高密度CO2殺菌和鈍酶及其在食品加工中應用的研究進展

劉書成，郭明慧，劉　媛，劉蒙娜，鄧倩琳

（廣東海洋大學食品科技學院//廣東省水產品加工與安全重點實驗室//廣東省海洋食品工程技術研發中心//廣東普通高校水產品深加工重點實驗室，廣東 湛江 524088）

高密度CO2殺菌和鈍酶及其在食品加工中應用的研究進展

劉書成，郭明慧，劉媛，劉蒙娜，鄧倩琳

（廣東海洋大學食品科技學院//廣東省水產品加工與安全重點實驗室//廣東省海洋食品工程技術研發中心//廣東普通高校水產品深加工重點實驗室，廣東 湛江 524088）

總結近10年來國內外在高密度CO2（ Dense phase carbon dioxide，DPCD ） 技術的基礎研究和應用研究領域的相關工作。基礎研究領域主要包括DPCD與食品體系的相平衡、DPCD殺滅微生物營養體和芽孢的效果與機制、DPCD鈍酶的效果與機制等，應用研究領域主要包括DPCD在液體（果蔬汁、啤酒、牛奶）和固體食品（鮮切果蔬、肉制品、海洋食品）加工中應用。提出DPCD技術未來發展可能需要解決的問題。

高密度CO2；殺菌；鈍酶；液體食品；固體食品

高密度 CO2（Dense phase carbon dioxide，DPCD）是一項非常有前景的食品非熱加工技術，它是指將食品放置在間歇、半連續或者連續處理的設備中，通過與加壓CO2或者超臨界CO2（通常溫度＜ 60℃，壓強＜50 MPa）接觸一定時間，利用壓強場下CO2的分子效應實現殺滅微生物和鈍酶以及蛋白質變性等目的，從而使食品得以長期保藏或直接食用。DPCD技術與超臨界CO2萃取技術是不完全相同的。在超臨界CO2萃取過程中，CO2作為溶劑萃取物料中有效成分；而在DPCD處理過程中，CO2作為溶質溶于水再作用于食品。DPCD主要指超臨界狀態的CO2，但有時也包括亞臨界氣態或液態CO2。與傳統的熱加工相比，由于DPCD處理過程中無氧、溫度低，能更好保留食品的熱敏性成分如維生素、生物活性成分等。與超高壓（100～1000 Mpa）相比，DPCD處理壓強更低、能耗低、成本低、容易操作與控制等。雖然DPCD設備和運行成本高于傳統熱加工，但是其成本遠低于其他非熱加工技術（超高壓等）。筆者對近10年來國內外研究者在DPCD技術的基礎研究和應用研究方面所做的工作進行綜述，以期為該技術的研究與產品開發提供參考。

1　高密度CO2技術基礎研究領域

DPCD的基礎理論一直是研究的熱點領域，它對于指導設備和工藝的設計與研發以及在生產中應用具有重要的意義。DPCD技術基礎研究領域主要有：DPCD與食品體系的相平衡、DPCD殺菌效果和模型與機制、DPCD殺滅芽孢的效果和機制、DPCD鈍酶效果和模型與機制等。

1.1高密度CO2與食品體系的相平衡

準確的相平衡數據，特別是CO2在食品體系中的溶解度，對于設計和優化工藝和設備是至關重要的。根據現有文獻，可將CO2相平衡的研究分為4個方面：1）大氣中CO2的捕集和封存。研究CO2與吸附劑之間的相平衡。2）超臨界 CO2中的化學反應和酶催化反應（包括功能材料的制備）。研究CO2與反應物和產物之間的相平衡。3）超臨界CO2萃取生物活性物質。研究生物活性物質與CO2（共溶劑）的相平衡。4）DPCD的殺菌和鈍酶。研究DPCD與食品體系的相平衡。前3個方面的研究文獻比較多，而專門研究CO2與食品體系相平衡的文獻比較缺乏，這主要是因為食品是一個比較復雜的體系。

有研究者以純水和含有離子的模式水溶液體系，從理論上建立高壓下CO2的溶解度預測模型和熱動力學模型，獲得了大量的理論基礎數據，為研究DPCD與食品體系的相平衡提供了參考。Diamond等［1］研究了CO2在-1.5～100℃和0.1～100 MPa下在純水中的溶解度和熱力學模型，Portier等［2］研究了CO2在0～300℃和0.1～30 MPa下在純水和NaCl水溶液中的溶解度，Duan等［3］研究了 CO2在 0～260℃和0～200 MPa下在0～4.5 mol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、SO42等離子溶液中的溶解度，Zhao等［4］研究了CO2在50、100、150℃和15 MPa下在NaCl水溶液中的溶解度，Tang等［5］研究了CO2在35、55、95、135℃和 0～40MPa下在含有碳酸氫鹽溶液中的溶解度，Pereira等［6］研究了高溫高壓對CO2與水體系相平衡密度和界面張力的影響，Deering等［7］研究了CO2在45～96℃和0～35 MPa下溶于水的部分摩爾體積，Efika等［8］研究了在20～177℃和0～64 MPa下CO2與水的飽和密度相行為。

以真實的食品體系為對象，研究高壓下CO2與食品體系相平衡的文獻是非常少的，僅有的幾篇文獻主要是建立和預測CO2在不同液體食品中的溶解度模型。Tomasula等［9］研究CO2在牛奶中的溶解度，Calix等［10］研究了CO2在40℃和7.58、15.86 MPa下在橙汁、蘋果汁和模型液體食品中的溶解度，Ferrentino等［11］研究了 CO2在35、60℃和 7.5、15 MPa下在蘋果汁中的溶解度和熱力學模型，Ferrentino 等［12］研究了CO2在35、40、50℃和7.5、15 MPa下在純水和磷酸二氫鈉（質量分數0.24%、2.4%、4.8%）的食品溶液中的溶解度，iplap等［13］研究了CO2在西紅柿漿中的溶解度。Ferrentino 等［14］研究了CO2在25、35、40℃和8、12MPa下在純水和椰子水溶液中的溶解動力學，Spilimbergo等［15］從理論上分析了壓強下CO2的液氣相平衡熱力學、CO2-水相體系的熱力學 （電解質和非電解質模型）、固氣相平衡熱力學，Giovanna Ferrentino等［16］綜述了測量CO2溶解度試驗裝置的設計和CO2在水和復雜溶液中的溶解度。

這些基礎研究數據為研究DPCD殺菌和鈍酶機理以及優化處理工藝參數奠定了重要的理論基礎。CO2在不同食品體系中的溶解度和相平衡參數是設計DPCD殺菌和鈍酶過程的重要依據。因此還需要進一步加強研究DPCD在各種食品體系中的溶解度和相平衡。

1.2高密度 CO2殺滅微生物營養體的效果和模型及其機制

1.2.1高密度CO2殺滅微生物營養體的效果與影響因素一般情況下，DPCD在＜30 MPa和＜60℃的條件下處理2.5～240min，微生物營養體數量可降低1～9-log［17-18］。影響DPCD殺滅微生物營養體效果的因素主要有：CO2物理狀態和濃度、處理溫度和壓強及時間、加壓和卸壓速率、循環加壓、是否攪拌、體系水分含量、微生物類型、起始微生物數量、微生物培養條件和生長階段、DPCD系統類型、與其他殺菌技術聯合等［17-21］。

CO2物理狀態：DPCD包括了液體CO2、亞臨界氣態CO2、超臨界CO2。超臨界CO2既具有液體的密度和溶解度，又具有氣體粘度和擴散性，還具有低的表面張力，能改變細胞壁和細胞膜的組成，使CO2快速擴散和滲透通過細胞壁和細胞膜進入細胞質［3］。因此，超臨界狀態的CO2比其他狀態的CO2更容易殺滅微生物［17-18］。另外，當溶解在體系中的CO2達到飽和時，對微生物的殺滅效果最好，因為濃度決定了CO2在微生物細胞中的滲透性［17-18］。

處理壓強、溫度和時間：壓強和溫度的變化能夠改變CO2的物理狀態。隨著處理壓強增加，CO2的溶解度增加，加強了細胞和CO2之間的接觸，促進CO2滲透到細胞內，從而提高殺滅效果［22-27］。升高溫度會使CO2粘度下降和擴散性增加，有利于其擴散到細胞內，破壞細胞膜的完整性；但是溫度不能過高于臨界點，因為溫度太高，CO2的密度和溶解能力下降很快，降低了CO2從細胞中提取脂溶性物質的能力［26-27］。增加處理時間能增加DPCD對微生物營養體的殺滅效果，主要是因為延長了DPCD與微生物營養體的接觸時間［27］。

加壓和卸壓速率：快速加壓和卸壓可以使CO2在細胞內外快速轉移，萃取細胞內物質，爆破和機械性的破壞細胞結構。快速加壓，進入細胞內的CO2可使細胞迅速膨脹，膨脹到一定程度會發生機械性破裂；接著再快速卸壓，細胞會像氣球一樣發生機械性的破碎［22-24］。循環加壓和卸壓也可以提使細胞膜破裂和通透性增加，加強傳質，從而提高殺菌效果［23-24］。

攪拌：在DPCD處理過程中進行攪拌，可以增加CO2向懸浮液中轉移和溶解速率，增加CO2與微生物營養體的接觸，使CO2更容易滲透細胞膜［26］。

體系水分含量：體系水分含量越高，DPCD對微生物營養體的殺滅效果越好。細胞吸收的水分也能使細胞壁和細胞膜溶脹，使CO2更容易滲透，加強其殺滅效果［27］。

微生物種類：一般來說，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更耐高壓，因為它們的細胞壁組成存在差異。耐壓微生物的細胞壁可以阻擋CO2的滲透或可能承受足夠大的壓強。在相同處理條件下，DPCD對初始微生物數量少的樣品的殺菌效果要好于初始微生物數量多的［25］。

微生物培養體系和生長階段：當微生物營養體在低于最適溫度、低于或高于最適pH下生長時，更容易被DPCD殺滅［17-21］。一般來說，幼體細胞比成熟細胞對DPCD更敏感；穩定期的細胞比對數期的細胞更耐受DPCD［28］。微生物細胞在DPCD處理過程中會受損傷，有些損傷的微生物細胞再進行培養又可以修復再生長，而有些微生物細胞則不可以修復，這主要與DPCD條件和培養介質有關［17-21］。

DPCD處理系統的類型：能快速使CO2在溶液中溶解并達到飽和的處理系統能更加有效殺滅微生物［17-21］。在相同條件下，連續式DPCD處理系統比間歇式DPCD處理系統殺菌更有效，所需時間更短；半連續DPCD處理系統也比間歇式DPCD處理系統殺菌更有效［17-21］。這是因為連續的DPCD處理系統可以使更多的 CO2溶解于溶液中。Kobayashi等使用微泡CO2設備也比傳統的間歇式處理設備提高了殺菌效果［29-33］。

雖然DPCD對微生物營養體具有較好的殺滅效果，但很難達到完全滅菌，一方面是因為影響DPCD殺菌效果的因素較多，另一方面是因為DPCD能夠誘導微生物營養體形成亞致死狀態［34-35］和活的不可培養狀態［36-39］，在合適的條件下這些微生物營養體又可以復蘇生長，從而影響殺菌效果。尤其是微生物營養體的亞致死狀態和活的不可培養狀態，它們容易造成過高估計殺菌率，使得產品在后期貯藏過程中提前發生腐敗變質。因此，應重視DPCD殺菌過程中這兩種狀態的研究，以采取有效措施提高殺菌率。

1.2.2高密度CO2殺滅微生物營養體的模型文獻報道的DPCD微生物營養體的殺滅模型可分為三種類型：（1）線性模型；（2）兩段式模型； （3）三段式模型［40］。對于線性模型，通常采用一級動力學進行擬合。對于兩段式模型，可以將曲線上的兩個階段分別采用一級動力學進行擬合。雖然一級動力學線性模型對兩段式的快速階段擬合度較高，但由于其并不能模擬完整的殺滅動力學曲線，故存在明顯缺陷。當曲線呈現兩段式或三段式模型時，需要采用非線性模型進行擬合。非線性模型主要有Gompertz模型、修正Gompertz模型、修正Multihi模型、Xiong模型、修正Peleg模型等［41］。另外，除了線性模型和非線性模型外，還有學者應用到多項式模型［42］，它是通過確定多個相關參數的值來使曲線或響應面更好地貼近數值。DPCD殺滅微生物營養體模型的類型可能與試驗數據的多少有關。當試驗數據足夠多時，曲線表現出凹的形狀；當試驗數據較少時，其曲線可能表現為兩段式或線性［40］。曲線的形狀還與處理時間和間隔有關［41］。

1.2.3高密度 CO2殺滅微生物營養體的機制從1951年首次報道壓強下CO2可以殺滅微生物開始，不斷有研究者提出關于DPCD對微生物營養體殺滅機制的各種假說。2007年Garcia-Gonzalez等總結了DPCD殺滅微生物營養體機制，主要概括為7個方面［17］：1） 細胞外pH值的降低。壓強下CO2溶解于液體食品或者高水分含量的固體食品中形成H2CO3，電離后生成HCO3-、CO32-、H+，降低了細胞外pH值，抑制微生物營養體生長。2） 細胞膜受損。CO2是非極性溶劑，當CO2與微生物細胞接觸時，CO2會集聚在親脂性（磷脂）內層上，集聚到一定量時會由于脂質流失而造成細胞膜結構和功能的紊亂，增加細胞膜的流動性和滲透性；也有研究者認為HCO3-作用于極性磷脂的頭部基團和細胞膜表面的蛋白，改變了細胞膜的最佳表面電荷密度，從而改變了細胞膜的功能。3）細胞內pH值的降低。由于增加了細胞膜的通透性，壓強下CO2很容易滲透入微生物細胞內，在細胞質里累積到一定量，會產生大量H+，細胞不能及時排出H+，細胞內pH值就會降低。細胞內外pH值的劇烈變化，使其難以維持酸堿平衡，活力嚴重受損。4） pH值降低能鈍化與細胞代謝相關的關鍵酶。5） CO2分子和HCO3-對代謝的直接抑制。HCO3-濃度是調節細胞內酶活性的重要因子。CO2和HCO3-都是細胞內羧基化反應的底物，CO2還是脫羧反應的產物。羧基化反應對糖異生和氨基酸和核酸的生物合成都非常重要。溶解的 CO2可以抑制脫羧反應。6） 細胞內電解質平衡被破壞。CO2進入細胞內，溶解于水中生成的HCO3-和CO32-離子，可能使細胞和細胞膜上的無機離子（如Ca2+、Mg2+等）發生沉淀，而這些離子對于維持細胞與周圍環境的滲透關系是非常重要的，從而對細胞體積產生嚴重的影響。7） 細胞及細胞膜中脂類被萃取。DPCD作為一種非極性溶劑，能夠萃取細胞和細胞膜中的脂質成分，改變生物膜結構和擾亂其平衡。這7種DPCD殺滅微生物營養體的機制一般不會連續發生，也不是單獨發生，而是同時發生在一個非常復雜而又相互關聯的過程中。

這7種DPCD殺滅微生物營養體的機制主要從細胞水平進行分析。雖然它們能夠解釋大部分DPCD殺滅微生物營養體的試驗現象，但是當時這些殺菌機理大多數都僅僅是假說，缺乏相關的試驗證據。自 2007年后，有很多研究者從不同的角度設計試驗來驗證和完善DPCD殺滅微生物營養體的機制。周先漢等證實了DPCD的pH降低酸化殺菌機制［43］。Spilimbergo、Garcia-Gonzalez、Li、Yao、Tamburini、Liu、廖紅梅等通過試驗觀察到了DPCD造成微生物細胞壁和細胞膜損傷、滲透性增加，同時造成細胞內蛋白質、核酸、離子等的泄漏，改變了細胞內外電解質的平衡等［44-50］。Li等證實了DPCD鈍化了與微生物代謝相關的酶類［46］。周先漢和Tamburini等通過試驗觀察到了DPCD萃取出了微生物細胞膜上的脂類成分，從而改變了細胞膜的滲透性［51-52］。

另外，還有研究者從分子水平研究了DPCD對微生物營養體的殺滅機制。DPCD殺菌的分子機制是建立在細胞水平的研究基礎上，主要是DPCD會造成微生物細胞內蛋白質變性與酶失活，影響到參與細胞形成、能量代謝即作為調控因子的蛋白質的合成與表達，從而抑制細胞的代謝活動而致死微生物。Kim等用DPCD在10 MPa和35℃處理鼠傷寒沙門氏菌10min，可溶性蛋白急劇減少，不可溶性蛋白大大增加，認為這是DPCD誘導蛋白質變性造成的［53］。Kim等［54］用DPCD在40℃和10 MPa處理血清型鼠傷寒沙門氏菌30min，部分蛋白質發生差異表達，等電點遷移到 pI7～9區域。饒偉麗等［55］從蛋白質組角度研究發現DPCD在殺滅大腸桿菌過程中可顯著降低菌體堿溶性（pH8.0）蛋白的溶解性，并使其分子量構成發生顯著變化；在 37℃和 10～50 MPa處理大腸桿菌菌體蛋白30min，蛋白二級結構中α螺旋和轉角逐漸向β折疊轉化。廖紅梅等用DPCD處理大腸桿菌，采用SDS-PAGE電泳分析發現胞內蛋白質在處理前后，蛋白質種類未發生變化，但是含量顯著減少，這主要是因為蛋白質流失到胞外；采用Native-PAGE電泳分析發現胞內蛋白質在處理后，蛋白質種類發生了顯著變化，說明一些蛋白質發生了變性；通過蛋白質組學方法分析鑒定了一些參與能量代謝、細胞生存與增殖、細胞結構、DNA復制、膜修復以及作為全局脅迫調節子適應脅迫條件的蛋白質發生了顯著差異表達［56］。王瑩瑩等采用蛋白質組學的方法研究DPCD對大腸桿菌菌體蛋白的影響，雙向電泳分析發現 46個蛋白質有較大差異，經鑒定認為3個蛋白質參與形成細胞骨架，9個蛋白質參與細胞新陳代謝，4個蛋白質與DNA密切相關；DPCD處理還使大腸桿菌細胞內 31 000～20 000 Da蛋白質的α-螺旋含量顯著降低，而且α-螺旋有向β-折疊和無規則卷曲轉變的趨勢；43 000～31 000 Da的蛋白質β-折疊含量顯著增加。這說明DPCD處理誘導了一些細胞內關鍵性蛋白質和酶發生了變性失活，導致細胞死亡［57］。楊揚等采用轉錄組學與蛋白質組學技術、結合生物信息學篩選到了DPCD殺滅大腸桿菌過程中發揮關鍵作用的蛋白質，其中 3個蛋白質可能與大腸桿菌的DPCD耐受性提高有關，還有7個蛋白質在保護細胞抵御DPCD脅迫中發揮重要作用，這些蛋白質主要與細胞結構、細胞代謝、DNA損傷修復、熱應激等密切相關；另外，通過全基因組測序確定大腸桿菌突變菌株有4個基因可能與其 DPCD 抗性相關［58］。總體分析來看，DPCD能誘導微生物細胞內蛋白質發生變性，但是具有選擇性，而并不能使所有蛋白質發生變性。至于DPCD能誘導哪些蛋白質變性，與DPCD處理強度和微生物種類有關。DPCD對與微生物代謝相關酶類的影響，與對與微生物相關的蛋白質影響的結果類似，也具有選擇性，而且也與微生物種類和DPCD處理強度有關［58］。廖紅梅等檢測到大腸桿菌經DPCD處理后大腸桿菌胞內的堿性磷酸酶、亮氨酸芳基酰胺酶、β-半乳糖苷酶活性顯著降低，酸性磷脂酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性降低較少，而對其他酶無顯著影響。廖紅梅等檢測大腸桿菌經 DPCD處理后細胞懸浮液在260nm（核酸特征吸收峰）的吸光度顯著增加，主要是細胞結構被破壞，核酸泄露到細胞外所致［56］。Liao等研究發現大腸桿菌經DPCD處理后，細胞內DNA含量顯著下降，隨著處理強度增加而顯著降低；細胞內大多數雙鏈DNA發生部分解旋，說明其發生了變性，但是DNA并沒有降解，即一級結構不受影響［59］。

廖紅梅等從細胞水平和分子水平上對DPCD殺菌微生物營養體的機制進行總結，歸納為四點［20］：（1） CO2溶于細胞外的水環境中，降低胞外pH值；（2） 溶解的CO2接觸細胞，改變細胞膜組成，使細胞膜受損，導致細胞膜流動性降低、滲透性增大，CO2滲透入細胞內，細胞內物質泄漏到細胞外；（3）進入細胞內的CO2，降低胞內pH值，使胞內部分蛋白質發生變性和鈍化胞內相關酶類，酶活性下降影響蛋白質合成及功能表達；（4） 進入細胞內的CO2使細胞內DNA解鏈變性，從而影響參與細胞組成、能量代謝、生長和增殖以及作為協調因子的蛋白質表達差異，進一步會影響細胞的活性及代謝，如外膜蛋白下調導致膜受損、饑餓誘導的DNA結合蛋白上調導致DNA 變性、壓強應激蛋白保護DNA 不斷裂；DPCD還可能鈍化與 DNA 相關的酶，從而可能影響DNA 的合成和復制。這些不同的過程可能同時發生也可能循序漸進地發生。

1.3高密度CO2對微生物芽孢的殺滅效果和機制

1.3.1高密度CO2對微生物芽孢的殺滅效果和影響因素由于微生物芽孢具有特殊的結構，使其對高溫、紫外線、干燥、電離輻射和很多有毒的化學物質都有很強的抗性［60］。能否殺滅芽孢是衡量各種殺菌手段和保證食品安全的最重要指標。在溫和（20-40℃和＜30MPa）的條件下單獨使用DPCD是很難完全殺滅芽孢的［17，61］。影響DPCD殺滅微生物芽孢的因素與影響DPCD殺滅微生物營養體的因素是一致的，這里不再詳細綜述。如：CO2物理狀態、處理壓強和溫度及時間、處理介質的pH值、水分含量、循環加壓和處理系統等［62］。超臨界狀態的CO2比高壓氣態和液體CO2對芽孢具有更好的殺滅效果；提高處理壓強和溫度以及延長處理時間、循環加壓和卸壓、微泡CO2處理系統等都可以提高殺滅芽孢的效果；低pH值（pH＜4）和高水分含量的介質有利于DPCD殺滅芽孢［62］。

為了提高 DPCD技術對微生物芽孢的殺滅效果，很多研究者嘗試將DPCD與其他技術聯合使用。目前，已經報道的有：DPCD與熱處理聯合、DPCD與低pH值聯合、DPCD與脈沖電場聯合、DPCD與超高壓聯合、DPCD與抗菌劑聯合等技術。一般情況下，采用DPCD和熱處理聯合在5～30MPa和35～95℃處理20～2880min，可使芽孢數量下降0.5～7-log［62］；采用DPCD與低pH值聯合在5～10 MPa、30～70、pH值2.5～4處理30～120min，可使芽孢數量下降 4～8-log［62］；采用 DPCD和抗菌劑聯合在8～30 MPa和35～80℃處理15～240min，可使芽孢數量下降 1～6-log［62］。Watanabe等發現在 30MPa下75～95℃范圍內對嗜熱脂肪地芽孢桿菌芽孢的殺滅效果要顯著好于35～65℃范圍的，30 MPa和95℃處理120min對嗜熱脂肪地芽孢桿菌芽孢的殺滅效果好于熱處理的（95℃/120min）和高壓處理的（95℃ / 30 MPa / 120min）［63-64］。Rao等［65］用DPCD與高溫熱處理相結合在6.5～25 MPa和82、86、91℃處理0～120min，枯草芽孢桿菌芽孢下降了 7-log。Spilimbergo等［66］用脈沖電場（20 pulses / 25 kV/cm）和SC-CO2（20 MPa / 40℃）處理24h 對蠟樣芽胞桿菌芽孢具有較好的殺滅效果，經脈沖電場處理的芽孢結構被壓縮，容易受到SC-CO2的破壞。近年來，利用DPCD與抗菌劑聯合殺滅微生物芽孢的研究比較多，用到的抗菌劑主要有過氧化氫、叔丁基過氧化氫、乙醇、醋酸、過氧乙酸、辛酸、甲酸、植物精油等。這些抗菌劑很多是用于環境消毒的，而不能用于食品殺菌。Zhang等［67］利用 DPCD（40～80℃/10.3～27.5 MPa）與200×10-6H2O2聯合處理短小芽胞桿菌芽孢，具有非常好殺滅效果，60℃和27.5 MPa處理4h，芽孢數量下降了6.28-log，而將H2O2換成添加70%的乙醇，沒有明顯殺滅芽孢的作用。Park等在100 mL DPCD處理設備中加入2～10 mL的乙醇在10 MPa和60℃處理60～90min，蠟樣芽胞桿菌生物膜中的芽孢被完全殺滅，而單獨用DPCD處理120min對其沒有殺滅效果［68］。Park等用乙醇作為共溶劑在10 MPa和40℃處理45min，含有107CFU/ml的草酸青霉菌芽孢被完全殺滅［69］。Casas等用0.02%牛至（oregano）精油與DPCD聯合在10 MPa和80℃處理紅辣椒30min，包括芽孢在內的所有微生物殺滅 99.5%［70］。Setlow等利用DPCD與過氧乙酸聯合作用對枯草芽孢桿菌芽孢具有很好的殺滅效果［71］。

1.3.2高密度CO2殺滅微生物芽孢的機制微生物營養體和微生物芽孢的結構具有很大的差異，因此，DPCD對它們的殺滅機制是不同的。有研究者基于 DPCD殺滅微生物芽孢的動力學，提出了DPCD殺滅微生物芽孢的可能機制：芽孢首先被DPCD激活和萌發，而后被DPCD殺滅［63，72-75］。然而，不清楚DPCD是如何誘導芽孢激活和萌發的。還有研究者通過觀察DPCD處理前后芽孢的微觀形態結構，提出了另外一個DPCD殺滅微生物芽孢的可能機制：DPCD處理使芽孢結構被破壞而致死［61，66-67，76-78］。Rao等［62］對現有的DPCD殺滅微生物芽孢的機制進行總結，見圖1（稍有修改）。

1.4高密度CO2鈍酶效果和動力學及其機制

1.4.1高密度CO2鈍酶效果及其影響因素DPCD能鈍化大多數使食品品質劣變的酶類，其主要有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果膠甲酯酶、多酚氧化酶、果膠酶、脂肪氧合酶、過氧化物酶等。一般情況下，DPCD在＜ 30 MPa和＜ 60℃的條件下處理 10～60min，可使各種酶的殘留活性降低至20%左右，有的甚至可以100%被鈍化［79-80］。影響DPCD鈍酶的因素主要有：CO2物理狀態、處理壓強和溫度及時間、處理介質及其初始pH值、食品成分、聯合處理方式，循環加壓和卸壓、DPCD處理設備類型等［79-80］。一般來說，超臨界狀態的CO2比氣態和液態CO2對酶具有更好的鈍化效果，主要是因為超臨界CO2同時具有液體和氣體的特殊性質能增強與酶分子的相互作用，導致酶失活［79-80］。隨著DPCD處理壓強和溫度的升高，主要改變了CO2的物理狀態和密度，從而使酶失活［81-89］。延長處理時間，增加了酶與DPCD的接觸時間，從而增加鈍酶效果［81-89］。酶對酸性環境比對堿性環境更為敏感。DPCD處理會降低介質的pH值，這可能是導致酶失活的原因之一。食品中的成分如糖、鹽等能保護酶，可能會降低DPCD對酶的鈍化效果。水分活度對DPCD鈍酶效果也有顯著影響，水分含量高，有利于CO2溶解形成碳酸，降低介質的pH值，從而鈍化酶類。采用微泡處理也可以提高鈍酶效果［82-83］。對于一些耐受DPCD的酶類，可以采用聯合處理的方式，例如DPCD與超高壓聯合、DPCD與脈沖電場聯合、DPCD與超聲波聯合等。另外，循環進行升壓/卸壓處理也可以提高對酶的鈍化效果。這些影響因素的作用原理與之前對殺菌影響有類似之處，這里不再詳述。

圖1　DPCD殺滅芽孢的可能機制［62］Fig.1　Possible mechanism of inactivation spores by DPCD

1.4.2高密度CO2鈍酶動力學動力學參數是描述鈍化速率常數與壓強和溫度改變的關系，是設計和優化加工食品的參考依據。對現有的文獻進行分析可知，DPCD鈍酶動力學可分為3類［79-80］：一是一級動力學，二是分段式動力學，三是部分轉化式動力學。一般情況下，先用一級動力學模型擬合DPCD鈍酶動力學。在一級動力學模型中，酶活是隨時間線性降低的。對于不符合一級動力學模型的數據可以進一步利用分段式動力學模型進行擬合，該模型將DPCD鈍酶過程分為兩個階段（快速鈍化期和穩定鈍化期），兩個階段也分別符合一級動力學模型。還有一種部分轉化式動力學模型。該動力學模型主要考慮到在溫熱和高壓處理中，只有不穩定部分酶被鈍化，隨著處理時間延長，穩定部分的酶活性依然不變；采用更劇烈的溫度或者壓強條件可導致酶快速失活，之后失活速度下降。該模型可用于分析等溫-等壓鈍化數據。部分轉化式模型通常用于一種組分被鈍化而另一組分保持非零值的常數。

1.4.3高密度 CO2鈍酶機制在超高壓鈍酶研究中，有研究者認為200 MPa以下的壓強對酶活性無直接影響，而DPCD處理壓強一般小于50 MPa，這說明超高壓和DPCD的鈍酶機制可能存在本質性的差異。關于DPCD鈍酶機制，HU等［80］提出了兩種可能機制：第一，DPCD引起的pH值降低效應。因為 CO2溶于水能形成碳酸，并進一步解離出HCO3-、CO32-、H+，從而降低處理介質的pH值。升高壓強和溫度會增加CO2的溶解度，促進處理介質的酸化，加強CO2與酶分子的相互作用。有些酶對介質pH值的變化比較敏感，因此介質pH值降低可能是DPCD鈍化該類酶的主要機制之一；但是，有些酶對介質pH值的變化不敏感，因此DPCD鈍酶可能存在另外的機制。第二，CO2的分子效應。CO2與酶分子能形成復合物，降低酶活。精氨酸在低pH值下與CO2接觸，可形成重碳酸鹽復合物，過量的CO2還能與蛋白質表面的氨基酸殘基形成共價的氨基甲酸鹽。這些氨基甲酸鹽可引起組氨酸和賴氨酸殘基之間的電荷轉移，從而造成酶失活。因此，有學者提出堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸和組氨酸）可能是 CO2與酶蛋白質的結合位點［90-94］。還有研究認為，一些酶能被CO2解離，DPCD的壓強效應引起蛋白質主鏈結構變化、亞基解聚，導致失活［95-96］。CO2還能與酶活性中心的疏水區相互作用導致酶失活。隨著壓強升高，CO2密度增加，CO2發揮其疏水的功能改變了蛋白質與分子相互作用的平衡，使蛋白質疏水基團暴露于親水環境中［96-97］。CO2的表面張力為零，可以輕松穿過比其大的分子，破壞酶分子的活性中心。壓強下CO2還具有萃取作用，除去維持酶分子結構穩定的必要水分子，改變溶劑和酶分子之間水平衡，導致酶失活［98-99］。DPCD鈍酶很難說是某一種效應引起的，可能是CO2的多種作用共同引起的。目前關于DPCD鈍酶機制還有很多爭論，有些還缺乏試驗證據，還有待于進一步深入研究和討論。

2　高密度CO2技術在食品加工中的應用

DPCD已被確認為是一種非常有效的非熱殺菌和鈍酶技術，已在液體食品（果汁、啤酒、牛奶等）和固體食品（鮮切果蔬、肉制品、海產品等）加工領域有著廣泛的應用研究，也有開展DPCD在其他領域（例如制備納米材料、醫療滅菌、廢水處理等）中的應用研究。

2.1高密度CO2在液體食品加工中的應用

傳統的果蔬汁加工中采用熱殺菌和鈍酶，但是果蔬汁含有很多對熱敏感的營養物質（如維生素、色素等），熱處理不僅使熱敏性營養物質喪失，而且會嚴重影響其感官品質等理化特性。國內外已有大量的研究表明：DPCD對果汁的殺菌和鈍酶效果是比較好的；與未處理的新鮮果汁相比，DPCD處理的果汁除了維生素C會稍有損失之外，其感官品質和營養品質等理化特性無顯著變化；但與熱處理相比，DPCD對果汁感官品質和營養品質等理化特性的影響是比較小的。QULE等［100］用 DPCD在25 MPa和40℃處理鮮榨橙汁（pH3.7）90min后，在4℃下貯藏 56 d，未發現有微生物的生長，而且橙汁的感官和理化特性與鮮榨果汁無顯著差異，僅僅維生素 C損失 12%，而熱殺菌損失 46%。LIAO等［101］用DPCD在45 MPa和52℃處理蘋果汁30min，大腸桿菌數量下降了7.66-log。Ferrentino等［102］用DPCD在16 MPa和60℃處理蘋果汁40min，其菌落總數下降了5-log，而在4℃下貯藏14 d，pH值、糖度和色澤等品質與鮮榨果汁無顯著差異。NIU等［103］用DPCD在20 MPa和20～65℃處理蘋果汁20min，多酚氧化酶被完全鈍化，果膠甲酯酶被鈍化61.4%，在4℃下貯藏7 d，色澤、濁度等品質無顯著變化。Bae等［78］用DPCD在10 MPa和65℃處理蘋果汁40min或在8 MPa和70℃處理蘋果汁30min，Alicyclobacillus acidoterrestris芽孢被完全殺滅，但是對果汁的pH和糖度等品質沒有影響。廖紅梅等［104-105］用DPCD在30 MPa和40℃處理梨汁60min，細菌菌落總數的殘存率降低了2.66-log，殘存酶活為19%，且在4℃條件下貯藏56 d也能較好抑制多酚氧化酶 酶活和保持其品質特性。周林燕等［106］用 DPCD在 30 MPa和 55℃處理桃汁 10～40min，與未處理的相比，桃汁的pH值、糖度和酚類物質含量無顯著變化，色澤稍有變暗，抗氧化活性提高。LIU等［107-109］用DPCD在30 MPa和50℃處理西瓜汁30min，可使多酚氧化酶殘留酶活降至4.2%，過氧化物酶殘存酶活降至40%左右；菌落總數降低至26 CFU/mL，達到了GB19297-2003《果蔬汁飲料衛生標準》的要求（≤100 CFU/mL）；番茄紅素含量略有下降，總酚含量無顯著變化，而對風味成分的影響較小；在4℃貯藏30 d，對西瓜汁的風味影響較小。CHEN等［110-111］用DPCD在35 MPa和55℃處理哈密瓜汁60min，微生物全部被殺滅；多酚氧化酶、過氧化物酶和脂肪氧合酶的殘留酶活分別降至25.26%、38.46%和0.02%；對哈密瓜汁的香氣影響較小；在4℃貯藏28 d，風味仍然與新鮮的哈密瓜汁接近，但是維生素C有所損失，但是損失的量小于未處理的。Cappelletti和De等［112-113］用DPCD在12MPa和40℃處理椰子水30min，菌落總數下降了7-log，但降低了揮發成分含量，其他感官品質則與未處理的無顯著差異，顯著好于熱處理的（90℃ 1min）。

啤酒在熱殺菌過程中容易產生不良風味。Dagan等［114］采用連續的DPCD處理系統（27.6 MPa / 21℃ / 5%CO2/ 5min）對啤酒進行處理，結果發現啤酒的風味、泡沫及其穩定性、殺菌效果都顯著好于熱處理的（74℃ 30 s）。因此，采用DPCD對啤酒進行冷殺菌既能保證啤酒的新鮮，又不改變啤酒顏色和風味，避免了不良風味的產生。

DPCD還可有效地殺滅牛奶中的致病菌和腐敗菌。Erkmen等［115］用100 bar / 30℃處理牛乳360min，大腸桿菌下降了94.7%，同樣的條件處理脫脂乳，其大腸桿菌下降了99.36%。廖紅梅等［116］在20 MPa / 37℃下用DPCD處理牛初乳30min，較好地實現了殺菌，牛初乳色澤變亮，但是粒度增大，粘度和pH值降低，對其懸浮穩定性和口感造成一定影響。鐘葵等［117］在30 MPa /50℃處理牛奶70min，牛奶中菌落總數降低了5.082個數量級，實現了較好的殺菌效果。姚春艷等［118］研究發現，DPCD對牛乳中微生物具有較好的殺滅效果；DPCD能鈍化牛乳中的蛋白酶，抑制蛋白質在貯藏過程中的分解，短時加壓的抑制效果好，但溫度對抑制效果影響較小；但DPCD處理可能使脂肪酶活性增加，導致原料乳脂肪在貯藏過程中的分解程度變大。

2.2高密度CO2在固體食品加工中的應用

與液體食品相比，DPCD技術要應用到固體食品加工中要困難一些。主要是因為固體食品不能連續加工，CO2在固體食品中溶解和擴散較慢（尤其是含水量少的），還可能對質構和品質產生不良影響。目前，DPCD技術應用的固體食品主要有鮮切果蔬、肉與肉制品、海洋食品等。

鮮切果蔬是一種受快節奏生活的城市人歡迎的方便食品，就是去除水果蔬菜的不可食部分，經清洗、修整、切割等后，進行簡單包裝，供消費者、餐飲業立即食用或使用，具有新鮮、方便、可百分百食用的特點。但是如何保證鮮切果蔬在加工和貯藏過程中的食用安全，保持產品品質和延長貨架期？近年來，很多研究者逐步將DPCD技術應用到鮮切果蔬加工中。Ferrentino等［119］以DPCD對接種在鮮切胡蘿卜片上的大腸桿菌的殺滅效果為基礎，建立了一個Weibull模型用于預測DPCD對鮮切胡蘿卜片的殺菌效果。Spilimbergo等［120］在12 MPa和40℃下用DPCD處理胡蘿卜片15min，有效地殺滅了胡蘿卜片中存在的微生物，在4℃可貯藏28 d，活性成分變化較小，但是質構發生顯著變化。BI等［121］在5 MPa和20℃下用DPCD處理胡蘿卜片20min，細菌總數下降了1.86-log，酵母和霉菌下降了 1.25-log，過氧化物酶、多酚氧化酶、果膠甲酯酶的殘留活性在處理 15min時達到最低，雖然DPCD對胡蘿卜的硬度（損失僅7.9%）影響較小，但會造成細胞膜損傷。Ferrentino等［122］在12 MPa和45℃下DPCD處理鮮切椰肉15min，微生物數量下降了4-log，椰肉的硬度雖然不受影響，但是其微觀結構遭到了破壞。Valverde等［123］研究發現，雖然DPCD能抑制梨片中酵母活性，并對pH值和糖度無影響，但是使梨片軟化和表面發黑。因此，Valverde認為DPCD可能適用于對硬度較低的果蔬進行低溫殺菌處理。張華等［124-126］用18 MPa和30℃的DPCD處理鮮切蓮藕片30min，實現了對鮮切蓮藕片的有效殺菌，鈍化多酚氧化酶和過氧化物酶等酶活性，并能較好的保護了鮮切蓮藕片的色澤和品質。以上文獻研究表明：DPCD雖然對鮮切果蔬具有良好的殺菌和鈍酶效果，但對質構會產生一定影響。因此，DPCD應用于鮮切果蔬加工，還需要深入開展適合的果蔬產品、優化操作參數、合理評價品質等方面研究。

肉制品和海產品是人類食物蛋白質的重要來源，食用前的殺菌處理一直是加工處理的重要環節。有研究表明，DPCD 能夠殺滅肉制品和海產品中的致病菌和腐敗菌。關于DPCD對肉制品殺菌的研究主要涉及的材料有豬肉［127-130］、雞肉［131-132］和牛肉［133-135］等，殺菌對象主要是致病菌。關于DPCD對海產品殺菌的研究主要涉及的材料有對蝦［136-137］和牡蠣［138-139］等，殺菌對象主要是腐敗菌和致病菌等。筆者曾對該部分的內容做過綜述［140］，這里不再詳述。與液體食品相比，DPCD 對肉制品和海產品的殺菌處理強度要大，主要是因為CO2在固體食品中不易滲透。雖然DPCD對肉制品和海產品具有較好的殺菌效果，但是不可避免對其品質會產生一些影響，例如降低其pH值、持水力下降造成汁液損失、使紅色肉類呈現煮熟的外觀等等。但是相對于熱處理來講，DPCD對肉制品和海產品的品質影響要小很多。另外，利用DPCD能誘導蛋白質變性的特點，還可將其用于改善蛋白質的功能特性［141］和制備凝膠制品［142-144］，例如肉丸、肉腸等。

3　高密度CO2技術尚待解決的問題

一項新的技術要應用于食品工業化生產，不僅要保障食品安全，還要保障食品品質，并使其具有一定的貨架期，同時還要考慮生產的經濟性。雖然目前已經有大量的文獻研究表明DPCD具有很好的殺菌和鈍酶效果，在食品保鮮和加工中具有巨大的應用潛力，但是目前尚有許多問題有待解決：1）DPCD對于不同微生物的殺滅效果有差異，不能達到完全滅菌的效果，尤其是對芽孢的殺滅效果較差。雖然很多研究者已經闡述了DPCD的殺菌機制，解釋了部分實驗現象，但是如何提高DPCD的殺菌效果，還需要進一步闡明DPCD的殺菌靶點；另外要重視DPCD處理后微生物亞致死和不可培養狀態的研究，闡明其機制，以期提供合理措施提高殺菌效果。2） DPCD對不同酶的鈍化效果也存在差異，對有的酶（如多酚氧化酶）可以完全鈍化，有的酶（如果膠甲酯酶）則不能完全鈍化，對有的酶（如脂肪酶）甚至有激活的作用。研究者也提出了DPCD鈍酶的一些機制，但是DPCD對鈍酶的選擇性機制還不清楚，尚待深入研究，為DPCD在不同領域中的應用提供參考。3）DPCD與不同類型食品之間相平衡的研究還非常缺乏，需要特別加強深入研究，以期準確預測CO2在不同食品中的溶解度以及處理的工藝參數（壓強、溫度和處理時間等）。4）目前關于DPCD研究的重點在殺菌和鈍酶方面，而對于處理前后產品的品質變化、產品包裝方式、貯藏方式、貯藏過程的品質變化與貨架期等的研究還相對較少，這是作為技術應用和產品開發必須的一個環節，需要加強研究。5） 通過積累大量的基礎研究，選擇適合于DPCD處理的食品；6）對于不同類型的食品（如液體食品和固體食品），可能需要的DPCD設備有所差異，因此需要針對食品類型研發專用的DPCD研究和工業化生產設備，并研發設備清洗和消毒技術；7）合理評估DPCD技術的經濟性等。相信隨著科學研究的深入和發展，這些問題都將逐步得到解決，逐步推廣DPCD加工技術在為食品加工業領域中的應用。

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（責任編輯：陳莊）

Review on Inactivation of Microorganisms and Enzyme by Dense Phase Carbon Dioxide and the Application

LIU Shu-cheng，GUO Ming-hui，LIU Yuan，LIU Meng-na，DENG Qian-lin
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University//Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety//Guangdong Provincial Seafood Engineering Technology Research Center//Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，Zhanjiang 524088，China）

Dense phase carbon dioxide（DPCD）is one of the very promising food non-thermal processing technologies，which was mainly used to inactivate microorganism and enzyme in food.The paper reviews the progress of last decade made in the basic research and application research of DPCD technology at home and abroad.The basic research fields of DPCD technology include phase equilibrium between DPCD and food system，effect and mechanism of inactivation microbial vegetative and spore by DPCD，effect and mechanism of inactivation enzyme by DPCD.The application research fields of DPCD technology include liquid food（fruit and vegetable juice，beer，milk）and solid food （fresh cut fruit and vegetable，meat，seafood） processing.Finally，some problems to be solved are discussed on the development of DPCD technology in future.The reviews will provide the reference for the research and application of DPCD in food processing.

Dense phase carbon dioxide；Inactivation microorganisms；Inactivation enzyme；Liquid food；Solid food

TS254.4

A

1673-9159（2016）04-0101-16

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.017

2016-04-15

國家自然科學基金（31371801）；廣東省科技計劃項目（2015A020209158）；現代農業產業技術體系專項基金（CARS-47）

劉書成（1977－），男，教授，研究方向為水產品非熱加工技術基礎理論與應用。Email：Lsc771017@163.com