水貂出血性肺炎滅活疫苗（B型）生產工藝的建立

楊朋欣 丁國杰 劉可姝 張春媛 王彬/哈藥集團生物疫苗有限公司

水貂出血性肺炎滅活疫苗（B型）生產工藝的建立

楊朋欣 丁國杰 劉可姝 張春媛 王彬/哈藥集團生物疫苗有限公司

水貂出血性肺炎是由綠膿桿菌（又稱銅綠假單胞菌，Pseudomonas aeruginosa）感染引起的一種高度致死性傳染病，多發于每年9至11月份，該菌可通過患病水貂形成的飛沫及氣溶膠傳播。發病急、死亡快，所以又稱銅綠假單胞菌肺炎，以呼吸困難、口鼻出血、突發性死亡為主要特征，死后典型癥狀為口鼻流出血樣泡沫，剖檢肺臟呈彌漫性出血。

一般對該病的控制采取抗生素治療，但該方法易產生耐藥性，因此疫苗的制備是控制該病較好的手段，本研究對B型綠膿桿菌疫苗制備生產工藝進行優化，獲得安全、免疫效力良好的滅活產品，為水貂多價疫苗和聯苗產品的制備提供理論依據。

一、材料

1.菌株。水貂綠膿桿菌血清B型SD004株由哈藥集團生物疫苗有限公司研發中心保存。

2.主要試劑及儀器。甲醛溶液和NaCl均購自國藥集團；LB和TSB均購自OXOID；發酵罐購自福州福爾流體設備有限公司。

二、方法

（一）一級種子的繁殖

還原綠膿桿菌B型SD004株凍干菌種，劃線接種含5%牛血清肉湯瓊脂平板，37℃培養過夜，挑取單個典型菌落，接種5.0 ml含5%牛血清肉湯培養基，37℃，180 r/min，培養16 h，經純檢合格后，作為一級種子。

（二）二級種子的繁殖

將檢驗合格的一級種子按培養基總量的1%接種含5%牛血清肉湯培養基，37℃ 180 r/min，培養16 h，經純粹檢驗合格后，作為二級種子。

（三）發酵培養時間優化

將各生產用菌種按培養液總量的1%接種TSB，生物發酵罐進行培養，37℃通氣培養24 h，自第6 h開始，每2 h收獲菌液，按此工藝平行3次，其攪拌速度為180 r/min，取樣并進行活菌計數，取三次試驗結果的平均值，分別繪制該菌各血清型的生長曲線。

（四）滅活工藝優化

將制備好的水貂綠膿桿菌濃縮菌液分為成5組，分別加入終濃度為0.1%、0.2%、0.3%和0.4%的甲醛溶液，同時設未滅活對照，37℃滅活24 h，60 r/h，分別于第12、14、16、18、20、22和24小時取樣進行滅活檢驗。

（五）安全性試驗

按照優化后的生產工藝制備疫苗分別進行對非靶動物安全性試驗，對靶動物單劑量和超劑量安全性試驗。

1.對非靶動物的安全性試驗。疫苗腹腔接種5只18～20 g小鼠，0.3 ml/只，另5只作為對照，接種后觀察14日，記錄小鼠局部及全身反應情況。

2.靶動物單劑量和超劑量免疫安全性試驗。選取15只2月齡水貂，隨機分為3組，5只/組，分別進行免疫，單劑量組1.0 ml/只，超劑量組2.0 ml/只，另5只為對照。免疫后觀察14日，記錄水貂局部及全身反應情況。

（六）效力試驗

1.對水貂的效力試驗。取2～5月齡健康易感水貂10只，隨機分為2組，每組5只。第1組水貂皮下注射疫苗1.0 ml/只；第2組水貂不免疫作為對照。免后21日，兩組水貂分別滴鼻接種10LD50的SD004株菌液0.2 ml，攻毒后觀察7日。對照組水貂應全部死亡，免疫 組水貂應至少保護4只。

2.對小鼠的效力試驗。取體重18～20 g清潔級昆明小鼠20只，隨機分為 2組，每組10只。第1組小鼠各腹腔注射疫苗0.3 ml；第2組小鼠不免疫作為對照。免后21日，兩組小鼠分別滴鼻接種10LD50的SD004株菌液0.1ml，攻毒后觀察7日。對照組小鼠應全部死亡，免疫組小鼠應至少保護8只。

三、結果

（一）發酵罐培養時間優化結果

培養B型菌液，以活菌計數對數為縱坐標繪制的生長曲線結果如圖1所示，在相同條件下，菌株在14～16 h培養范圍內細菌存活數為高峰，考慮實際操作最佳培養時間為16 h。

（二）滅活工藝優化結果

通過對滅活工藝進行優化，根據最終制備疫苗的甲醛含量，同時結合選擇甲醛濃度的滅活效果，結果如表1所示，37℃條件下，選擇按菌液總量的0.3%加入甲醛溶液，滅活24 h最為適合，能夠保證滅活效果。

表1　 37℃不同甲醛濃度下水貂綠膿桿菌的滅活效果

四、疫苗的安全性試驗結果

（一）疫苗對非靶動物的安全試驗結果

疫苗對小鼠的安全性試驗結果見表5，在觀察期內小鼠全部健活，臨床表現正常、免疫局部和全身無不良反應。

（二）最小使用日齡靶動物單劑量免疫的安全試驗結果

疫苗對最小使用日齡靶動物單劑量免疫安全性試驗結果見表3，單劑量接種2月齡水貂后，在觀察期內水貂全部健活，臨床表現均正常、注射局部和全身無不良反應，全部存活。

（三）靶動物一次超劑量免疫安全性試驗結果

疫苗對靶動物一次超劑量免疫安全性試驗結果見表4。超劑量接種2月齡水貂后，在觀察期內水貂全部健活，臨床表現正常、免疫局部和全身無不良反應，全部存活。

（四）疫苗的效力試驗結果

1.對水貂的效力試驗結果。B型滅活疫苗免后21日攻毒，疫苗免疫組水貂保護率為5/5，對照組水貂全部死亡（表5）。

2.對小鼠的效力試驗結果。免后21日攻毒，三批疫苗免疫組小鼠保護率為9/10，對照組小鼠全部死亡（表6）。

表2　 對小鼠的安全性試驗臨床觀察結果

表3　 對水貂最小使用日齡單劑量免疫安全性試驗臨床觀察結果

表4　 靶動物一次超劑量免疫安全性試驗臨床觀察結果

表5　 對水貂的免疫效力試驗結果

表6　 對小鼠的免疫效力試驗結果

五、討論

中國于上世紀80年代初首次報道了水貂出血性肺炎病例，此后相繼有該病報道，調查發現中國各地水貂出血性肺炎B型菌株流行情況為8%～50%不等，由于各血清型之間無交叉保護，制備的單苗具有針對性。因此，研制一種防治水貂出血性肺炎的安全性好、保護效力高的滅活疫苗具有重要的現實意義，本試驗通過對制苗工藝的優化獲得安全免疫效力較好的疫苗，在滅活時間上22 h也可以，但考慮到生產風險等因素，選擇更為穩定的24 h。

（略）