增加（P＜0.05）。結論：苦參堿可誘導宮頸癌SiHa細胞的增殖，促進其凋亡，其作用機制可能與提高Caspase-3活性有關。

苦參堿；宮頸癌；細胞增殖；細胞凋亡；Z-DEVD-FMK；Caspase-3

對鼻咽癌、胃癌、視網膜母細胞瘤、上皮性卵巢癌和大腸癌等都有不同程度的誘導凋亡的作用［3］。苦參堿抗腫瘤機制較為復雜，具體的凋亡作用機制因細胞種類不同而異。目前，苦參堿對宮頸癌SiHa細胞的影響及分子機制尚未見報道。本研究擬觀察苦參堿是否具有誘導宮頸癌SiHa細胞凋亡的效應，同時通過觀察Caspase-3的變化情況，初步探討苦參堿對SiHa細胞的作用機制，為苦參堿治療宮頸癌的臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料宮頸癌細胞株購自于蘭州大學第一臨床醫學院科研中心；苦參堿購自寶雞市方晟生物開

發有限公司（純度98%）；DMEM為Gibco公司產品；胎牛血清購自Hyclone公司；四單甲基偶氮唑藍（MTT）、DMSO購自Sigma公司；細胞凋亡檢測試劑盒（包括Annexin-Ⅴ-FITC，PI等）購自美國BioLegend公司；兔抗人Caspase-3抗體購自Sant Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體為中山金橋公司產品；Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與藥物配置將凍存的宮頸癌SiHa細胞37℃快速溶解，常規復蘇和傳代。細胞接種在含10%胎牛血清的DMEM培養基培養液中（含100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素），在37℃、5%二氧化碳培養箱中培養。細胞貼壁80%時傳代，1周大約2次。苦參堿采用無血清DMEM配制成濃度為32 mg/ml儲存液，0.22 μm一次性濾器過濾后，-20℃避光保存備用，使用時分別配為終濃度為0.25～2.00 mg/ml溶液。經前期預試驗證實，25 μmol/L的Z-DEVD-FMK不影響腫瘤細胞增殖，但可顯著減弱苦參堿誘導宮頸癌細胞的凋亡。

1.2.2 細胞增殖的測定（MTT法）分別取對數生長期SiHa細胞，以5 000個細胞接種到96孔板內，生長24 h后，加入不同濃度的苦參堿，分別為0.25、0.50、1.00、2.00 mg/ml，每個濃度設5個復孔，同時設置空白對照組、溶劑對照組和調零孔。分別培養24、48、72 h后，每孔加入新鮮配置的MTT溶液20 μl（濃度為5 g/L），37℃孵育4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μl，水平振蕩器振蕩10 min（60次/min）后，用Multiskan MS ELISA reader（Labsysterms，Helsinki，Finland）在490 nm處檢測吸光度值（OD值）。細胞抑制率（%）=（1－實驗組A值/對照組A值）×100%，實驗重復3次，取平均值。

1.2.3 流式細胞儀分析細胞凋亡率將1×105密度的對數生長期宮頸癌SiHa細胞，接種進25 cm2培養瓶中，培養24 h后，棄去舊培養液，實驗組分別加入含不同藥物濃度的苦參堿（0.5、1.0、2.0 mg/ml）干預，對照組加等量培養基。苦參堿作用24、48、72 h后，收集對照組和實驗組細胞（數目1～5×106個/ml），預冷PBS洗滌2次，將細胞重懸于200 μl Binding Buffer中，加入10 μl AnnexinV一FITC和5 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育5 min，流式細胞儀檢測凋亡率。另外，用25 μmol/L Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK處理各組細胞1 h后，然后加入不同濃度苦參堿（0.5、1.0、2.0 mg/ml），24 h后觀察各組凋亡率。流式細胞儀檢測凋亡率，實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 Western blotting分析Caspase-3蛋白的表達

SiHa細胞經0.0、0.5、1.0、2.0 mg/ml濃度苦參堿處理24 h后，收集細胞提取蛋白，BCA法定量，12% SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白上樣量為40 μg，濕法轉印至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉溶于TBST液中封閉1 h，一抗（1∶500）4℃過夜，TBST洗5 min，3次，二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST洗5 min，3次，ECL系統顯影，以β-actin為內參照。以上實驗重復3次。

1.3 統計學方法應用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析及兩個獨立樣本的t檢驗，實驗結果以（±s）表示。

2 結果

2.1 苦參堿對人宮頸癌細胞增殖的影響不同濃度的苦參堿作用宮頸癌SiHa細胞不同時間后，MTT法檢測抑制細胞增殖的作用結果見表1。隨著苦參堿濃度的增加和作用時間的延長，SiHa細胞的數量逐漸減少，呈劑量和時間效應關系。實驗結果表明，在0.25～2.00 mg/ml濃度范圍的苦參堿對宮頸癌SiHa細胞具有抑制作用，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 不同濃度苦參堿作用后各時點SiHa細胞生長抑制率比較（±s）

表1 不同濃度苦參堿作用后各時點SiHa細胞生長抑制率比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

24 h48 h72 h 0.10±0.09 4.67±0.87*16.71±1.63*35.10±2.82*50.06±1.05*0.21±0.13 15.27±2.79*27.99±2.94*54.40±4.16*73.93±0.56*0.30±0.19 19.40±3.18*37.27±2.58*69.30±2.17*83.47±0.40*組別濃度（mg/ml）0.00 0.25 0.50 1.00 2.00對照組苦參堿組

2.2 苦參堿對宮頸癌SiHa細胞凋亡率的影響經流式細胞儀檢測結果顯示，苦參堿誘導SiHa細胞凋亡的作用隨著作用時間的延長和給藥劑量的增加，細胞凋亡率增高，且具有統計學意義（P＜0.05）。其中，2.0 mg/ml的苦參堿作用72 h時SiHa細胞凋亡率最高為70.08%。見圖1。0.5、1.0、2.0 mg/ml的苦參堿作用于SiHa細胞48 h后，SiHa細胞凋亡率分別為（7.42±0.43）%、（22.94±0.83）%、（39.34±0.74）%，空白對照組為（0.57±0.21）%。見圖2。與空白對照組比較，隨著苦參堿濃度的增強細胞晚期凋亡率增高。

圖1 AnnexinV2FITC/PI雙標法檢測苦參堿對宮頸癌細胞凋亡的影響

圖2 苦參堿作用SiHa細胞48 h流式細胞術檢測結果

2.3 苦參堿對SiHa細胞Caspase-3蛋白表達的影響對不同濃度的苦參堿處理后的SiHa細胞進行Caspase-3蛋白水平的檢測中發現，隨著苦參堿濃度的增加，細胞中Caspase-3蛋白水平也逐漸增加。見圖3。對Western blot結果進行灰度掃描分析后，經β-actin內參的校正，結果發現，0.5、1.0、2.0 mg/ml的苦參堿處理后，細胞內的Caspase-3蛋白水平與對照組細胞比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖3 不同濃度的苦參堿處理后的SiHa細胞進行Caspase-3蛋白水平的檢測

圖4 不同濃度的苦參堿處理后的SiHa細胞進行Caspase-3蛋白水平的檢測（β-actin內參的校正）

3 討論

宮頸癌是位居第二位危害婦女健康的惡性腫瘤，化療是當前主要治療手段之一。然而由于化療藥物的毒副作用及耐藥性的產生，尋求新的高效、低毒的抗腫瘤藥物成為科研工作者面臨的新挑戰。研究證實苦參堿對體內多種腫瘤具有明顯抑制作用且未發現明顯的不良反應，逐漸成為研究的焦點。

本研究發現不同濃度苦參堿（0.25、0.50、1.00、2.00 mg/ml）作用于宮頸癌SiHa細胞24、48、72 h后，抑制率與對照組比較差異均具有統計學意義，提示苦參堿抗腫瘤機制之一是抑制腫瘤細胞的增殖，且隨著藥物劑量的增加，作用時間的延長，抑制率增高。進一步應用流式細胞儀檢測細胞凋亡，結果顯示分別用苦參堿0.5、1.0、2.0 mg/ml作用于SiHa細胞24、48、72 h后，抑制率具有時間劑量依賴性。0.5、1.0、2.0 mg/ml的苦參堿作用于SiHa細胞48 h后，與對照組相比細胞晚期凋亡率明顯增加，可見苦參堿誘導Siha細胞晚期凋亡率亦隨著給藥劑量的增加而增高，說明苦參堿能夠同時誘導腫瘤細胞晚期凋亡，發揮其抗腫瘤作用。

目前，大多數學者認為凋亡相關基因的激活與腫瘤的增殖受抑相關，其中以Caspase家族最為關注［4～5］。Caspase為半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶的簡稱，是一組具有相似氨基酸序列的半胱氨酸蛋白酶，迄今已發現16個成員［6～7］。所有的Caspase均以無活性的酶原形式存在，一經激活將產生Caspase級聯反應，最終導致細胞凋亡［8］。Caspase蛋白酶在組織分布及降解已知底物的功能上彼此有重疊現象，但在不同細胞或同一細胞受不同刺激誘發凋亡過程中，激活的Caspase不盡相同。但普遍認為該家族成員Caspase-3是哺乳動物細胞凋亡中的關鍵蛋白酶［9］。激活的Caspase-3能使許多與細胞結構、細胞周期及DNA修復等有關的蛋白或激酶失活，從而使細胞凋亡。本研究結果顯示，0.5、1.0、2.0 mg/ml苦參堿分別作用SiHa細胞24 h，結果顯示與對照組相比，隨著藥物濃度的增加，宮頸癌細胞Caspase-3蛋白表達量也增加（P＜0.05），提示在苦參堿作用組中Caspase-3高表達，可使腫瘤細胞對凋亡更敏感，更易發生凋亡，這可能是苦參堿誘導細胞凋亡、發揮抗腫瘤作用的重要機制之一。流式細胞術結果顯示苦參堿作用24 h后，不同濃度實驗組細胞凋亡率均高于對照組（P＜0.05），而用Caspase-3特異性抑制劑Z-DEVD-FMK預處理，均可使細胞凋亡率下降。進一步證實，苦參堿可通過激活Caspase-3的表達誘導SiHa細胞凋亡，發揮其抗腫瘤作用。

綜上所述，苦參堿能抑制SiHa細胞的增殖而誘導凋亡，呈劑量時間依賴性。應用Caspase-3特異性抑制劑Z-DEVD-FMK預處理后，細胞凋亡率有所下降，但還存在凋亡。表明苦參堿能明顯誘導體外培養宮頸癌細胞的凋亡，該作用可能通過激活Caspase-3的表達，除Caspase-3外，可能尚有其它凋亡通路被激活，值得進一步探討。參考文獻

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Effects of Matrine on Apoptosis of Human Cervical Cancer Cell SiHa and Its Mechanism

ZHOU Mei-ying1，WEI Lin-zhen1，WANG Hai-lin1#，ZHANG Ai-li2，ZHEN Jie-yu1
（1Department of Obstetrics and Gynecology，Gansu Provincial Hospital，Lanzhou730000；2Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou730000）

Objective：To observe the role of matrine（Mat）induced apoptosis of human cervical cancer SiHa cells and its mechanism.Methods：SiHa cells were exposed to the concentrations of matrine 0.00，0.25，0.50，1.00 and 2.00 mg/ml for 24，48，72 h.Cell proliferation was detected by MTT assay.Apoptosis was determined by double stained assay with Annexin-Ⅴand PI.Caspase-3 protein level was determined with western blot assay.Results：After SiHa cells were cocultured with matrine in vitro，the cell proliferation was inhibited in time and dose dependent manner.When the SiHa cells were cultured for 24，48，72 h by matrine 0.50，1.00，2.00 mg/ml，the total apoptosis rate was increased，which had ststistical significance compared with control group（P＜0.05）.The addition of the caspase-3 inhibitor Z-DEVD-FMK，the apoptotic rate and increase of matrine group decreased apoptosis rate.And the caspase-3 protein level increased with the increase of the concentration of matrine（P＜0.05）.Conclusion：Matrine can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SiHa cells in vitro，one of its possible mechanisms is that matrine increasing caspase-3 activity.

Matrine；Cervical cancer；Proliferation；Apoptosis；Z-DEVD-FMK，Caspase-3

R285.5

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2016.08.001苦參堿（Matrine）是從中藥苦參的干燥根中提取出的具有藥理作用的一種中草藥，其具有抗心率失常、抗動脈粥樣硬化、解熱鎮痛、升高白細胞、抗炎殺菌、治療乙型肝炎等作用［1～2］。隨著研究深入，發現苦參堿還具有抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡作用，

2016-06-23）

國家自然科學基金（編號：H1621）；甘肅省自然基金（編號：1208RJZA109）

#通訊作者：王海琳，E-mail：wanghailinyx@163.com