采收方式和成熟度對上部煙葉細胞結(jié)構(gòu)及品質(zhì)的影響

陳　剛，周清明，楊姣弟，易　克，徐向麗，周立新，田　云,4

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，長沙 410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，長沙 410128；3.湖南中煙工業(yè)有限責任公司，長沙 410006；4.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科技學院，長沙 410128）

采收方式和成熟度對上部煙葉細胞結(jié)構(gòu)及品質(zhì)的影響

陳剛1,2，周清明1，楊姣弟2，易克3，徐向麗3，周立新3，田云2,4

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，長沙 410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，長沙 410128；3.湖南中煙工業(yè)有限責任公司，長沙 410006；4.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科技學院，長沙 410128）

為研究烤煙上部葉采收的最適成熟特征，將云煙87上部葉按不同成熟度進行分次采收，通過外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量評價確定常規(guī)采收時間推遲5 d即移栽后125 d（M2階段）對烤煙進行一次性采收，煙葉質(zhì)量最優(yōu)。其中移栽后125 d的頂3～頂1葉（TM2）的外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量評分為44.67和71.79；移栽后125 d的頂6～頂4葉（FM2）為43.36和71.75；均優(yōu)于其他幾個階段。從葉片結(jié)構(gòu)的細胞學變化規(guī)律看出，隨著煙葉成熟度的提高，柵欄組織和海綿組織在移栽后125 d（M2階段）開始變得疏松、細胞間隙增大、細胞中各種細胞器開始降解、淀粉顆粒積累到最飽滿狀態(tài)。其中移栽后125 d的頂2葉的柵欄組織厚度、海綿組織厚度、柵欄組織細胞密度和海綿組織細胞密度分別為145.3 μm、144.7 μm、43 個/mm、43 個/mm；移栽后125 d的頂5葉的柵欄組織厚度、海綿組織厚度、柵欄組織細胞密度和海綿組織細胞密度分別為139.7 μm、148 μm、42 個/mm、41個/mm。該研究進一步證實M2階段為烤煙上部葉采收最適成熟特征。

烤煙上部葉；成熟度；細胞結(jié)構(gòu)；外觀質(zhì)量；感官質(zhì)量

目前，我國生產(chǎn)的上部煙葉可用性不高，很難用于一、二類卷煙配方。而造成我國上部煙可用性不高的主要原因是采收成熟度不夠[1]。采收成熟度是烤后成熟度的基礎(chǔ)，分級成熟度是烤后成熟度的根本體現(xiàn)，只有采收成熟度好的鮮煙葉，經(jīng)過恰當?shù)暮婵?，才能獲得成熟度好、品質(zhì)高的煙葉，因此采收成熟度一直是煙草科學研究的重點。近年來，許多研究表明烤煙煙葉的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)直接反映了烤煙的營養(yǎng)狀況和成熟特征，最終影響到煙葉的品質(zhì)[2]。而葉片的組織結(jié)構(gòu)指的是葉肉細胞的發(fā)育狀況，不同成熟度煙葉的葉組織結(jié)構(gòu)存在差異，許多研究結(jié)果表明，成熟煙葉的組織排列疏松、存在合適的胞間隙[3-7]。因此，本文主要通過開展不同時間一次性采收上部煙葉的試驗，對烤后煙葉質(zhì)量進行評價，得出上部煙葉的最佳采摘時間；同時，通過對不同成熟度采收時細胞結(jié)構(gòu)變化進行研究，探明不同成熟度煙葉的細胞結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，為上部煙葉最適采收時期的確定及成熟特征的描述提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗地及種植品種概況

本試驗在云南省嵩明縣牛欄江鎮(zhèn)小新街村黑龍?zhí)缎〗M石則地進行，土壤為紅壤砂壤土，pH 5.55，有機質(zhì)25.34 g/kg，堿解氮102.2 mg/kg，有效磷76.3 mg/kg，速效鉀183.5 mg/kg，種植品種為云煙87。基肥施用煙草專用肥[m(N):m(P2O5):m(K2O)= 12:8:24] 35 kg/667m2，追肥為硝酸鉀5 kg/667m2。

1.2試驗設(shè)計

煙株打頂時，要求打頂留葉數(shù)控制在21±1片。當煙葉采摘到只剩下6片葉時，即進入試驗期。頂部6片煙葉自上向下依次掛牌如下：頂部第1葉位（簡稱頂1）、頂部第2葉位（簡稱頂2）等以此類推。對照記為M1，移栽后120和125 d兩次采收，按常規(guī)方法分別烘烤后混合取樣進行評價；M2、M3和M4依次推遲5 d采收，即移栽后125、130和135 d，6片葉一次采收。所有處理均將頂6～頂4與頂3～頂1分別堆放和編桿，頂6～頂4葉記為FM1、FM2、FM3、FM4，頂3～頂1葉記為TM1、TM2、TM3和TM4，用于外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量評分。處理見表1。

1.3檢測和評價項目

1.3.1烤煙外觀質(zhì)量評分 烤后煙葉送往湖南中煙工業(yè)有限責任公司進行外觀質(zhì)量評分，評分內(nèi)容分別按照：成熟度、身份、油分、色度和結(jié)構(gòu)進行打分，實行50分制。

1.3.2感官評吸 評吸材料送往湖南中煙工業(yè)有限責任公司進行專業(yè)測評，評吸內(nèi)容分別按照：香氣質(zhì)、香氣量、濃度、余味和雜氣等指標進行打分，實行100分制。評吸時由13名專業(yè)評吸人員組成，采用暗評的方式進行評吸。評吸的基本要求參照煙草行業(yè)YC/138—1998 煙草及煙草制品 感官評價方法中的相關(guān)條款執(zhí)行。

1.3.3石蠟切片取樣及數(shù)據(jù)統(tǒng)計 于各處理采收當天挑選正常煙株的相同葉位煙葉進行取樣（從上往下數(shù)頂2葉和頂5葉，M1處理在第一次采收時進行）。所有相同葉位打孔部位應(yīng)保持一致，為中心葉脈和左右周邊葉緣之間1/2中線地帶，打孔時要避開支脈，置于FAA固定液中，固定1周以上。

表1　試驗處理Table1　The detailed table of treatments

表2　感官質(zhì)量評分標準Table2　The grading standard of sensory smoking

按照：取材→復水→固定→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→烤片→脫蠟→復水→染色→脫水→透明→封藏流程，制作樣品的石蠟切片，在AMGEVOS 熒光顯微鏡（×200）下觀察、拍照。

1.3.4 掃描電子顯微鏡 取材后用3%戊二醛預固定2 h，磷酸緩沖液沖洗3次，每次間隔10 min；1%鋨酸固定1 h，再用磷酸緩沖液清洗3次，每次10 min；接下來用30%，50%，70%，90%，100%，100%，100%酒精脫水各10 min，再放入叔丁醇浸泡至少2 h；最后放到冷凍干燥儀干燥置換里面的水（一般是3～4 h），噴金上機進行觀察。

1.3.5透射電子顯微鏡 取材后用3%戊二醛預固定2 h，磷酸緩沖液沖洗3次，每次間隔10 min；鋨酸固定2 h，磷酸緩沖液沖洗2次，每次間隔各10 min；1%醋酸雙氧鈾染色1 h；50%，70%，90%酒精脫水各10 min；100%酒精脫水1次，100%丙酮脫水1次，每次10 min；丙酮與包埋劑1:1混合液浸透1 h以上；純包埋試劑浸透，37 ℃過夜；60 ℃，固化48 h；降溫，切片，上機觀察。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel等軟件進行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2　結(jié) 果

2.1不同采收方式和成熟度上部煙葉的細胞結(jié)構(gòu)

2.1.1采收方式和成熟度上部煙葉的石蠟切片觀察 從圖1的石蠟切片結(jié)果來看，頂2和頂5這兩片葉的變化規(guī)律基本一致：隨著時間的往后推移，成熟度的增加，柵欄組織和海綿組織的細胞間隙率增加。其中，在常規(guī)時間采摘（M1）階段，細胞排列緊密、整齊；在延遲5 d采摘時間即移栽125 d（M2），細胞間呈現(xiàn)一定的間隙率；到延遲15 d采摘時間即移栽135 d（M4），最為明顯。而通過對各組織結(jié)構(gòu)的顯微測量（表3），隨著時間的推移，成熟度的增加，葉片的葉厚漸漸減小。柵欄組織的厚度呈減小趨勢；而海綿組織厚度呈增長趨勢。柵欄細胞和海綿細胞單位長度的細胞個數(shù)也反應(yīng)了細胞間的密度，從表3中可以看出，隨著成熟度的增加，單位面積內(nèi)柵欄細胞和海綿細胞的個數(shù)均減少，說明細胞間隙呈加大的趨勢。這應(yīng)該跟煙葉成熟后期由于細胞內(nèi)水分減少出現(xiàn)細胞干縮有關(guān)。

2.1.2不同采收方式和成熟度上部煙葉的掃描電鏡觀察 將煙葉的第5片葉進行電子掃描拍攝，從細胞的掃描電鏡結(jié)果來看（圖2），海綿組織在移栽后120 d（M1），125 d（M2）階段細胞飽滿；從移栽130 d（M3）開始細胞變小，細胞間隙變大；而到移栽135 d（M4），細胞明顯皺縮，胞間隙進一步變大。這與細胞漸漸衰老失水，細胞器及內(nèi)含物的降解有關(guān)。從柵欄組織的橫切面圖來看，柵欄組織與海綿組織的變化基本一致。綜合上面的石蠟切片結(jié)果，掃描電鏡的結(jié)果與石蠟切片組織結(jié)構(gòu)的變化趨勢基本保持一致。

2.1.3不同成熟度上部煙葉的透射電鏡觀察 從葉綠體的透射顯微結(jié)果來看（圖3），煙葉在移栽后120 d（M1）細胞結(jié)構(gòu)完整，各種細胞器被中央大液泡擠到細胞邊緣，靠近細胞壁，葉綠體中的淀粉粒處于進一步增長趨勢。且從M1中可以清晰地看到排列整齊、清晰的葉綠體類囊片層。有研究認為，葉綠體類囊體的垛疊程度是決定其光合能力的主要因子[8]，所以從圖中排列整齊的葉綠體類囊體可以得出該階段仍處于淀粉合成階段。在移栽125 d（M2），細胞中各種細胞器開始降解，類囊體膨脹、松弛，淀粉粒積累達到最大。移栽130 d（M3）時，細胞器降解嚴重，葉綠體膜降解，葉綠體解體，淀粉粒充斥在整個細胞中，同時，淀粉粒也開始發(fā)生降解，葉綠體中的類囊體片層基本降解完全。到移栽135 d（M4）時，各種細胞器降解完全，淀粉粒也降解嚴重。而從圖中可以看出，線粒體并沒有隨著成熟度的增加而減少，即線粒體在這個過程中變化很小。

圖1　石蠟切片結(jié)果圖（200倍）Fig.1 The slice sample of paraffin wax at different stages

表3　不同成熟度煙葉組織結(jié)構(gòu)Table3　Tissue structure of tobacco leaves with different maturity

圖2　柵欄組織及海綿組織掃描電鏡圖Fig. 2　The Scanning electron microscopy figure of palisade tissues and sponge tissues

圖3　柵欄組織細胞透射電鏡圖Fig. 3　Cells of palisade tissues by transmission electron microscope

2.2 采收方式和成熟度對烤煙上部葉品質(zhì)的影響

2.2.1采收方式和成熟度對烤煙上部煙葉外觀質(zhì)量的影響 從上部葉外觀質(zhì)量量化鑒評結(jié)果（表4）可知，不同采收成熟度對烤后煙葉外觀質(zhì)量有明顯的影響。頂3～1葉及頂6～4葉均以移栽125 d采摘（M2）總分最高，其中移栽125 d采摘的頂3～1葉（TM2）總分、成熟度和結(jié)構(gòu)分值與其他處理相比存在顯著性差異。而移栽125 d采摘的頂6～4葉（FM2）成熟度、結(jié)構(gòu)和油分3項指標分值均較高，與其他處理間存在顯著性差異。綜上，從成熟度、身份、油份、色度、結(jié)構(gòu)各項指標來看，分值均以移栽后125 d（M2）采摘者最高。

2.2.2采收方式和成熟度對烤煙上部葉感官質(zhì)量的影響 從表5看出，頂3～1葉的嗅覺特征以常規(guī)采摘最好，而味覺特征則以移栽130 d采摘最佳，綜合其各個方面的特征，在移栽125 d采摘得分最高，即在常規(guī)采摘推遲5 d即移栽125 d（M2）時頂3～1葉煙葉綜合性能最好，該階段為最佳采摘時間段。頂6～4葉的嗅覺特征也是常規(guī)采摘最好，味覺特征和綜合分數(shù)以移栽125 d（M2）采摘者最高。

研究結(jié)果表明，無論從煙葉的烤后外觀質(zhì)量還是感官質(zhì)量評價來看，上部煙葉在移栽125 d進行一次性采收時煙葉質(zhì)量最佳，其次是移栽130 d，而常規(guī)采摘和移栽135 d采摘烤煙質(zhì)量相對較差，說明未熟或過熟都影響煙葉的品質(zhì)，降低其工業(yè)可用性。

表4　不同采收方式和成熟度上部葉外觀質(zhì)量差異Table4　Appearance of flue-cured tobacco upper leaves

表5　不同采收方式和成熟度上部葉感官質(zhì)量差異Table5　Sensory quality of flue-cured tobacco upper leaves

3　討 論

目前對煙葉細胞結(jié)構(gòu)（超微結(jié)構(gòu)）的研究集中在水分脅迫[9-10]、病毒侵染[11-12]等逆性條件下的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律及發(fā)育過程中的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律上[13]，對不同成熟度采收時細胞結(jié)構(gòu)變化少有研究。本文通過對4個不同成熟度的上部煙葉進行細胞結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)研究，得出上部煙葉最佳采摘時期煙葉的細胞結(jié)構(gòu)特征。同時，不同于前期研究的是，本文將各種方法（外觀質(zhì)量，感官質(zhì)量評價，細胞結(jié)構(gòu)等）綜合起來，更加科學、全方面的研究上部葉一次性采摘的最佳時間段。

本試驗設(shè)置的4個處理，M1是煙農(nóng)按照以往經(jīng)驗采收的時間點，從試驗結(jié)果來看，還未到采收的最佳時間，應(yīng)該在此基礎(chǔ)上適當延長5 d左右的時間，提高其成熟度，使上部葉煙葉品質(zhì)提高。其次，傳統(tǒng)的上部葉采收是分次采收，相比一次性采收要花費更多的人力，且從烤煙評吸結(jié)果來看，一次性采收能提高上部煙葉的成熟度，成熟度提高后，煙葉的香氣質(zhì)與香氣量提高，雜氣和刺激性降低，可用性有所提高，這與前人研究保持一致[14]。

從以上結(jié)果來看，煙葉在移栽125 d時處于適熟階段，而對應(yīng)石蠟切片及電鏡檢測可以看出，該階段組織結(jié)構(gòu)疏松，有機物積累較好，最適合采摘。而在常規(guī)采摘M1階段，組織結(jié)構(gòu)較為緊密，有機物積累不夠充分，因此尚處于初熟階段，不適合采摘。移栽135 d時細胞內(nèi)積累物開始降解，細胞結(jié)構(gòu)開始解體，因此處于過熟階段，影響煙葉品質(zhì)，也不適合煙葉的采摘，該結(jié)果與張友玉[15]等研究結(jié)果基本一致。而綜合評吸結(jié)果也可知，移栽125 d采收的煙葉評吸綜合分數(shù)最高，此時的煙葉價值最高，這與煙葉組織結(jié)構(gòu)研究的結(jié)果相吻合。移栽125 d時煙葉對應(yīng)的外觀特征是葉面淡黃，落黃面積約80%，主脈支脈全白，茸毛脫落，葉緣葉尖卷曲，葉耳淺黃色，有部分焦尖現(xiàn)象。所以，當出現(xiàn)以上特征時，是煙草上部葉一次性采摘的最佳時間。

[1] 朱尊權(quán). 提高上部煙葉可用性是促“卷煙上水平”的重要措施[J]. 煙草科技，2010（6）：5-6．

[2] 劉衛(wèi)群，郭紅祥，石永春，等. 配施餅肥對烤煙葉片組織結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2004，37（增刊）：6-10．

[3] 李躍武，陳朝陽，江豪，等．烤煙品種云煙85 煙葉的成熟度Ⅰ成熟度與葉片組織結(jié)構(gòu)、葉色、化學成分的關(guān)系[J]. 福建農(nóng)林大學學報：自然科學版，2002，31（1）：16-21.

[4] 聶榮邦，李海峰，胡子述. 烤煙不同成熟度鮮煙葉組織結(jié)構(gòu)研究[J]. 煙草科技，1991（3）：37-39.

[5] 冉邦定，劉敬業(yè)，李天福，等. 成熟度、施肥量、留葉數(shù)與煙葉組織結(jié)構(gòu)和比葉重的關(guān)系[J]. 中國煙草，1993（2）：56-59 .

[6] 張樹堂，楊雪彪，王亞輝，等. 不同成熟度烤煙鮮煙葉的組織結(jié)構(gòu)比較[J]. 煙草科技，2005（1）：38-40.

[7] 王懷珠，汪 健，胡玉錄. 莖葉角度在判斷烤煙葉成熟度中的作用[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2005（4）：79-81.

[8] Fahn A, Benayoun J. Ultrastructure of resin ducts in Pinus halepensis development, possible sites of resin synthesis and mode of its elimination from the protoplast[J]. Annals of Botany, 1979, 40: 857-863.

[9] 張華，趙百東，冀浩，等. 水分脅迫對烤煙腺毛超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國煙草學報，2008，10（5）：45-47.

[10] 王逸群，周發(fā)俊，曾少嬌. 淹水對煙草葉肉細胞傷害的超微結(jié)構(gòu)觀察[J]. 重慶科技學院學報：自然科學版，2008，6（3）：35-38.

[11] 劉國順，張彩霞，王嬋娟，等. 受烤煙花葉病病毒侵染后葉中保護酶活性和超微結(jié)構(gòu)的變化[J]. 植物生理學通訊，2009，45（5）：49-465 .

[12] 黃遵錫，李紅. 感染煙草花葉病毒煙葉超微結(jié)構(gòu)的觀察[J]. 南京師范大學學報，1995，15（2）：58-67.

[13] 王嬋娟，劉國順，賀凡，等. 烤煙發(fā)育及成熟過程中細胞超微結(jié)構(gòu)的變化[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報，2010，22（2）：234-238.

[14] 劉勇，周冀衡，周國生，等. 采收方式和成熟度對烤煙上部煙葉產(chǎn)質(zhì)量的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報，2012，34（1）：16-21.

[15] 張友玉. 煙草葉片組織結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察方法[J].電子顯微學報，2000，19（2）：154-157.

Study on the Effect of Plucking Methods and Maturity on the Cellular Structure and Quality of Tobacco Upper Leaves

CHEN Gang1,2, ZHOU Qingming1, YANG Jiaodi2, YI Ke3, XU Xiangli3, ZHOU Lixin3, TIAN Yun2,4
(1. College of Agriculture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Agricultural Bioengineering Research Institute, Changsha 410128, China; 3. China Tobacco Hunan Industrial Co., Ltd., Changsha 410006, China; 4. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China）

In order to study the optimum mature characteristic of tobacco upper leaves for plucking, the appearance and sensory qualities of YunYan87 upper leaves were analyzed. The results showed that the date of 125 days after transplanting (M2) was the best stage of one-time plucking of upper leaves. The appearance and sensory qualities scores of the top3-1 leaves at the date of 125 days after transplanting (TM2) were 44.67 and 71.79 respectively, and the top6-4 leaves at the date of 125 days after transplanting (FM2) were 43.36 and 71.75, which were all better than those of other stages. The cytology observation of tobacco leaves indicated that the palisade tissue and spongy tissue of tobacco leaves became more loosen from the date of 125 days after transplanting (M2), with the intercellular space enlarged, organelle degraded, and the starch particles were full. The thickness and cell density of palisade tissue and spongy tissue of the top2 leaves at the date of 125 days after transplanting was 145.3 μm, 144.7 μm, 43 mm and 43 mm; The thickness and cell density of palisade tissue and spongy tissue of the top5 leaves at the date of 125 days after transplanting was 139.7 μm, 148 μm, 42/ mm and 41/mm, respectively. This research might provide the theoretical base for further verifying that the M2 stage was the optimum mature characteristic of upper tobacco leaves for plucking.

upper tobacco leaf; maturity; cellular structure; appearance quality; sensory quality.

S572.01

1007-5119（2016）05-0034-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.05.007

湖南中煙工業(yè)有限責任公司科研計劃項目“提高上部葉可用性研究”（2012130134），“云南北回歸線區(qū)域特色品種篩選和品質(zhì)定位研究”（2010130230）

陳 剛（1982-），男，在讀博士研究生，研究方向：煙草技術(shù)與工程。E-mail：8989821@qq.com。*通信作者，E-mail：tianyun@hunau.edu.cn

2016-01-11

2016-03-20