癲癇持續狀態后大鼠海馬區鉀離子通道Kv1.3的表達研究

金　銜，　馬　笑，　李　深

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癲癇持續狀態后大鼠海馬區鉀離子通道Kv1.3的表達研究

金銜，馬笑，李深

目的研究氯化鋰-匹羅卡品致癲癇持續狀態 (status epilepticus，SE) 后大鼠海馬區鉀離子通道Kv1.3的表達及分布變化，探討鉀離子通道Kv1.3與癲癇發作的相關性。方法48只健康雄性sprague-dawley大鼠隨機平分為實驗組和對照組，每組繼續隨機分為6 h、1 d、2 d和3 d 4個觀察時間點亞組(n=6)。通過大鼠腦電監測記錄大鼠腦電變化情況，通過尼氏染色觀察腦組織病理改變，采用免疫組織化學染色和Western-blot方法檢測各時間點大鼠海馬區Kv1.3的表達及分布變化。結果(1)腦電監測：正常大鼠腦電圖表現為波幅較均勻一致的α波，癇性發作后開始出現慢波、棘波，波幅、節律不規則，SE過程中表現為長程的棘波活動。(2)尼氏染色：SE后6 h未發現明顯形態學及神經元數量改變；SE后1 d，海馬區神經元結構松散，神經元數量減少；SE后2 d、3 d，海馬區神經元進一步減少，且出現神經元腫脹、變形、尼氏小體減少甚至消失。(3)免疫組織化學染色和Western-blot檢測：SE后2 d，Kv1.3在海馬CA3和CA1區表達較對照組明顯減少 (P<0.05)。SE后6 h、1 d、3 d，Kv1.3在海馬CA3和CA1區表達較對照組無明顯變化 (P>0.05)。SE后6 h、1 d、2 d、3 d，Kv1.3在海馬DG區表達較對照組無明顯差異(P>0.05)。結論Kv1.3的表達下調可能與癲癇發作相關。

癲癇持續狀態；鉀離子通道；Kv1.3；海馬

癲癇是各種原因導致的大腦局部神經元異常高頻同步放電并向周圍腦組織擴散的腦部疾病。我國癲癇的患病率約為5‰。目前，仍有20%～40%的癲癇患者的癥狀得不到有效控制。因此，對癲癇發病機制和新的抗癲癇藥物的開發一直是科學研究的熱點，具有重大的社會意義。本研究通過檢測癲癇持續狀態后大鼠海馬區Kv1.3的表達和分布情況，探索Kv1.3與癲癇發作的相關性。

1　材料和方法

1.1材料健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200～250 g，購自大連醫科大學實驗動物中心。氯化鋰、匹羅卡品購自美國Sigma-Aldrich公司，兔抗大鼠Kv1.3多克隆抗體購自以色列Alomone Labs公司，SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司，全細胞蛋白提取液購自南京凱基生物科技發展有限公司，兔抗大鼠GAPDH抗體、HRP標記的山羊抗兔抗體購自南京巴傲德生物技術有限公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，預染蛋白Marker、ECL發光液購自美國Thermo Scientific公司。

1.2實驗方法

1.2.1模型建立48只大鼠隨機分為實驗組和對照組，每組繼續隨機分為6 h、1 d、2 d和3 d 4個觀察時間點亞組(n=6)。實驗組大鼠予以腹腔注射氯化鋰和匹羅卡品(氯化鋰劑量為3 mEq/kg (125 mg/kg)，匹羅卡品劑量為25 mg/kg)建立癲癇持續狀態模型，對照組大鼠于相同時間點腹腔注射等量生理鹽水，觀察大鼠活動情況。按照Racine六級標準評價大鼠癲癇發作情況：0級：無癇性發作；Ⅰ級：濕狗樣抖動、面肌痙攣如眨眼、動須及節律性咀嚼；Ⅱ級：頸部肌肉痙攣，表現為點頭和(或)甩尾；Ⅲ級：一側前肢陣攣；Ⅳ級：雙側前肢陣攣伴站立；Ⅴ級：全身陣攣，失去平衡，跌倒。若大鼠出現癇性發作，并達到Racine Ⅳ-Ⅴ級發作為造模成功。發作進入癲癇持續狀態并持續50 min后予以腹腔注射10% 水合氯醛終止發作。分別于觀察時間點取腦組織，沿中線分為左右兩部分，一側腦組織用于制備石蠟切片，另一側腦組織用于提取海馬區蛋白。

1.2.2免疫組織化學染色(1)切片脫蠟至水；(2)0.01 mol/L PBS漂洗切片3次，每次5 min；(3)0.3%過氧化氫/甲醇溶液室溫孵育30 min，滅活內源性過氧化物酶；(4)0.01 mol/L PBS漂洗切片3次，每次5 min；(5)枸櫞酸鹽緩沖液修復抗原；(6)0.01 mol/L PBS漂洗切片3次，每次5 min；(7)A液(山羊血清封閉液)37 ℃封閉2 h；(8)一抗(1∶200稀釋)4 ℃孵育過夜；(9)復溫30 min；(10)0.01 mol/L PBS漂洗切片3次，每次5 min；(11)B液(生物素標記山羊抗兔IgG)37 ℃孵育1 h；(12)0.01 mol/L PBS漂洗切片3次，每次5 min；(13)C液(辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，S-A/HRP)37 ℃孵育30 min；(14)0.01 mol/L PBS漂洗切片3次，每次5 min；(15)DAB顯色；(16)脫水透明；(17)中性樹膠封片，晾干；(18)觀察：使用光學顯微鏡觀察Kv1.3在海馬CA1、CA3和DG區的表達情況，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量光密度值。

1.2.3Western-blot(1)提取海馬區蛋白：分離海馬并放入玻璃勻漿器中，加入適量的蛋白裂解液(海馬組織與蛋白裂解液的比例為1∶5，w/v)，置于冰上充分勻漿后移入1.5 ml EP管中，4 ℃，12000 r/min離心30 min，取上清液；(2)考馬斯亮藍法測定蛋白濃度；(3)蛋白變性：將蛋白樣品稀釋為2 μg/μl，分裝40 μl/EP管，向每個EP管中加入10 μl 5×上樣緩沖液，混勻，100 ℃變性5 min，冷卻后于4 ℃保存備用；(4)SDS-PAGE電泳：放置好制膠玻璃板，先后灌注10%的分離膠和5%濃縮膠。插入梳子，待凝膠聚合完全后拔出梳子。放玻璃板入電泳槽內，向電泳槽內加入1×電泳緩沖液，按組別順序將各蛋白樣品和預染Marker加入上樣孔內，蛋白樣品上樣量為20 μg/孔，預染Marker上樣量為5 μl/孔。接通電源，先調整電壓為80 V，當溴酚藍全部進入分離膠后調整電壓為100 V，待溴酚藍到達凝膠底端時關閉電源，終止電泳；(5)轉膜：截取凝膠，剪裁與凝膠大小相同的濾紙和PVDF膜，在石墨電極上依次整齊放置濾紙(3層)、PVDF膜、凝膠和濾紙(3層)，小心搟除氣泡，蓋好蓋板，接通電源，轉膜55 min；(6)封閉：5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h；(7)孵育一抗：TBST漂洗PVDF膜，于雜交袋中4 ℃孵育一抗(Kv 1.3抗體稀釋濃度為1∶200，GAPDH抗體稀釋濃度為1∶1000)過夜；(8)TBST漂洗PVDF膜4次，每次12 min；(9)孵育二抗：于雜交袋中孵育二抗(1∶5000)，室溫下孵育2 h；(10)TBST漂洗PVDF膜4次，每次12 min；(11)顯影(暗室中操作)：控制曝光時間，然后將X光片置于顯影液中1 min，轉至定影液中定影5 min，用清水沖洗，晾干。(12)圖像分析：掃描膠片，用Image J軟件測量各個條帶的光密度值(IOD)，計算目的條帶與內參GAPDH條帶的IOD比值，作為半定量分析指標。

2　結　果

2.1腦電監測造模前大鼠和對照組大鼠腦電圖表現為波幅較均勻一致的α波；實驗組大鼠癲癇發作后逐漸出現慢波、棘波，波幅、節律不規則，SE過程中表現為長程的棘波活動(見圖1)。

A為大鼠造模前腦電圖，B為大鼠SE時腦電圖

2.2尼氏染色對照組大鼠海馬組織結構完整，細胞排列整齊。實驗組大鼠海馬組織在SE后6 h，未發現明顯形態學及神經元數量改變；在SE后1 d出現細胞離散，排列松散，神經元數量明顯減少；

SE后2 d、3 d，海馬組織神經元進一步減少，且出現神經元腫脹、變形、尼氏小體減少甚至消失(見圖2)。

2.3免疫組織化學染色檢測Kv1.3的表達Kv1.3陽性染色為棕褐色，主要存在于細胞膜上。Kv1.3在正常大鼠及SE大鼠海馬區廣泛分布，富集于CA3和CA1錐體細胞胞體和突起，以及齒狀回 (dentate gyrus，DG) 顆粒細胞。SE后6 h、1 d，Kv1.3在海馬CA3和CA1區表達水平與對照組無明顯差異 (P>0.05)。SE后2 d，Kv 1.3在海馬CA3區和CA1區表達水平較對照組明顯減少 (P<0.05)。SE后3 d，Kv1.3在海馬CA3區和CA1區表達水平恢復至與對照組相同水平。SE后6 h、1 d、2 d、3 d，Kv1.3在海馬DG區的表達水平均與對照組相比無明顯差異 (P>0.05)(見圖3～圖5、表1)。

圖2　實驗組和對照組各觀察時間點大鼠海馬組織形態學觀察(尼氏染色50×)

圖3　不同觀察時間點實驗組和對照組大鼠海馬 CA3 區 Kv1.3 表達情況(200×)

圖4　不同觀察時間點實驗組和對照組大鼠海馬 CA1 區 Kv1.3 表達情況(200×)

圖5　不同觀察時間點實驗組和對照組大鼠海馬 DG 區 Kv1.3 表達情況(200×)

分組 海馬分區CA3CA1DG對照組實驗組6h1d2d3d6h1d2d3d0.140±0.0180.136±0.0390.147±0.0210.149±0.0450.141±0.0530.095±0.0160.086±0.023*0.095±0.0170.134±0.0450.142±0.0530.150±0.0290.122±0.0300.138±0.0480.093±0.0220.086±0.024*0.099±0.0250.127±0.0230.116±0.0400.123±0.0260.128±0.0260.132±0.0450.099±0.0170.123±0.0320.094±0.027

表示實驗組與相同時間點對照組相比有統計學差異*P<0.05

2.4Western-blot檢測Kv1.3的表達SE后2 d，實驗組大鼠海馬區Kv1.3表達明顯低于對照組，差異有統計學意義 (P<0.05)；SE后6 h、1 d、3 d實驗組與對照組比較無顯著性差異 (P>0.05)(見圖6、表2)。

圖6　不同觀察時間點實驗組和對照組大鼠海馬區 Kv1.3 表達量

時間Kv1.3與GAPDH光密度比值對照組實驗組6h1d2d3d0.739±0.1330.721±0.0330.810±0.1390.800±0.0530.812±0.0950.856±0.0170.314±0.085*0.577±0.110

表示實驗組與相同時間點對照組相比有統計學差異*P<0.05

3　討　論

癲癇的發病機制非常復雜，尚不完全清楚。在中樞神經系統中，離子通道的活動在維持神經元膜電位穩定中發揮十分重要的作用。越來越多的研究表明，癲癇是一種離子通道病[1，2]，編碼鉀、鈉、鈣、氯等離子通道的基因突變可導致其編碼的膜蛋白功能異常，進而使細胞內外離子的分布和轉運出現異常，引起神經元高興奮性，導致癲癇的發生[3]。

鉀離子通道由70多種基因編碼，是中樞神經系統中種類最多、分布最廣的膜蛋白，在神經元膜靜息電位的維持和動作電位復極化的調節中發揮主導作用，對控制膜興奮性和穩定動作電位幅度和頻率有重要作用，同時參與神經遞質的釋放、神經沖動傳導、細胞生長和分化、細胞凋亡等多種生理過程[4，5]。當鉀離子通道減少或者鉀離子通道功能被阻斷時將會導致細胞膜興奮性增高，引起癲癇發作。近年來，鉀離子通道作為新興的抗癲癇藥物的作用靶點已得到了研究者的廣泛關注[6]。

研究表明，延遲整流鉀離子通道家族(Kv)是電壓門控鉀離子通道一個亞型，屬于延遲整流鉀離子通道，該離子通道開放時促進鉀離子外流，在動作電位復極化過程的調節中發揮積極作用。Kv1的結構和功能異常與癲癇的發生密切相關。Kv1.1基因敲除小鼠表現出神經元高興奮性癥狀，并出現自發癇性發作，在基因水平證實Kv1與癲癇發生密切相關[7]。曾常茜、李亞偉等[8，9]證實Kv1.2和Kv1.4在癲癇發作大鼠腦內表達水平較對照組顯著降低，該變化從癲癇發生后1 h開始，48～72 h仍存在。本研究則旨在探索Kv1.3是否亦參與癲癇發生過程。研究證明，致驚厥劑戊四唑可明顯降低Kv1.3電流[10]，說明Kv1.3可能與癲癇發生有相關性，與本實驗結論相符合。本實驗證實，SE后2 d，Kv1.3在大鼠海馬CA1和CA3區表達明顯降低，且該變化持續時間較短，提示Kv1.3表達可能與癲癇發病過程的動態演變相關。Kv1.3的表達變化在CA3和CA1區明顯，提示其在這兩個腦區內發揮其病理生理作用。

本實驗證實SE后大鼠海馬區Kv1.3表達出現一過性降低，由此推測Kv1.3可能參與癲癇的發生過程，其發生機制尚需進一步的研究。

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Study on the expression of potassium channel Kv1.3 in rat hippocampus after status epilepticus

JINXian，MAXiao，LIShen.

(DalianMunicipalCentralHospita，Dalian116033，China)

ObjectiveTo investigate the expression and distribution of potassium channel Kv1.3 in rat hippocampus after status epilepticus (SE) induced by lithium and pilocarpine，to explore the relationship between Kv1.3 and epileptogenesis. Methods48 healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into experiment group and control group. The rats in each group were further randomly assigned into 6 h，1 d，2 d and 3 d subgroups (n=6). Electroencephalography (EEG) of rats in both groups were recorded to show the electrical activity of the rat brains. Nissel staining was performed to investigate the pathological changes and immunohistochemistry and westernWestern-blot were applied to analyze the expression and distribution of Kv1.3. Results(1) The EEG of rats in control groups showed α wave with uniform amplitude，while the EEG in rats subjected to pilocarpine injection showed slow waves and spike waves with irregular amplitude and rhythm. Sustained spike waves were observed during SE. (2) Nissl’s staining showed that 6 h after SE，the neural morphology of hippocampi in experiment groups was as the same to that in control groups. There was no change in neuronal morphology and numbers. However，1 d after SE，the structure of hippocampi was discrete and the number of neurons was decreased. 2 days and 3 days after SE，the number of neurons in hippocampi decreased further. Swelling and deformation of neurons were seen. Nissl bodies emerged，decreased or even disappeared. (3)The expression of Kv1.3 were significantly decreased in CA3and CA1region 2 d after SE as compared to control group (P<0.05). There was no difference in the expression of Kv1.3 in CA3and CA1 region between experiment groups and control groups 6 h，1 d or 3 d after SE (P>0.05). The expression of Kv1.3 did not show difference in DG area in experiment groups as compared to control groups at all time points examined (P>0.05). Western-blot of isloated proteins in individul brain region showed the same trend. ConclusionThe decreased expression of Kv1.3 may play a role in the epileptogenesis.

Status epilepticus；Potassium channel；Kv1.3；Hippocampus

1003-2754(2016)05-0392-05

2016-01-10

2016-03-01

國家自然科學基金(81300985)，遼寧省自然科學基金(201501821)，大連市衛生計生委計劃項目

(大連市中心醫院，遼寧 大連 116033)

李深，E-mail：listenlishen@hotmail.com

R742.1

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