響應面試驗優化失活酵母吸附獼猴桃汁中氯吡脲條件

楊麗霞，岳田利，袁亞宏，龍芳羽，王周利（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

響應面試驗優化失活酵母吸附獼猴桃汁中氯吡脲條件

楊麗霞，岳田利*，袁亞宏，龍芳羽，王周利
（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

以失活酵母菌為吸附劑，對獼猴桃汁中植物生長調節劑（氯吡脲）進行吸附。在單因素試驗基礎上，利用Box-Behnken響應面法對影響獼猴桃汁中氯吡脲吸附的失活酵母菌添加量、氯吡脲初始質量濃度、吸附時間關鍵因素進行優化，分析吸附對獼猴桃汁品質的影響。結果表明，失活酵母菌吸附氯吡脲的最佳條件為：失活酵母菌添加量28 mg/mL、氯吡脲初始質量濃度0.2 μg/mL、吸附時間3 h。在此條件下，氯吡脲吸附率為97.02%，與預測結果相符。失活酵母菌吸附氯吡脲對獼猴桃汁品質沒有顯著影響（P＞0.05）。

吸附；失活酵母；氯吡脲；響應面；獼猴桃汁

植物生長調節劑是用于調節植物生長發育的一類農藥，包括人工合成的化合物和從生物中提取的天然植物激素[1-2]。氯吡脲作為一種苯基脲類新型高效植物生長調節劑，有促進細胞分裂、擴大細胞體積等生理作用[3]。同時是膨大劑的主要成分，廣泛應用于獼猴桃、西瓜、黃瓜等多種果蔬生產中[4-6]。目前，由于經濟利益的驅使，部分生產者為了追求豐產，增加使用量，導致其殘留增加，長期接觸，可能會引起體內蛋白質代謝的紊亂，給人體帶來潛在的健康危害。美國規定氯吡脲在獼猴桃果實中的最大殘留限值為0.04 mg/kg[7]，澳大利亞為0.01 mg/kg[8]，我國為0.05 mg/kg。因此，對果蔬及其制品中氯吡脲進行檢測和控制研究對于保障消費者飲食安全具有非常重要的作用。

對農藥的去除主要包括物理吸附[9]、化學吸附[10]和生物降解[11]。傳統的物理、化學方法成本高、難度大，可能會帶來二次污染，甚至把無毒或低毒物質變成有毒或毒性更大的物質，從而在很大程度上限制了化學方法在降解農藥殘留上的廣泛應用。生物降解具有高效、徹底、無二次污染的優勢，但其應用范圍受到一定的局限性，主要應用于水污染和環境治理。近年來，生物吸附作為一種新型、有效處理難降解有機物的技術手段日益受到關注，在很多領域得到了廣泛的應用[12-18]。利用失活微生物進行有毒物質吸附成為研究的熱點[19-24]。越來越多的研究者認為失活微生物吸附劑不僅具有很好的吸附效果，而且潛在的生物危害小，使用更安全。因此，具有廣泛的應用前景。盡管如此，現階段還少有關于植物生長調節劑去除的研究；另外，失活酵母菌在農藥殘留分析方面的研究鮮有報道。失活酵母菌吸附氯吡脲之后，通過離心分離除去獼猴桃汁中的失活酵母菌粉。為此，本研究利用失活酵母菌吸附獼猴桃汁中氯吡脲，通過單因素和響應面試驗優化氯吡脲的吸附條件，達到有效安全地去除獼猴桃汁中氯吡脲的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃汁為自榨清汁，獼猴桃購自陜西楊陵夏家溝獼猴桃基地果園。

氯吡脲標品（純度大于99%） 阿拉丁公司；HYJ-3號酵母菌 西北農林科技大學發酵動力學實驗室。

酵母膏蛋白胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養基組成：2%蛋白胨、1%酵母浸粉、2%葡萄糖。

1.2 儀器與設備

恒溫培養箱、全自動滅菌鍋、QYC-2102C全溫搖床、DGX-9143BC型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海福瑪試驗設備有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；MCFD冷凍干燥機、LC-2010AHT高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的培養

活化：將保存的菌種于YPD平板上進行劃線，28 ℃培養24 h。

一級培養：將經過活化的酵母菌挑取兩環接種到250 mL裝有100 mL YPD培養基的三角瓶中進行培養，培養條件為：28 ℃、24 h、120 r/min。

二級培養：將一級培養得到的種子液以10%的接種量接種到250 mL裝有150 mL YPD培養基的三角瓶中進行培養。培養條件：28 ℃、24 h、120 r/min。

1.3.2 失活酵母菌的制備

將1.3.1節中培養得到的酵母菌，4 ℃、3 600×g、 10 min離心獲得菌泥，在121 ℃高壓滅菌20 min，保證被處理的酵母細胞完全失活。用蒸餾水洗滌3 次，然后將失活的酵母菌進行冷凍干燥，在冷凍干燥之前，樣品需在－40 ℃條件下預凍24 h，之后進行干燥，干燥條件為溫度－54 ℃、真空度0.665 Pa、時間36 h。冷凍干燥完成之后，用研缽研碎，過100目篩，即得到實驗所需的失活酵母菌。

1.3.3 氯吡脲的提取及純化[25-27]

量取2.5 mL獼猴桃汁于10 mL離心管中，加入2.5 mL含1%乙酸的乙腈，渦旋振蕩2 min，再加入1 g無水硫酸鎂、0.25 g 無水乙酸鈉，迅速振蕩2 min，防止結塊。在4 ℃、4 000 r/min條件下離心5 min，取上清液。準確吸取上述上清液1 mL于10 mL離心管中，加入100 mg N-丙基乙二胺和100 mg無水硫酸鎂，振蕩1 min，再以同樣的條件離心，取上清液，過0.22 μm有機濾膜于進樣瓶中，供高效液相色譜測定。

1.3.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶水=55∶45（V/V）；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 ?L；260 nm波長處紫外檢測；柱溫：30 ℃。

1.3.5 失活酵母菌吸附獼猴桃汁中氯吡脲的單因素試驗

1.3.5.1 失活酵母菌添加量的確定

分別將0.4、2、4、8、12、20、32、36、40 mg/mL失活酵母菌添加到1 μg/mL氯吡脲的獼猴桃汁中。置于恒溫搖床中吸附，搖床轉速為120 r/min，溫度為28 ℃，吸附時間為2 h。處理結束之后，對獼猴桃汁進行離心分離（3 600×g、10 min、4 ℃），收集上層獼猴桃汁進行提取純化，用高效液相色譜進行氯吡脲剩余量的檢測。考察失活酵母菌添加量對氯吡脲吸附率的影響。

氯吡脲吸附率的計算公式如下：

式中：R為t時間時失活酵母菌對氯吡脲的吸附率/%；C0為獼猴桃汁中氯吡脲的初始質量濃度/（μg/L）；Ct為吸附t時間后獼猴桃汁中剩余氯吡脲的質量濃度/（μg/L）。

1.3.5.2 吸附時間的確定

稱取失活酵母菌50 mg，添加到2.5 mL含有1 μg/mL氯吡脲的獼猴桃汁中。置于恒溫搖床中處理，搖床轉速為120 r/min，吸附溫度為28 ℃。在不同的時間取樣進行獼猴桃汁中氯吡脲剩余量的測定。考察吸附時間對吸附率的影響。

1.3.5.3 氯吡脲初始質量濃度的確定

配制氯吡脲初始質量濃度為0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、10.0 μg/mL的獼猴桃汁。將50 mg失活酵母菌分別添加于不同氯吡脲初始質量濃度的獼猴桃汁中（2.5 mL），置于恒溫搖床中吸附，搖床轉速為120 r/min，溫度為28 ℃。考察氯吡脲初始質量濃度對吸附率的影響。

1.3.5.4 吸附溫度的確定

稱取失活酵母菌50 mg，添加到2.5 mL含有1 μg/mL氯吡脲的獼猴桃汁中。置于恒溫搖床中吸附，搖床轉速為120 r/min，分別在20、28、37、45 ℃條件下吸附2 h。考察吸附溫度對氯吡脲吸附率的影響。

1.3.6 響應面優化吸附條件

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken設計方案，以失活酵母菌添加量、氯吡脲初始質量濃度、吸附時間為試驗因素，氯吡脲吸附率（Y）為響應值，試驗因素水平設計見表1。

表1 響應面試驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.3.7 獼猴桃汁理化指標測定

可溶性固形物含量的測定參照SB/T 10203—1994《果汁通用試驗方法》；色 值和透光率測定參照GB/T 18963—2003《濃縮蘋果汁》；總糖、總酸含量的測定參照SB/T 10203—1994，采 用直接滴定法。

1.4 數理統計分析方法

采用SPSS 18.0軟件進行單因素試驗結果統計分析，利用Design-Expert 8.0軟件設計Box-Behnken試驗，設計建立數學模型，并進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 氯吡脲標準曲線繪制

準確吸取氯吡脲標準溶液，用流動相稀釋為0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL系列質量濃度，利用高效液相色譜進行測定，以質量濃度（x）對峰面積（y）繪制標準曲線，回歸方程為y＝186 609x＋3 397.8，R2＝0.999 5。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 失活酵母菌添加量對吸附率的影響

由圖1可以看出，隨著失活酵母菌添加量的增加，氯吡脲的吸附率呈上升趨勢，當失活酵母菌達到32 mg/mL，氯吡脲的吸附率基本上變化不大。但在失活酵母菌達到20 mg/mL后，氯吡脲的吸附率增加非常緩慢。其原因可能是，當失活酵母菌添加量增加時，有效吸附位點相應增加，但獼猴桃汁中氯吡脲含量是一定的，當失活酵母上的有效吸附位點足夠將獼猴桃汁中氯吡脲全部吸附后，再增加失活酵母菌添加量對氯吡脲的吸附率沒有貢獻，同時加大了分離難度。因此綜合考慮，選擇失活酵母菌的最佳添加量為20 mg/mL。

圖1 失活酵母菌添加量對氯吡脲吸附率的影響Fig.1 Effect of inactivated yeast dosage on forchlorfenuron adsorption

2.2.2 吸附時間對吸附率的影響

圖2 吸附時間對氯吡脲吸附率的影響Fig.2 Effect of adsorption time on forchlorfenuron adsorption

由圖2可知，隨著吸附時間的延長，吸附率呈先增加后降低的趨勢，最終達到平衡。時間太短（小于2 h），反應不完全，因此吸附率較低；吸附時間過長（大于2 h），有可能發生解吸，吸附上的氯吡脲可能又會重新溶于獼猴桃汁中，導致吸附率降低。在吸附時間為2 h 時，吸附率最高，吸附效果最優，因此吸附時間選擇2 h。

2.2.3 氯吡脲初始質量濃度對吸附率的影響

圖3 氯吡脲初始質量濃度對吸附率的影響Fig.3 Effect of initial forchlorfenuron concentration on forchlorfenuron adsorption

由圖3可以看出，隨著氯吡脲初始質量濃度的增加，失活酵母菌對氯吡脲的吸附率明顯降低，當氯吡脲初始質量濃度超過3 μg/mL時，吸附率降低的趨勢明顯減緩。其原因可能是，當獼猴桃汁中失活酵母菌添加量一定時，有效吸附位點的量也是一定的；氯吡脲質量濃度越大，與失活酵母菌吸附位點作用的氯吡脲占總氯吡脲的比例越低，吸附率越低。因此綜合考慮，在后面的優化中選擇氯吡脲初始質量濃度范圍為0.2～3 μg/mL。

2.2.4 吸附溫度對吸附率的影響

圖4 吸附溫度對氯吡脲吸附率的影響Fig.4 Effect of temperature on forchlorfenuron adsorption

由圖4可以看出，隨著吸附溫度的升高，失活酵母菌對氯吡脲的吸附率降低。說明該吸附過程是放熱過程，高溫不利于氯吡脲的吸附。但在20 ℃和28 ℃時對氯吡脲的吸附率沒有顯著差異，因此從實際操作中的方便性和經濟方面綜合考慮，失活酵母菌對氯吡脲的吸附適宜在常溫條件下進行，因此確定溫度為28 ℃。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 Box-Behnken試驗設計方案及結果

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental results for response surface analysis

在單因素試驗中，以獼猴桃汁中氯吡脲的吸附率為試驗指標，研究了影響吸附率的參數。為了進一步確定吸附的最佳條件，綜合單因素試驗結果，以吸附率為響應值，選擇失活酵母菌添加量、氯吡脲初始質量濃度、吸附時間3 個因素設計Box-Behnken試驗。試驗設計與結果如表2所示，其中1～12為析因試驗，13～17為中心試驗，用來估計試驗誤差。

2.3.2 模型方程的建立及顯著性分析

利用Design-Expert 8.0軟件對表2數據進行多元回歸擬合，得到吸附率對失活酵母菌添加量、氯吡脲初始質量濃度、吸附時間真實值的回歸模型：

Y=77.78＋1.34X1－2.97X2＋0.32X3＋0.06X1X2－0.03XX＋0.10XX－0.02X2＋0.20X2＋0.13X21323123

上述回歸方程的方差分析結果見表3。

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Analysis of variance of regression model

由表3可知，失活酵母菌添加量一次項（X1）、氯吡脲初始質量濃度一次項（X2）、吸附時間一次項（X3）達到極顯著水平（P＜0.01），表明失活酵母菌添加量、氯吡脲初始質量濃度、吸附時間對吸附率的線性效應達到極顯著。失活酵母菌添加量的平方項（X12）達到極顯著水平，氯吡脲初始質量濃度的平方項（X22）達到顯著水平，表明其對氯吡脲吸附率的曲面效應顯著。失活酵母菌添加量（X1）和氯吡脲初始質量濃度（X2）的交互項極顯著（P＜0.01），表明各參數對吸附率的影響不是簡單的線性關系。失擬項在P＜0.05水平不顯著，該模型的R2=0.997 9，整體模型達到極顯著水平（P＜0.000 1），說明該模型擬合程度良好，誤差小，模型是合適的；模型的校正決定系數=0.995 2，表明該回歸模型可以解釋99.52%因變量的變化，具有很好的代表性，可以用來預測吸附條件的理論參數。根據回歸方程分析結果，可以看出各因素影響吸附率的大小順序為：失活酵母菌添加量＞氯吡脲初始質量濃度＞吸附時間。

2.3.3 響應面分析

根據回歸方程，作響應面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對氯吡脲吸附率影響的響應面圖Fig.5 Response surface graphs showing the interactive effect of three parameters on forchlorfenuron adsorption

根據圖5曲線的陡峭平滑程度可以看出，失活酵母菌添加量和氯吡脲初始質量濃度的交互作用＞失活酵母菌添加量和吸附時間的交互作用＞吸附時間和氯吡脲初始質量濃度的交互作用。由表3可以看出，只有失活酵母菌添加量和氯吡脲初始質量濃度的交互作用極顯著，其他兩種交互作用不顯著，所以可以不予考慮。由圖5a可以看出，當失活酵母菌添加量處于較低水平時，吸附率隨著氯吡脲初始質量濃度的增加而減少，當失活酵母菌添加量處于較高水平時，吸附率隨著氯吡脲初始質量濃度的增加呈現出先降低后保持不變的趨勢；當氯吡脲初始質量濃度處于較低水平時，吸附率隨著失活酵母菌添加量的增加呈現出先增加后保持不變的趨勢，當氯吡脲初始質量濃度處于較高水平時，吸附率隨著失活酵母菌添加量的增加而增加。

2.3.4 吸附工藝條件的優化和可靠性驗證

為進一步確定最佳吸附條件，用Design-Expert 8.0軟件進行驗證優化，確定失活酵母菌對獼猴桃汁中氯吡脲的最佳吸附條件為：失活酵母菌添加量28.60 mg/mL、氯吡脲初始質量濃度0.20 μg/mL、吸附時間3 h，在此條件下氯吡脲的理論吸附率為97.42%。考慮到實際條件，失活酵母菌添加量取28 mg/mL，用此最優條件進行驗證得到氯吡脲的吸附率為97.02%，與理論值非常接近，表明該回歸模型對優化獼猴桃汁中氯吡脲的吸附條件是可行的。

為了進一步研究失活酵母菌吸附對獼猴桃汁品質的影響，以可溶性固形物含量、pH值、總糖含量、總酸含量等為指標，對吸附前后的獼猴桃汁進行分析，結果見表4。

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Analysis of variance of regression model

由表4可以看出，在P＜0.05時，失活酵母菌吸附前后獼猴桃汁的可溶性固形物、總糖、總酸含量與pH值、透光率理化指標沒有顯著差異。說明利用失活酵母菌處理獼猴桃汁中的氯吡脲是可行的。

3 結 論

本研究用Box-Behnken法優化了失活酵母菌對獼猴桃汁中氯吡脲的吸附條件，得到模型的=0.995 2，說明該回歸模型能解釋99.52%響應值的變化，該模型擬合程度良好，失擬項不顯著（P＞0.05），說明本試驗所得二次回歸方程能很好預測氯吡脲吸附率隨各參數的變化規律。3 個因素對氯吡脲吸附率的影響大小依次為失活酵母菌添加量、氯吡脲初始質量濃度、吸附時間；確立了失活酵母菌吸附氯吡脲的最佳條件為失活酵母菌添加量28 mg/mL、氯吡脲初始質量濃度0.2 μg/mL、吸附時間3 h。在此條件下吸附率為97.02%。失活酵母菌能有效去除獼猴桃汁中氯吡脲，同時對獼猴桃汁品質沒有影響，極大提高了獼猴桃汁的安全性。

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Optimization of Adsorption Conditions for Forchlorfenuron in Kiwifruit Juice by Inactivated Yeast

YANG Lixia, YUE Tianli*, YUAN Yahong, LONG Fangyu, WANG Zhouli
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

The adsorption of forchlorfenuron in kiwifruit juice was studied by inactivated yeast. Based on single-factor experiments, Box-Behnken response surface methodology (RSM) was adopted to study the effects of the key factors (inactivated yeast dosage, initial concentration of forchlorfenuron, and adsorption time) on adsorption efficiency. The influence of the adsorption on main quality indexes of kiwifruit juice was also studied. The results indicated that the optimum adsorption conditions were as follows: inactivated yeast dosage, 28 mg/mL; initial forchlorfenuron concentration, 0.2 μg/mL; and adsorption time, 3 h. Experiments conducted under the optimized conditions gave an adsorption rate of 97.02%, which was consistent with the predicted value by RSM. The quality of kiwifruit juice was not significantly affected by treatment with inactivated yeast (P > 0.05).

adsorption; inactivated yeast; forchlorfenuron; response surface methodology; kiwifruit juice

10.7506/spkx1002-6630-201604001

TS275.5

A

1002-6630（2016）04-0001-06

楊麗霞, 岳田利, 袁亞宏, 等. 響應面試驗優化失活酵母吸附獼猴桃汁中氯吡脲條件[J]. 食品科學, 2016, 37(4): 1-6.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604001. http://www.spkx.net.cn

YANG Lixia, YUE Tianli, YUAN Yahong, et al. Optimization of adsorption conditions for forchlorfenuron in kiwifruit juice by inactivited yeast[J]. Food Science, 2016, 37(4): 1-6. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604001. http://www.spkx.net.cn

2015-06-10

國家自然科學基金面上項目（31371814）

楊麗霞（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全控制技術。E-mail：yanglx1991@126.com

*通信作者：岳田利（1965—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術及食品安全控制。E-mail：yuetl@nwsuaf.edu.cn