市售酸奶中乳酸菌耐藥性及耐藥基因的檢測

于 濤，姜曉冰*，李 磊，王 輝，逯勝哲，張萌萌，祈真平，于明月（.新鄉學院生命科學技術學院，河南 新鄉 453000；2.河南師范大學生命科學學院，河南 新鄉 453007）

市售酸奶中乳酸菌耐藥性及耐藥基因的檢測

于 濤1，姜曉冰2,*，李 磊1，王 輝1，逯勝哲1，張萌萌1，祈真平1，于明月1
（1.新鄉學院生命科學技術學院，河南 新鄉 453000；2.河南師范大學生命科學學院，河南 新鄉 453007）

為探討酸奶中乳酸菌所攜帶耐藥基因對人類健康的潛在影響，對市售酸奶中的乳酸菌進行分離和鑒定，并通過藥物敏感性實驗確定菌株的耐藥譜，同時利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增技術調查鏈霉素、慶大霉素、磺胺類和四環素等耐藥基因的分布情況。結果表明：25 份市售酸奶樣品中共分離得到56 株乳酸菌，包括26 株德氏乳桿菌保加利亞亞種、3 株植物乳桿菌、2 株嗜酸乳桿菌以及25 株嗜熱鏈球菌。藥敏結果顯示，31 株乳桿菌對鏈霉素（87.1%）、慶大霉素（80.6%）、環丙沙星（74.2%）和四環素（61.3%）的耐藥率較高，對頭孢菌素類則較為敏感；而25 株嗜熱鏈球菌同樣對鏈霉素的耐藥率最高，達76.0%；其次分別為萬古霉素（32.0%）、環丙沙星（32.0%）和四環素（20.0%）。56 株乳酸菌中共檢出5 種不同的耐藥基因，分別為鏈霉素耐藥基因ant(6)（檢出率1.8%）、慶大霉素耐藥基因aac(6')-aph(2'')（檢出率7.1%）、四環素耐藥基因tetM（檢出率5.4%）以及磺胺類耐藥基因sulⅠ（檢出率14.3%）和sulⅡ（檢出率1.8%）。受試的乳酸菌中共有13 株檢出耐藥基因，其中有4 株攜帶兩種不同的耐藥基因。長期以來被認為安全并廣泛應用于發酵食品領域的乳酸菌可能成為潛在的耐藥基因貯存庫。

酸奶；乳酸菌；耐藥；耐藥基因

乳酸菌是指能夠發酵糖類，主要代謝產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱[1]。除極少數外，絕大多數乳酸菌都是人體內必不可少且具有重要生理功能的菌群，廣泛存在于人體腸道中。乳酸菌作為發酵劑或益生菌菌種被廣泛應用于食品、農業、制藥等行業。長期以來，發酵產品中所使用的乳酸菌普遍被人們認為是安全菌株[2]，其中德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌是目前酸奶生產工藝中的主要發酵劑。

隨著抗生素在臨床、畜牧業、養殖業等領域的廣泛應用甚至是濫用，細菌耐藥性問題愈發嚴重。早期有關細菌耐藥的研究主要集中于病原微生物[3-4]，但近年來對環境中共生細菌及乳酸菌的耐藥性研究越來越受到學者的關注[5-9]。研究表明，乳酸菌對臨床使用的多種抗菌藥物表現出不同程度的耐藥性，多數乳酸菌對氨基糖苷類、糖肽類、氟喹諾酮類以及磺胺類等抗生素具有天然耐受能力[10]。并且，已有學者在乳酸菌耐藥菌株中檢測到相應的耐藥基因[8,11-12]。Thumu等[13]在分離自發酵食品的乳酸菌耐藥株中檢測到紅霉素和四環素耐藥基因。另外，研究者在生產酸奶用的乳桿菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌耐藥菌株中也檢測到相關的耐藥基因[8,14]。已有研究證實，在體外培養條件下耐藥基因能夠在不同種屬的乳酸菌菌株中發生轉移[15]。這就意味著，當乳酸菌耐藥菌株經食物攝入進入人體后，可能會通過基因水平轉移等途徑將耐藥基因傳遞給腸道內其他共生菌甚至是致病菌，從而對人類健康構成潛在威脅。因此，是否攜帶耐藥基因可做為評價乳酸菌安全性的指標之一。

鑒于此，本研究對市售酸奶中的乳酸菌進行分離和鑒定，通過藥物敏感性實驗確定菌株的耐藥譜，同時調查鏈霉素、環丙沙星、慶大霉素、四環素、萬古霉素和磺胺等耐藥基因在這些菌株中的分布情況，為乳酸菌的安全評價提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

實驗所用樣品采購于河南省新鄉市區4 個大型超市，共選購8 個廠家生產的保質期內酸奶25 份。樣品在2 h內運送至實驗室進行后續操作。

藥敏實驗用質控菌株Escherichia coli ATCC 25922、Staphylococcus aureus ATCC 25923和Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853由中國人民解放軍海軍總醫院檢驗科惠贈。

MRS培養基、MC瓊脂培養基、革蘭氏染色試劑盒、乳酸菌生化鑒定試劑盒 北京陸橋技術有限責任公司；11 種藥敏紙片：慶大霉素（gentamicin，GEN，10 μg）、鏈霉素（streptomycin，STR，10 μg）、萬古霉素（vancomycin，VAN，30 μg）、紅霉素（erythromycin，ERY，15 μg）、四環素（tetracycline，TET，30 μg）、復方新諾明（trimethoprim/ sulfamethoxazole，SXT，1.25 μg＋23.75 μg）、氨芐西林（ampicillin，AMP，10 μg）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP，5 μg）、頭孢曲松（ceftriaxone，CRO，30 μg）、頭孢他啶（ceftazidime，CAZ，30 μg）、頭孢噻肟（cefotaxime，CTX，30 μg） 杭州天和微生物有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）反應緩沖液、10×Loading Buffer 大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

Bactron I厭氧培養箱 美國Shellab公司；XSP-4C光學顯微鏡 上海宇隆儀器有限公司；ETC-811基因擴增儀 蘇州東勝興業科學儀器有限公司；DYY-8C電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Universal Hood II凝膠成像分析系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離與鑒定

參照GB 4789.35—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》中的檢驗方法：取酸奶樣品25 mL（g）置于裝有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。吸取樣品勻液1 mL，用生理鹽水按10 倍遞增進行梯度稀釋，選取3 個適宜的稀釋度分別涂布于MRS和MC固體培養基上，36 ℃厭氧培養24～48 h。挑取典型單菌落劃線于MRS或MC平板上進行純化，純化后的菌株進行革蘭氏染色并鏡檢。利用乳酸菌生化鑒定試劑盒對所分離菌株進行生化鑒定。

1.3.2 DNA模板的制備

乳酸菌DNA的提取按照細菌基因組DNA提取試劑盒的產品說明書方法進行。

1.3.3 16S rDNA的PCR擴增

以提取的基因組DNA為模板，選用細菌通用引物進行擴增。正向引物27F：5’-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3’，反向引物1492R：5’-GGTTACCTT GTTACGACTT-3’[16]。PCR反應程序為：95 ℃預變性3min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物送至上海英駿生物技術有限公司進行DNA序列雙向測序，將測序結果在Ribosomal Database Project（RDP）數據庫（http:// rdp.cme.msu.edu）進行比對確定菌株的種屬。

1.3.4 藥物敏感性實驗

按照世界衛生組織（World Health Organization，WHO）推薦的K-B紙片擴散法檢測菌株對抗生素的敏感性，結果判定依照美國臨床實驗室標準化委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2015版方法手冊[17]進行。目前關于乳酸菌對抗生素的耐藥折點濃度尚缺乏統一的標準，在本研究中乳酸菌對氨芐西林、萬古霉素、紅霉素、四環素和環丙沙星的抑菌圈直徑解釋參照腸球菌屬的標準；對頭孢類、慶大霉素和復方新諾明的抑菌圈直徑解釋參考葡萄球菌屬的標準；對鏈霉素的抑菌圈直徑解釋參考腸桿菌科的標準（CLSI中沒有腸球菌屬和葡萄球菌屬對鏈霉素的抑菌圈直徑解釋標準）。藥敏結果分為敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）3 種。每批實驗均用Escherichia coli ATCC 25922、Staphylococcus aureus ATCC 25923和Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853進行質量控制。

1.3.5 PCR擴增耐藥基因

所有菌株分別經PCR擴增檢測鏈霉素耐藥基因strA、strB、ant(6)，喹諾酮類（環丙沙星）質粒介導耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS，慶大霉素耐藥基因aac(6')-aph(2'')，四環素耐藥基因tetM、tetS，萬古霉素耐藥基因vanA、vanB和磺胺甲基異噁唑耐藥基因sulⅠ、sulⅡ，引物序列及擴增條件見表1。選擇部分PCR產物送至上海英駿生物技術有限公司進行基因測序，結果在GenBank基因庫中比對分析。

表1 PCR擴增耐藥基因所用引物及擴增條件Table 1 Primers for screening antimicrobial resistance genes and PCR conditions used in this study

2 結果與分析

2.1 酸奶樣品乳酸菌的分離與鑒定

本研究共采集市售酸奶樣品25 份，每份樣品對應的平板上均有細菌生長。從MRS和MC平板上挑取單菌落進行革蘭氏染色，結果顯示菌體呈紫色，可判定為革蘭氏陽性。在顯微鏡下可觀察到乳桿菌屬的菌體形態多樣，呈長桿狀、彎曲桿狀和短桿狀；嗜熱鏈球菌的菌體呈球形。通過生化鑒定和16S rDNA序列比對可知，分離得到的56 株乳酸菌中26 株為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、3 株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、2 株為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、25 株為嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）。

2.2 藥敏實驗結果

3 株質控菌株對11 種抗生素的抑菌圈直徑均在質控范圍內，表明藥敏實驗結果可靠。56 株乳酸菌對11 種抗生素的藥物敏感性結果見表2（本研究中耐藥率為耐藥和中介耐藥的菌株所占的比例），31 株乳桿菌對鏈霉素的耐藥率最高，達87.1%；其次分別為慶大霉素（80.6%）、環丙沙星（74.2%）、四環素（61.3%）和萬古霉素（48.4%）；對頭孢噻肟最敏感，無耐藥菌株出現。25 株嗜熱鏈球菌對鏈霉素的耐藥率最高，達76.0%；其次分別為萬古霉素（32.0%）、環丙沙星（32.0%）和四環素（20.0%）。

表2 乳酸菌藥物敏感性結果Table 2 Antimicrobial resistance phenotypes of LAB strains

總體而言，本研究分離得到的56 株乳酸菌對供試的抗生素均表現出不同程度的耐藥性，其中對鏈霉素（82.1%）、環丙沙星（55.4%）、慶大霉素（50.0%）、四環素（42.9%）、萬古霉素（41.1%）和復方新諾明（25.0%）的耐藥情況較為嚴重；頭孢噻肟和頭孢曲松的對受試菌株表現出較好的抑菌效果（圖1）。Zhou Ning等[8]從我國多個地區采集的酸奶樣品中分離得到43 株乳酸菌，藥敏結果顯示這些菌株對鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環素和氯霉素的耐藥率較高。石磊等[21]對廣州市售酸奶中乳酸菌的耐藥性進行調查，發現48 株乳酸菌對卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、萬古霉素和環丙沙星的耐藥水平較高。本研究中乳酸菌對鏈霉素、慶大霉素、萬古霉素和環丙沙星的高耐藥率與先前報道的結果相似。

圖1 分離菌株對11 種抗生素的耐藥率Fig. 1 Frequency of drug resistance in all isolates

2.3 耐藥基因檢測結果

圖2 乳酸菌中耐藥基因PCR擴增結果Fig. 2 Amplifi cation of PCR products of antimicrobial resistance genes from LAB strains

如圖2和表3所示，56 株乳酸菌中有13 株攜帶耐藥基因，占受試菌株的23.2%。其中，1 株德氏乳桿菌保加利亞亞種攜帶鏈霉素耐藥基因ant(6)；2 株植物乳桿菌、1 株德氏乳桿菌保加利亞亞種和1 株嗜熱鏈球菌攜帶慶大霉素耐藥基因aac(6')-aph(2'')；磺胺甲基異噁唑耐藥基因sulⅠ在受試菌株中的檢出率最高（8/56，14.3%），而sulⅡ基因僅在1 株嗜熱鏈球菌中檢出；3 株德氏乳桿菌保加利亞亞種攜帶四環素耐藥基因tetM，而tetS基因在受試菌株中沒有檢出。所有菌株中均未檢出環丙沙星和萬古霉素相關耐藥基因。

鏈霉素是一種氨基糖苷類抗生素，能夠與細菌核糖體結合從而抑制蛋白質合成，最終導致細菌死亡。細菌對鏈霉素產生耐藥的主要機制是通過產生多種作用于特定氨基或羥基的鈍化酶，抑制藥物與細菌核糖體結合，使藥物無法干擾菌體蛋白質的合成過程，從而導致耐藥。編碼修飾鏈霉素鈍化酶的耐藥基因主要包括strA、strB、ant(6)和aadA，其中aadA主要分布于革蘭氏陰性菌中。本研究中所有菌株均未檢測到strA和strB，僅在1 株保加利亞乳桿菌中檢出ant(6)，這與先前的報道一致[8]。

aac(6')-aph(2'')編碼雙功能酶AAC(6')-APH(2'')，該酶具有乙酰轉移酶和磷酸轉移酶兩種活性，可介導除鏈霉素外的大多數氨基糖苷類抗生素的高水平耐藥。許多文獻表明，aac(6')-aph(2'')基因與腸球菌對慶大霉素耐藥具有高度相關性，并且該基因常位于耐藥質粒上[22]。

表3 乳酸菌中耐藥基因的檢出情況Table 3 Determination of antimicrobial resistance genes from LAB strains

磺胺類耐藥基因編碼二氫葉酸合成酶，介導細菌對此類藥物的耐藥。本研究中sulⅠ的陽性率最高，并且有一株嗜熱鏈球菌同時攜帶sulⅠ和sulⅡ。研究表明，磺胺耐藥基因多位于可移動遺傳元件上，如整合子、質粒等，能夠通過水平轉移在細菌種內甚至種間傳播，從而加速耐藥以及多重耐藥菌株的出現[23]。

目前已發現的四環素耐藥基因達40多種，其中tetM和tetS在革蘭氏陽性菌中分布較為廣泛，而在本研究中未檢出tetS基因。Nawaz等[24]在22 株乳酸菌中檢出tetM陽性菌株8 株，tetS陽性菌株3 株；Zhou Ning等[8]對23 株乳酸菌四環素耐藥菌株進行研究，發現有3 株攜帶tetM，未檢出其他種類的四環素耐藥基因。以上研究表明，在乳酸菌四環素耐藥菌株中tetM基因的分布可能更為普遍。報道顯示tet基因常與質粒、轉座子、接合型轉座子等可移動成分相連，通過質粒和轉座子在菌群之間進行轉移[25]。

本研究中，菌株攜帶的耐藥基因與耐藥表型之間呈現對應關系。例如，保加利亞乳桿菌1R-1和10R-2均攜帶sulⅠ和tetM基因，相應的這兩株菌均對復方新諾明和四環素表現耐藥；植物乳桿菌3R-3攜帶aac(6')-aph(2'')和sulⅠ基因，該菌株對慶大霉素和復方新諾明耐藥。值得注意的是，在部分耐藥菌株中并沒有檢出相應的耐藥基因，表明在這些耐藥菌株中可能還存在其他的耐藥機制。本研究中，菌株對環丙沙星和萬古霉素耐藥率較高，但是擴增結果顯示在環丙沙星和萬古霉素耐藥菌株中均未檢出相關耐藥基因。環丙沙星為第3代喹諾酮類抗菌藥物，目前普遍認為細菌對此類藥物的耐藥機制主要有3 種，即藥物靶蛋白突變、主動外排系統表達增強及質粒介導喹諾酮耐藥[18]。乳酸菌環丙沙星耐藥菌株中未檢出質粒介導的喹諾酮耐藥基因，表明這些菌株的耐藥性可能由其他機制介導。萬古霉素為糖肽類抗生素，主要通過抑制細胞壁的合成實現殺菌作用。細菌對萬古霉素的耐藥機制包括基因突變導致細胞壁變厚或成分改變和耐藥基因的獲得。研究顯示，萬古霉素耐藥基因vanA和vanB能夠在腸球菌和葡萄球菌之間發生轉移，從而介導細菌對萬古霉素的高水平耐藥[26]。而在本研究中，所有萬古霉素耐藥菌株均未攜帶vanA和vanB，說明這些菌株的耐藥不是由這兩個基因所介導的。

56 株乳酸菌中共檢出5 種不同的耐藥基因，其中有4 株菌株攜帶兩種不同的耐藥基因。已有體內實驗證明，某些耐藥基因能夠在腸道正常菌之間以及腸道正常菌與致病菌之間發生轉移[15]，而食品鏈就是耐藥基因在腸道內傳播的主要途徑。雖然大部分與食品有關的乳酸菌都已經獲得相對安全認證，但是它們仍然存在潛在的安全隱患。Nawaz等[24]在分離自發酵食品的乳酸菌中檢測到多種耐藥基因的存在，并通過接合轉移實驗證明紅霉素耐藥基因emrB和四環素耐藥基因tetM能夠從乳桿菌轉移至受體菌Enterococcus faecalis 181。我國學者也對杭州地區發酵乳制品中乳酸菌發生耐藥傳播的安全性進行了評估，結果顯示18.8%的乳酸菌能夠通過質粒接合將耐藥基因轉移至受體菌Escherichia coli J53[27]。這些研究表明分離自發酵食品的乳酸菌很有可能會扮演耐藥基因貯存宿主的角色，并通過食品鏈將耐藥性轉移到腸道其他正常菌群或者致病菌中，造成耐藥性的傳播[28]。本研究中乳酸菌攜帶的耐藥基因能否在不同種屬的細菌間發生轉移則需要進一步的深入研究。

3 結 論

本研究從25 份酸奶樣品中分離得到56 株乳酸菌，包括31 株乳桿菌和25 株嗜熱鏈球菌。藥敏結果顯示，這些菌株對鏈霉素、慶大霉素、環丙沙星和四環素耐藥率較高。56 株乳酸菌中共檢出5 種不同的耐藥基因，即鏈霉素耐藥基因ant(6)、慶大霉素耐藥基因aac(6')-aph(2'')、四環素耐藥基因tetM以及磺胺類耐藥基因sulⅠ和sulⅡ。本研究中多種耐藥基因的存在表明用于發酵食品的乳酸菌可能成為潛在的耐藥基因貯存庫。由于這些耐藥基因多位于可移動遺傳元件上，這就意味著它們可能會轉移到腸道中的其他正常菌群或者致病菌中，進而造成耐藥性的傳播，最終威脅人類健康。因此，應當加強對乳酸菌等食品工業用菌的耐藥監測，合理評估其安全性，保證食品質量與安全。

[1] BOURDICHON F, CASAREGOLA S, FORROKH C, et al. Food fermentations: microorganisms with technological beneficial use[J]. International Journal of Food Microbiology, 2012, 154: 87-97. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2011.12.030.

[2] MATHUR S, SINGH R. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria: a review[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005, 105: 281-295. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2005.03.008.

[3] DALLAL M M S, DOYLE M P, REZADEHBASHI M, et al. Prevalence and antimicrobial resistance profiles of Salmonella serotypes, Campylobacter and Yersinia spp. isolated from retail chicken and beef, Tehran, Iran[J]. Food Control, 2010, 21: 388-392. DOI:10.1016/j.foodcont.2009.06.001.

[4] GOUSIA P, ECONOMOU V, SAKKAS H, et al. Antimicrobial resistance of major fooborne pathogens from major meat products[J]. Foodborne Pathogens and Disease, 2011, 8: 27-38. DOI:10.1089/ fpd.2010.0577.

[5] BOK E, MAZUREK J, STOSIK M, et al. Prevalence of virulence determinants and antimicrobial resistance among commensal Escherichia coli derived from dairy and beef cattle[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2015, 12: 970-985. DOI:10.3390/ijerph120100970.

[6] D’AIMMO M R, MODESTO M, BIAVATI B. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria and Bifidobacterium spp. isolated from dairy and pharmaceutical products[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 115: 35-42. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2006.10.003.

[7] FRAQUEZA M J. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from dry-fermented sausages[J]. International Journal of Food Microbiology, 2015, 212: 76-88. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2015.04.035.

[8] ZHOU Ning, ZHANG Jianxin, FAN Mingtao, et al. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from Chinese yogurts[J]. Journal of Dairy Science, 2012, 95: 4775-4783. DOI:10.3168/jds.2011-5271.

[9] ZHANG Hongmei, XIE Lisi, ZHANG Wenyan, et al. The association of biofi lm formation with antibiotic resistance in lactic acid bacteria from fermented foods[J]. Journal of Food Safety, 2013, 33: 114-120. DOI:10.1111/jfs.12030.

[10] 張灼陽, 劉暢, 郭曉奎. 乳酸菌耐藥性的研究進展[J]. 中國微生態學雜志, 2007, 19(5): 478-480. DOI:10.13381/j.cnki.cjm.2007.05.015.

[11] HUMMEL A S, HERTEL C, HOLZAPTEL W H, et al. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73: 730-739. DOI:10.1128/AEM.02105-06.

[12] TOOMEY N, BOLTON D, FANNING S. Characterisation and transferability of antibiotic resistance genes from lactic acid bacteria isolated from Irish pork and beef abattoirs[J]. Research in Microbiology, 2010, 161: 127-135. DOI:10.1016/ j.resmic.2009.12.010.

[13] THUMU S C R, HALAMI P M. Presence of erythromycin and tetracycline resistance genes in lactic acid bacteria from fermented foods of Indian origin[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2012, 102: 541-551. DOI:10.1007/s10482-012-9749-4.

[14] 秦宇軒, 李晶, 王秋涯, 等. 市售酸奶中乳酸菌的鑒定與耐藥性[J].微生物學學報, 2013, 53(8): 889-897. DOI:10.13343/j.cnki. wsxb.2013.08.010.

[15] MIELE A, BANDERA M, GOLDSTEIN B P. Use of primers selective for vancomycin resistance genes to determine van genotype in enterococci and to study gene organization in VanA isolates[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1995, 39(8): 1772-1778. DOI:10.1128/aac.39.8.1772.

[16] MORENO C, ROMERO J, ESPEJO R T. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J]. Microbiology, 2002, 148: 1233-1239. DOI:10.1099/00221287-148-4-1233.

[17] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 25th Informational Supplement, M100-S25[S]. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2015.

[18] JIANG X, YU T, WU N, et al. Detection of qnr, aac(6')-Ib-cr and qepA genes in Escherichia coli isolated from cooked meat products in Henan, China[J]. International Journal of Food Microbiology, 2014, 187: 22-25. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2014.06.026.

[19] NG L K, MARTIN I, ALFO M, et al. Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistance genes[J]. Molecular and Cellular Probes, 2001, 15: 209-215. DOI:10.1006/mcpr.2001.0363.

[20] CHEN S, ZHAO S, WHITE D G, et al. Characterization of multipleantimicrobial-resistant Salmonella serovars isolated from retail meats[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70: 1-7. DOI:10.1128/aem.70.1.1-7.2004.

[21] 石磊, 李艷莉, 梁暖意, 等. 廣州市售酸奶中乳酸菌的耐藥性評估[J]. 現代食品科技, 2014, 30(10): 250. DOI:10.13982/ j.mfst.1673-9078.2014.10.041.

[22] 馮霞, 王蓉, 單斌, 等. 高耐慶大霉素腸球菌多重耐藥性與aac(6')-aph(2'')基因的相關性研究[J]. 實用檢驗醫師雜志, 2011, 3(4): 210-214. DOI:10.3969/j.issn.1674-7151.2011.04.005.

[23] ENNE V I, LIVERMORE D M, STEPHENS P, et al. Persistence of sulphonamide resistance in Escherichia coli in the UK despite national prescribing restriction[J]. Lancet, 2001, 357: 1325-1328. DOI:10.1016/ S0140-6736(00)04519-0.

[24] NAWAZ M, WANG J, ZHOU A, et al. Characterization and transfer of antibiotic resistance in lactic acid bacteria from fermented food products[J]. Current Microbiology, 2011, 62: 1081-1089. DOI:10.1007/s00284-010-9856-2.

[25] KOO H, WOO G. Distribution and transferability of tetracycline resistance determinants in Escherichia coli isolated from meat and meat products[J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 145: 407-413. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2011.01.003.

[26] 王敬華. 攜帶vanA基因萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌研究進展[J]. 國際檢驗醫學雜志, 2011, 32(6): 658-660. DOI:10.3969/ j.issn.1673-4130.2011.06.020.

[27] 劉傳杰, 談千千, 朱凱妮, 等. 杭州地區發酵乳制品中乳酸菌發生耐藥傳播的安全性研究[J]. 中國微生態學雜志, 2014, 26(5): 526-533. DOI:10.13381/j.cnki.cjm.201405008.

[28] van REENEN C A, DICKS L M T. Horizontal gene transfer amongst probiotic lactic acid bacteria and other intestinal microbiota: what are the possibilities? A review[J]. Archives of Microbiology, 2011, 193: 157-168. DOI:10.1007/s00203-010-0668-3.

Antimicrobial Resistance and Resistance Genes in Lactic Acid Bacteria Isolated from Commercial Yogurt

YU Tao1, JIANG Xiaobing2,*, LI Lei1, WANG Hui1, LU Shengzhe1, ZHANG Mengmeng1, QI Zhenping1, YU Mingyue1
(1. School of Life Science and Technology, Xinxiang University, Xinxiang 453000, China; 2. College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China)

In order to investigate the potential public health risk of resistance genes in lactic acid bacteria (LAB), LAB strains isolated from commercial yogurts were identified and investigated for antibiotic resistance profiles and the prevalence of streptomycin, gentamycin, sulfamethoxazole, and tetracycline resistance genes by PCR amplifi cation. A total of 56 LAB strains were isolated from 25 yogurt samples, including Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (n = 26), Lactobacillus plantarum (n = 3), Lactobacillus acidophilus (n = 2), and Streptococcus thermophilus (n = 25). Antimicrobial susceptibility tests showed that 31 Lactobacillus strains were frequently resistant to streptomycin (87.1%), gentamycin (80.6%), ciprofl oxacin (74.2%), and tetracycline (61.3%), whereas cephalosporin exhibited good activity against the strains. 25 Streptococcus thermophilus also showed the highest resistance rate to streptomycin (76.0%), followed by vancomycin (32.0%), ciprofl oxacin (32.0%) and tetracycline (20.0%). Five different resistance genes were detected among the tested strains, including ant(6) (accounting for 1.8% of the strains), aac(6')-aph(2'') (7.1%), tetM (5.4%), sul I (14.3%), and sul II (1.8%). Of the 56 LAB strains, thirteen were positive for resistance genes, among which four strains harbored two different resistance genes, indicating LAB strains which have been recognized as safe and widely used in fermented foods for a long time may act as a reservoir of resistance genes.

yogurt; lactic acid bacteria; antimicrobial resistance; resistance gene

10.7506/spkx1002-6630-201611023

TS252.7

A

1002-6630（2016）11-0131-06

于濤, 姜曉冰, 李磊, 等. 市售酸奶中乳酸菌耐藥性及耐藥基因的檢測[J]. 食品科學, 2016, 37(11): 131-136. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611023. http://www.spkx.net.cn

YU Tao, JIANG Xiaobing, LI Lei, et al. Antimicrobial resistance and resistance genes in lactic acid bacteria isolated from commercial yogurt[J]. Food Science, 2016, 37(11): 131-136. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611023. http://www.spkx.net.cn

2015-07-24

河南省高等學校重點科研項目（15A180006）；新鄉市重點科技攻關計劃項目（ZG15007）；河南師范大學博士科研啟動費支持課題；河南師范大學青年科學基金項目

于濤（1977—），男，講師，博士，研究方向為食品微生物污染與控制。E-mail：yutao@xxu.edu.cn

*通信作者：姜曉冰（1984—），女，講師，博士，研究方向為食品微生物污染與控制。E-mail：jxb841001@163.com