山藥黏液質及其酶解物的微觀結構及免疫活性

任國艷，吳婷婷，張 凡，郭金英，崔國庭，吳 影，王 萍，曹 利（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003）

山藥黏液質及其酶解物的微觀結構及免疫活性

任國艷，吳婷婷，張 凡，郭金英，崔國庭，吳 影，王 萍，曹 利
（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003）

從鐵棍山藥中提取黏液質，選取不同酶（胰蛋白酶、纖維素酶、復合蛋白酶）對其進行酶解，得到不同酶解產物，采用紅外光譜和掃描電子顯微鏡技術，對黏液質及其酶解物的微觀結構進行分析，同時采用體外細胞培養和實時熒光定量聚合酶鏈式反應方法，研究黏液質及其酶解物對脾淋巴細胞增殖轉化及細胞因子mRNA相對表達量的影響。結果顯示：黏液質及其酶解物，在微觀結構上呈現很大差別；黏液質及其酶解物均能促進脾淋巴細胞增殖轉化，但酶解物的促進作 用強于黏液質；黏液質及其酶解物對Th1族細胞因子的mRNA表達促進作用顯著高于對Th2族細胞因子的mRNA表達促進作用，使細胞中Th1/Th2平衡向Th1方向偏移。

山藥黏液質；酶解物；淋巴細胞轉化；細胞因子；mRNA表達

山藥（Dioscorea opposita）是一種醫食同源的植物，具有較高的營養價值、藥用價值和經濟價值，而鐵棍山藥更是被認為山藥中的極品[1]。山藥中含有多種營養成分，其中黏液質被認為是山藥的主要有效成分，是糖和蛋白質復合的大分子物質，對山藥加工性能和藥理作用產生很大的影響[2]。現代研究發現山藥黏液質具有多種生物活性，能夠清除機體內的自由基，具有抗氧化能力[3]；能夠抑制血管緊張肽轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的活性，具有降血壓的作用[4]；能夠抑制腫瘤細胞的增長[5]和增強機體免疫力[6]等活性。因此，黏液質的功能活性已引起越來越多的關注。

山藥黏液質的理化性質及生物活性與其化學組成、分子鏈構象等因素密切相關，有人用不同的酶酶解山藥黏液質，發現其理化性質（如黏度）和生物活性均會發生相應的變化[7]，但對酶解后黏液質微觀結構發生的變化研究較少；故本實驗從鐵棍山藥中提取黏液質，用3 種酶對山藥黏液質進行酶解，得到不同酶解產物，并對酶解產物的微觀結構進行分析比較，然后通過體外細胞培養實驗，研究山藥黏液質及其酶解產物對T淋巴細胞增殖轉化及細胞因子mRNA表達水平的影響，為山藥黏液質的開發應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵棍山藥（新鮮，未做任何處理），2015年6月10日購于洛陽盛德美超市。

胰蛋白酶（250 U/mg）、纖維素酶（400 U/mg）、復合蛋白酶（100 U/mg） 上海瑞永生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LG-0.2真空冷凍干燥機 沈陽新陽速凍設備制造公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；Gel DocXR+凝膠成像儀 美國伯樂公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；Vertex 70/80傅里葉交換紅外光譜儀 布魯克（北京）科技有限公司；JSM-5610LV掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 山藥黏液質的制備

新鮮鐵棍山藥→清洗、去皮→組織搗碎機進行破碎→加入10 倍體積0.5 mol/L氯化鈉溶液浸提→過濾、離心→濃縮→乙醇分級沉淀→透析→低溫冷凍干燥→山藥黏液質

乙醇分級沉淀，將無水乙醇緩慢加入濃縮液中，使其乙醇體積分數分別達到30%、50%、75%，收集乙醇體積分數為75%時溶液中的沉淀，進行后續處理。

1.3.2 山藥黏液質基本組成測定

總糖含量測定采用苯酚-硫酸法；蛋白質含量測定采用凱氏定氮法；氨基酸組成測定采用氨基酸分析儀[8]；單糖組成分析測定采用氣相色譜法[9]。

1.3.3 山藥黏液質酶解物的制備

1.3.3.1 復合蛋白酶酶解物的制備

[10]，稍加改動。復合蛋白酶酶解山藥黏液質的酶解條件為酶解溫度45 ℃、酶解時間2 h、加酶量25 mg/g、pH 7.0，水解度為52.36%，酶解后將酶解液煮沸5 min，2 000 r/min離心10 min，旋轉蒸發濃縮上清液后冷凍干燥，即得山藥黏液復合酶酶解物。

1.3.3.2 纖維素酶酶解物的制備

參考文獻[11]，稍加改動。纖維素酶酶解山藥黏液質的酶解條件為酶解溫度50 ℃、加酶量15 mg/g、酶解時間3 h、pH 5.0，還原糖含量最高為30.49%，酶解后將酶解液煮沸5 min，2 000 r/min離心10 min，旋轉蒸發濃縮上清液后冷凍干燥，即得山藥黏液質纖維素酶酶解物。

1.3.3.3 胰蛋白酶酶解物的制備

參考文獻[12]，稍加改動。胰蛋白酶酶解山藥黏液質的酶解條件 為pH 7.5、酶解時間4 h、溫度45 ℃、加酶量20 mg/g，水解度為48.79%，酶解后將酶解液煮沸5 min，2 000 r/min離心10 min，旋轉蒸發濃縮上清液后冷凍干燥，即得山藥黏液質胰蛋白酶酶解物。

1.3.4 山藥黏液質及其酶解物電泳圖譜

參考文獻[13]方法電泳，稍有改動。配制電泳試劑→制備5%濃縮膠、12%分離膠、電泳緩沖液→樣品變性處理→點樣→恒壓電泳→考馬斯亮藍染色→脫色→圖像分析。

1.3.5 山藥黏液質及其酶解物紅外圖譜

將干燥的樣品與KBr壓制成片（待測樣品粉末與KBr粉末質量比為1∶100），用Nicolet-Nexus470傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm－1波數范圍內進行掃描。

1.3.6 山藥黏液質及其酶解物紫外掃描圖譜

參考文獻[14]的方法，取5 mg待測樣品溶于3 mL蒸餾水中，分成2 等份，其中一份加入1.5 mL蒸餾水，另一份加入1.5 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，測反應開始和結束（2.0 h）時的紫外光譜。

1.3.7 山藥黏液質及其酶解物掃描電子顯微鏡圖譜

用導電膠帶將山藥黏液質及其凍干粉末固定在樣品臺上，用JFC-1600型離子濺射儀在高真空鍍膜機內給樣品表面濺射噴金，用JSM-5610LV掃描電子顯微鏡觀察樣品的微觀結構并照相。

1.3.8 山藥黏液質及其酶解物對T淋巴細胞轉化的影響

參考文獻[15]方法稍有改動，將無菌獲得的活的脾臟淋巴細胞濃度，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液調整細胞濃度為5×106個/mL，加入96 孔細胞培養板，每孔加入細胞懸液100 μL，加入10 μg/mL的ConA溶液20 μL，設置空白對照組（在細胞培養液里只加ConA）和實驗組（分別加入不同體積的山藥黏液質及其酶解物，使其濃度達到實驗要求），在37 ℃、5% CO2條件下在CO2培養箱中培養48 h后，采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）法，用酶標儀測其在570 nm波長處的吸光度，每組設置6 個重復孔。

1.3.9 山藥黏液質及其酶解物對T淋巴細胞因子mRNA表達水平的影響

選取1.3.7節中效果最好的組分，向淋巴細胞中加入l mLRNAiso Plus，按試劑盒說明書提取脾臟淋巴細胞中的總RNA，然后將RNA逆轉錄為cDNA（按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說明書操作）；再通過熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法，定量檢測細胞因子mRNA相對表達量（按照SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書進行操作）。實驗所需引物，由寶生物工程（大連）有限公司設計合成，其引物序列見表1。

表1 細胞因子引物序列Table 1 Primer sequences for cytokines

1.4 統計學處理

應用SPSS 19.0軟件對所有數據進行統計學處理，結果以±s表示，兩組間均數比較用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 山藥黏液質的基本組成

山藥黏液質中總糖含量占40.87%，蛋白質含量約占56.93%。氨基酸組成如表2所示，其中谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸含量較高；檢測到7 種人體必需氨基酸，含量占總氨基酸含量的39.543%。鐵棍山藥黏液中檢測到9 種單糖（表3），其中氨基葡萄糖和甘露糖含量較高，占總糖含量的66.422%。這一檢測結果與之前報道的結果不同，Koocheki等[16]研究山藥（Nagaimo）的黏液質發現，其單糖主要由甘露糖、果糖、半乳糖、木糖、葡萄糖組成；Huang等[17]報道山藥黏液中主要含有半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和鼠李糖等中性糖；而丁青芝等[18]報道，山藥黏液質中含有L-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖，其中D-葡萄糖含量最高。這可能是不同來源的山藥黏液質中單糖含量和種類有很大區別。

表2 鐵棍山藥黏液質的氨基酸含量Table 2 Contents of amino acids in mucilage from “Tieegguunn” yam tubers

表3 鐵棍山藥黏液質單糖組成Table 3 Contents of monosaccharides in mucilage from “Tieegguunn” yam tubers

2.2 山藥黏液質及其酶解液的電泳圖譜

圖1 鐵棍山藥黏液質及其酶解物的電泳圖譜Fig. 1 SDS-PAGE profi le of mucilage from “Tieegguunn” yam tubeerrss and its hydrolysates

由圖1可知，山藥黏液質經不同的酶酶解以后，電泳圖譜發生明顯的變化。在上樣量相同的條件下，酶解以后的黏液質顯現的 條帶明顯變細，其中復合蛋白酶酶解物所顯現的條帶最細，其次是胰蛋白酶酶解物，再次是纖維素酶酶解物，這表明3 種酶均對黏液質發生了部分酶解；而3 種酶解物電泳譜帶與黏液質比較，也發生了變化，這可能與所選取的酶的不同酶解程度有關，復合蛋白酶是由幾種蛋白酶組成，酶切位點較多，水解度最高，因此黏液質被復合蛋白酶酶解后，酶解物的電泳圖譜上呈現較多譜帶；而胰蛋白酶酶切位點是在賴氨酸和精氨酸的前面，相對酶切位點較少，水解度較復合蛋白酶的低，黏液質經胰蛋白酶酶切以后，在電泳圖譜上呈現 的條帶雖然多于黏液質，但卻少于復合蛋白酶酶解物；纖維素酶酶解物的電泳譜帶，最接近于黏液質的譜帶，這可能與纖維素酶只水解β-(1,4)糖苷鍵連接的葡萄糖殘基[19]，因此在蛋白染色的電泳圖譜上，看不到譜帶的明顯變化。

2.3 山藥黏液質及其酶解物的紫外掃描圖譜

圖2 鐵棍山藥黏液質及其酶解物的紫外光譜Fig. 2 Ultraviolet absorption spectra of mucilage from “Tiegun”egun yam yam tubersubers and its hydrolysates

由圖2的紫外光譜分析發現，在β消除反應之前，山藥黏液質、胰蛋白酶酶解物、纖維素酶酶解物和復合蛋白酶酶解物在波長280 nm左 右均有一明顯的吸收峰，這是蛋白質的紫外吸收峰；當β消除反應之后，4 種物質在240 nm波長處均出現了明顯的吸收峰，說明4 種物質中均含有O-連接的糖苷鍵，這一結果表明實驗所用的3 種酶對O-糖苷鍵并未起到破壞作用。

2.4 山藥黏液質及其酶解物的紅外光譜分析

圖3 山藥黏液質及其酶解物的紅外譜Fig. 3 IR spetra of mucilage from “Tieegguunn” yam tubeerrss and its hydrolysates

3 500～3 100 cm－1范圍內是伯酰胺以及締合—OH的吸收峰，此峰較寬，也被認為是糖類的特征峰[20]，由圖3可知，復合酶、纖維素酶、胰酶酶解產物在此處的吸收峰位于3 404 cm－1處，而黏液質的位于3 275 cm－1處，這可能是由于酶解后氫鍵打開，締合—OH能力減弱造成的；2 958 cm－1處為—CH吸收峰，為伸縮振動；1 643 cm－1處為乙酰氨基中C=O的吸收峰，振動方式為伸縮振動，且蛋白質的二級結構為α-螺旋結構；1 543 cm－1為—NH2吸收峰，振動方式為變角振動，這兩個峰被認為是蛋白的特征吸收峰，1 400 cm－1為—CH面內彎曲振動吸收峰，主要是蛋白分子肽鍵的特征吸收峰[21]，復合蛋白酶酶解物中，1 543 cm－1為—NH2吸收峰明顯發生變化，表明復合酶作用后黏液質分子的空間結構發生了變化；1 240 cm－1是S=O伸縮振動特征峰；1 068 cm－1為C—O—C伸縮振動吸收峰，是多糖的特征吸收峰，且為吡喃糖環中的醚鍵和羥基的吸收峰，有報道認為1 068 cm－1處是β-(1,4)糖苷鍵產生的吸收峰[22]，纖維素酶酶解物中，1 068 cm－1為C—O—C伸縮振動吸收峰的峰型與其他3 種物質明顯不同，而纖維素酶的作用位點正是β-(1,4)糖苷鍵，因此驗證了這一說法。

2.5 山藥黏液質及其酶解物的掃描電子顯微鏡圖譜

圖4 山藥黏液質及其酶解物的掃描電子顯微鏡圖譜（×1 000）Fig. 4 Scanning electron microscopic (SEM) images of mucilage from“Tieegguunn” yam tubers

由圖4可知，在掃描電子顯微鏡下，山藥黏液質的微觀結構呈現相互聯通的網狀多孔結構，孔的形狀不規則但清晰可見，多數孔徑大于10 μm；經胰蛋白酶、纖維素酶、復合蛋白酶處理后，得到的酶解物與黏液質的微觀結構相比均發生明顯改變。黏液質經胰蛋白酶和復合蛋白酶酶解后，形成了較 小的顆粒狀物質，直徑均小于10 μm，聚集在孔徑周圍，使孔徑變得模糊不清。而黏液質經纖維素酶酶解后，形成了碎片狀物質，碎片有大有小，但已經看不到孔狀結構。有人用不同的酶酶解膠原蛋白，觀察其微觀結構也發生了很大變化，這種變化與酶的種類和水解程度有關[23]；Jin Wengang等[24]認為用蛋白酶酶解蛋白質，一方面可以降低蛋白質的分子質量，增加蛋白質的親水性（通過帶電基團的介入）；另一方面可以使蛋白質的非極性基團暴露，蛋白的疏水性增強，形成凝聚狀態。本實驗山藥黏液質用胰蛋白酶和復合蛋白酶酶解后，觀察到的微觀結構符合這一說法，但用纖維素酶酶解后的酶解產物微觀結構與蛋白酶酶解物的微觀結構相差很大，其原因還有待進一步研究。

2.6 山藥黏液質及其酶解物對淋巴細胞轉化的影響

圖5 山藥黏液質及其酶解物對淋巴細胞轉化的影響（ =6）Fig. 5 Effects of mucilage from “Tiegun” yam tubers and its hydrolysates on lymphocyte transformat ion (n = 6)

由圖5可知，山藥黏液質及其酶解物在一定劑量范圍內能顯著提高脾淋巴細胞增殖轉化能力，但不同組分之間的影響存在一定差異。當加入各組分的質量濃度為5 μg/mL時，與空白對照組相比，均未出現顯著性差異；當質量濃度達到25 μg/mL時，除黏液質組與空白對照組相比無顯著性差異外，其他3 組均呈現顯著促進作用；當質量濃度在50 μg/ mL時，4 個組分對淋巴細胞的增殖轉化均呈現顯著的促進作用；在質量濃度為75 μg/mL時，各組分促脾淋巴細胞轉化能力達到最大值；隨著質量濃度的進一步增加，各組分對脾淋巴細胞轉化能力也呈下降趨勢；表明各組分對脾淋巴細胞轉化能力的促進作用表現出一定的劑量效應關系。總體上看，4 個組分中，山藥黏液質促進淋巴細胞增殖轉化能力最弱，其他3 種酶解物促進淋 巴細胞增殖轉化能力顯著強于山藥黏液質，其中復合蛋白酶酶解物的最強。Chalamaiah等[25]研究鯉魚卵蛋白的不同酶解物對淋巴細胞增殖作用，發現不同的酶解物均促進淋巴細胞增殖作用，但增殖效果不同，而Agyei等[26]認為不同酶解物對淋巴細胞增殖效果不同，是由于酶解后產物的結構不同造成的。

2.7 山藥黏液質及其酶解物對細胞因子mRNA表達的影響

圖6 山藥黏液質及其酶解物對細胞因子mRNA表達水平的影響Fig. 6 Effects of mucilage from “Tieegguunn” yam tubers and its hydrolysates on mRNA expression of cytokines

由圖6A可知，4 個組分對淋巴細胞Th1型細胞因子（白細胞介素-2（interl eukin-2，IL-2）、IL-12和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ））的mRNA表達均有促進作用，但對每種細胞因子mRNA表達量影響不同；由圖6B可知，4 個組分對淋巴細胞Th2型細胞因子（IL-4、IL-6和IL-10）的mRNA表達也均有促進作用，但對每種細胞因子mRNA表達量影響也不同；比較圖6A與圖6B發現，4 個組分對Th1型細胞因子（IL-2、IL-12和IFN-γ）的mRNA表達的促進作用要高于對Th2型細胞因子（IL-4、IL-6和IL-10）的mRNA表達的促進作用，這將會使脾淋巴細胞由Th0向Th1分化[27]。Priyankar等[28]研究山藥乙醇提取物對脾淋巴細胞因子的影響，發現山藥乙醇提取物能促進Th1細胞因子mRNA表達，而抑制Th2細胞因子mRNA表達。在本實驗中，4 種物質對Th2族細胞因子的mRNA表達也有促進作用，這可能是由于細胞的大量增殖分化引起的量上的增加。但由于4 種物質對Th1族細胞因子的mRNA的表達促進作用遠遠高于對Th2族細胞因子mRNA表達的促進作用，表明4 種物質均會使Th1/Th2平衡向Th1偏移。

3 結 論

山藥黏液質中總糖含量占40.87%，蛋白質含量約占56.93%。檢測到17 種氨基酸，其中谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸含量較高，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的39.543%；鐵棍山藥黏液中含有7 種單糖，其中氨基葡萄糖和甘露糖含量較高，占總糖含量的66.422%。

選取不同的酶對山藥黏液質進行酶解，獲得3 種山藥黏液質的酶解產物。通過電泳、紅外光譜、紫外光譜及電子顯微鏡掃描技術，對山藥黏液質及其酶解物的微觀結構進行比較，結果表明山藥黏液質及其不同酶解產物在微觀結構上存在差別。

研究了山藥黏液質及其酶解物的免疫活性，發現山藥黏液質及其酶解物對脾淋巴細胞增殖轉化均有促進作用，其中山藥黏液質促進作用最弱，復合酶酶解物促進作用最強；山藥黏液質及其酶解產物均能促進Th1型細胞因子（IL-2、IL-12和IFN-γ）的mRNA表達和Th2型細胞因子（IL-4、IL-6和IL-10）的mRNA表達，但對Th1型細胞因子（IL-2、IL-12和IFN-γ）mRNA表達的促進作用要高于對Th2型細胞因子（IL-4、IL-6和IL-10）mRNA表達的促進作用。

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Microstructure and Immunomodulating Activity of Mucilage from “Tiegun” Yam Tubers (Dioscorea opposita Thunb. cv. Tsukune) and Its Hydrolysates

REN Guoyan, WU Tingting, ZHANG Fan, GUO Jinying, CUI Guoting, WU Ying, WA NG Ping, CAO Li
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

Mucilage was extracted from “Tiegun” yam tubers (Dioscorea opposita T hunb. cv. Tsukune), and its hydrolysates were obtained by hydrolysis with different enzymes (trypsin, cellulase and complex protease). The microstructure of mucilage and its hydrolysates were detected by infrared spectroscopy and scanning electron microscopy. Meanwhile, their effects on the pr oliferati on of spleen lymphocytes and the relative expression levels of cytokine mRNA were explored by cel l culture in vitro and quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) methods, respectively. The results showed that mucil age and its hydrolysates were different in microstructure. Mucilage and its hydrolysates could promote the proliferation and transformation of spleen lymphocytes, but the promoting effect of mucilage was weaker than that of its hydrolysates. Promoting effects of mucilage and its hydrolysates on the mRNA expression of Th1 cytokines were signifi cantly higher than that of Th2 cytokines. These results showed that yam mucilage and its hydrolysates had potential function to shift the Th1/Th2 balance to relative Th1 dominance.

yam mucilage; hydrolysates; lymphocyte transformation; cytokine; mRNA expression

10.7506/spkx1002- 6630-201611011

TS201.4

A

1002-6630（2016）11-0058-07

任國艷, 吳婷婷, 張凡, 等. 山藥黏液質及其酶解物的微觀結構及免疫活性[J]. 食品科學, 2016, 37(11): 58-64.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611011. http://www.spkx.net.cn REN Guoyan, WU Tingting, ZHANG Fan, et al. Microstructure and immun omodula ting activity of mucilage from “Tiegun”yam tubers (Dioscorea opposita Thunb. cv. Tsukune) and its hydrolysates[J]. Food Science, 2016, 37(11): 58-64. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611011. http://www.spkx.net.cn

2015-08-31

河南科技大學研究培育基金項目（400913480019）

任國艷（1976—），女，副教授，博士，研究方向為生物活性物質及功能制品。E-mail：renguoyan@163.com