蛛網膜下腔出血引起大鼠長期認知功能損害及其與海馬小清蛋白陽性中間神經元細胞關系

毛仁玲，段　宇，高　幸，張　鈺，張法永

?

蛛網膜下腔出血引起大鼠長期認知功能損害及其與海馬小清蛋白陽性中間神經元細胞關系

毛仁玲1，段宇1，高幸1，張鈺2，張法永3

目的探討蛛網膜下腔出血(SAH)后大鼠認知功能損害及其海馬區小清蛋白(PV)陽性中間神經元細胞數量變化。方法雄性成年SD大鼠隨機分為對照組、假手術組和SAH組。在SAH術后20 w，采用8-臂迷宮實驗測定動物的空間認知功能，應用免疫組織化學檢測海馬區PV陽性中間神經元數量。結果與對照組和假手術組大鼠相比，SAH組大鼠訓練時間明顯延長(P<0.05)；在記憶測試中，間隔1 h、12 h和24 h，3組準確率相似；而間隔2 h、3 h和6 h，SAH組大鼠的記憶正確率明顯低于其它兩組(P<0.05)，顯示SAH引起長期記憶功能損害。免疫組化顯示，SAH組CA1區和齒狀回(DG)區PV陽性中間神經元細胞數明顯低于其它兩組(CA1，P<0.01；DG,P<0.05);CA2和CA3區3組之間未見明顯差異。結論SAH可引起長期認知功能損害，這些損害可能與SAH引起海馬CA1和DG區PV陽性中間神經元細胞數減少有關。

蛛網膜下腔出血；認知功能障礙；海馬；小清蛋白陽性中間神經元細胞

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)引起腦血管痙攣和認知功能損害的治療一直是臨床難題，近年來對于SAH引起血管痙攣的預防和治療取得顯著進展，大大降低SAH引起血管痙攣的發生率和嚴重程度，但SAH引起的長期認知功能損害目前沒有有效的治療方法[1,2]。SAH引起海馬損害是其引起認知功能損害的重要環節[3]，我們過去的研究顯示SAH可引起海馬區興奮性氨基酸急性積聚，可能導致認知功能損害原因之一[4]。Han等[5]采用視交叉前池動脈血注射法能制造可靠的SAH癡呆模型， SAH后海馬區神經元電生理反應發生改變，但未引起海馬區細胞明顯損害[5]。GABA能中間神經元細胞是海馬區最主要的抑制中間神經元細胞，對海馬區錐體細胞有重要調節作用，參與動物的認知功能，本研究選擇有快速棘波特征的小清蛋白(Parvalbumin,PV)陽性GABA能中間神經元[6]，觀察SAH后海馬區該類型神經元細胞數目變化情況。

1　材料與方法

1.1試驗材料Sprague-Dawley 大鼠(清潔級，上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，8-臂迷宮(Prof.William設計)， 小動物呼吸機100B(Anaheim,USA)，血液儲存器、膜氧交換器(Cobe Micro,Cole-Parmer Instrument,USA)，1∶100兔抗大鼠抗CD11b和ED1(Sigma-Aldrich CO,USA)，生物素化羊抗兔IgG (Sigma-Aldrich CO,USA)。

1.2實驗分組和處理健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重300～350 g，鼠齡10 w (上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，中國)。隨機分為3組：對照組(Control)、假手術組(Sham)和蛛網膜下腔出血組(SAH)，每組10只。大鼠完成認知功能檢查后做組織學檢測。大鼠在SAH前后于實驗室動物房內飼養，自由飲食，室溫20 ℃～22 ℃，每日光照12 h，黑暗12 h。

1.3SAH模型手術方法參照Prunell等視交叉前池注射SAH模型[7]。大鼠在異氟醚吸入麻醉下，行氣管插管和機械通氣，通過調整呼吸參數，使大鼠動脈血CO2分壓維持在38～42 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。手術過程行直腸溫度監測，通過自動調節加熱毯維持大鼠體溫在(37.3±0.2)℃；作尾動脈穿刺監測動脈壓；大鼠頭立體定向儀固定后，正中切開頭顯示前囟，在其前7.5 mm旁開0.5 mm作顱骨鉆孔，27號針頭沿矢狀前30度進針3 mm左右，到視交叉前池，SAH組注射0.25 ml動脈血，假手術組注射0.25 ml生理鹽水，5 min后取出針頭，骨蠟封骨孔。

1.4認知功能的檢測和評價參照Williams的方法并改進[8～10]。SAH術后18 w，大鼠給予食物限量，每只大鼠飼料為10 g·d-1，連續2 w后，大鼠體重為限量進食前的85%左右并維持。術后20 w開始記憶功能訓練。本研究采用8臂迷宮檢測大鼠認知功能，8臂迷宮為木質灰色，中間直徑為40 cm中央平臺，與均勻放射排列的長60 cm、寬9 cm的8個臂相連，在臂的末端有直徑為2 cm的食物凹槽。于訓練第1、2天，將大鼠放在8臂迷宮內熟悉環境。第3天，在8臂迷宮中心和4個臂放置食物顆粒，用透明玻璃板關閉未置食物的其他4臂入口。將大鼠放在8臂迷宮中央，待大鼠吃完食物顆粒或在8臂迷宮內停留超過5 min，將大鼠放回飼養籠內；間隔5 min后，清除剩余食物。

在原來未放置食物的4個臂上放置食物顆粒，并開放8 臂入口，將大鼠再次放置在迷宮中心。待大鼠吃完食物或在迷宮內停留超過5 min，將大鼠放回飼養籠內，一次訓練結束。大鼠身體通過入口為進入迷宮臂，大鼠進入迷宮臂并吃完臂里的食物為正確，其余均為錯誤。大鼠正確進入迷宮臂的次數除以大鼠進入迷宮臂總次數×100%作為大鼠覓食的正確率。

如果大鼠連續2 d吃完食物且正確率超過80%，進入第2階段訓練，將間隔時間由5 min延長到15 min，其余方法同第1階段。如果連續2 d正確率超過80%，大鼠被認為已經學會尋食，可作記憶能力檢查。將間隔時間延長到1 h、2 h、3 h、6 h、12 h和24 h，觀察大鼠覓食的準確率。在檢查結束后，間隔15 min對大鼠進行再次檢查。如果準確率仍高于80%，認為大鼠仍處于學會狀態。大鼠進入放置食物顆粒臂的正確率可反映大鼠的記憶能力，訓練的天數用來評價學習能力。

1.5免疫組織化學檢測標本獲取：大鼠腹腔內注射10%水和氯醛麻醉后，經左心室灌注0.1 mol·L-1PBS(pH 7.4)，直至右心房流出無色液體后，改為灌注4%多聚甲醛固定。斷頭取出腦組織，作快速冰凍切片。分別行尼氏染色(4只/每組)和抗小清蛋白(6只/每組)免疫組化染色(試劑購自Sigma-Aldrich公司，美國)，觀察海馬區是否存在神經元細胞和PV陽性中間神經元細胞損害。

2　結　果

2.18-臂迷宮的訓練時間在SAH術后20 w，采用8臂迷宮進行記憶功能訓練，為達到連續2 d吃完食物且正確率超過80%，假手術組和對照組組間無差異，分別為13.8 d和12.9 d，SAH組大鼠所需訓練時間較其他兩組顯著延長，需要17.6 d(P<0.05)(見表1)。

表1　8-臂迷宮的訓練天數±s)

與對照組和假手術相比*P<0.05

2.2大鼠8臂迷宮內覓食的準確率經過第一、二階段訓練后，各組大鼠被認為已經學會覓食，即：間隔15 min 3組準確率超過80%，開始行記憶能力的檢測(見表2)。隨著間隔時間的延長，SAH組大鼠迷宮內覓食準確率較其它兩組低，在間隔2 h、3 h和6 h具有顯著性差異(P<0.05)。間隔12 h和24 h，3組無明顯差異，提示間隔如此長時間可能使動物的整體記憶都明顯下降。檢查結束后，大鼠進行間隔15 min檢查，3組動物準確率超過80%，大鼠在檢查過程中一直處于“學會”狀態。

2.3組織化學檢測8-臂迷宮測試結束后，取各組大鼠腦組織行組織學檢查。尼氏染色：結果顯示海馬區內神經元數目均無顯著差異。抗小清蛋白(PV)細胞免疫組織化學染色：由于海馬區不同部位的容易損傷程度和功能不同，參照Han等[11]將海馬分為CA1、CA2、CA3和DG(齒狀回)(見圖1)。實驗各組PV陽性中間神經元細胞計數(見表3)。對照組和假手術組在4個分區中PV陽性中間神經元細胞數量沒明顯差異；在 SAH組中，中間神經元細胞數在CA1區和DG較其他兩組明顯減少。

表2　8-臂迷宮記憶功能檢測 ±s)

與對照組和假手術相比*P<0.05

表3　海馬不同區PV陽性中間神經元細胞 ( ±s/mm2)

與對照組和假手術組相比*P<0.01；與對照組和假手術相比#P<0.05

圖1抗PV免疫組化染色的海馬(10×)(A為對照組；B為假手術組；C為蛛網膜下腔出血組；D為海馬分區示意圖)

3　討　論

隨著顯微神經外科和血管內介入技術治療動脈瘤技術不斷發展，SAH患者預后較前有明顯改善，其死亡率和嚴重致殘率明顯下降，但引起長期認知功能損害目前并無有效治療方法，嚴重影響患者的社會回歸和生活質量。本研究顯示，SAH大鼠20 w后，其學習能力和空間記憶能力較對照組和假手術組明顯下降，提示SAH大鼠存在長期認知功能損害。

海馬在認知功能中起重要作用，各種因素導致海馬損害是引起認知損害的中心環節[5，11]，在臨床上可見一些患者SAH后海馬體積變小，與認知功能下降正相關[12]。本研究中，通過尼氏染色，發現SAH大鼠海馬區神經元細胞數量未見明顯減少，結果與Han等[5]研究結果一致。通過免疫組織化學進一步研究發現，海馬區GABA能中間神經元細胞主要亞型PV陽性神經元細胞在海馬的部分區域明顯減少，且以CA1區和DG下降明顯。

海馬CA1區與學習記憶等認知功能最為密切，CA1區神經元細胞對各種損害如缺氧、外傷和應激等最敏感，且最容易受到傷害，而海馬的CA3區和DG區對各種損害的耐受性較高，因此CA1區神經損害可作為研究認知功能損害的組織學指標。Ouyavg等[13]認為CA1區神經最容易損害可能與該區星形膠質細胞受損害有關。海馬其它部位在認知功能生理過程中也具有重要作用，DG對于多源性感覺輸入、空間及相關聯圖形的分辨和顳葉長期記憶的整合等輔助編碼具有關鍵作用，DG到CA3連接在海馬的功能中起重要作用， DG病變可明顯損害動物的近距離圖像的分辨，因此在8-臂迷宮訓練中需要更長的時間[14,15]。此外，和海馬齒狀回顆粒下區(subgranular zone,SGZ)存在有再生功能的神經干細胞,可分化成神經元細胞，整合到海馬中，可能海馬的CA3區和DG區對各種損害的耐受性較高的原因之一。

小清蛋白(PV)是一種鈣結合蛋白，它只存在于靈長類和嚙齒類動物特定的神經元細胞亞群。PV陽性中間神經元代表著高代謝和高電活動的GABA能神經元細胞亞群，是體現中樞神經抑制系統的主要標志，在控制該區神經元活動中起重要作用。該神經元細胞可以選擇性與周圍其他神經元細胞形成突觸，通過抑制這些神經元細胞活動調節其興奮性和活動性。海馬區PV陽性中間神經元細胞對于各種損害因素如持續慢性應激反應、缺血缺氧等非常敏感，容易受到損害[16]。而該神經元細胞損害可導致動物的認知功能損害，最近Koh等[17]通過氯胺酮誘導小鼠PV陽性細胞損害后，動物的認知功能出現明顯損害；也有研究表明，該類型細胞減少，導致的抑制降低同樣會影響海馬區錐體細胞的功能，損傷學習和記憶能力[18]。

DG對各種損害的耐受性高，可能SGZ存在可增生的神經干細胞有關，但本研究結果顯示，SAH引起DG區域 PV陽性中間神經元細胞也明顯減少，說明DG 中的PV陽性中間神經元細胞對有害反應抵抗能力較差。最近，Wei等[19]報道，癲癇可誘導 DG 中GABA能中間神經元細胞數量減少，并認為與神經元細胞的再生抑制有關，SAH引起PV陽性中間神經元細胞數量減少是否與抑制神經干細胞再生有關仍需進一步證實。

SAH引起中間神經元細胞損害的機制仍不清楚，SAH可引起氧化應激反應、炎癥反應等，引起海馬區細胞凋亡，或抑制神經元細胞再生等，導致該細胞數量明顯減少。我們課題組曾報道[4]，SAH后早期海馬區域局部興奮性氨基酸大量釋放和細胞Ca+超載等過度反應，可能是引起一系列神經損害如：自由基形成、細胞凋亡、炎性反應和各種損害基因表達等的啟動位點，也可能是導致PV陽性細胞數量減少原因之一。

綜上所述，本研究證實SAH可導致大鼠的長期認知功能損害，學習和記憶能力下降。SAH引起海馬CA1和DG區PV陽性神經元細胞減少可能與大鼠的認知功能損害有關，而SAH選擇性損害海馬CA1和DG區PV陽性神經元細胞的機制還有待于進一步深入研究。

[1]Al-Khindi T,Macdonald RL,Schweizer TA.Cognitive and functional outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage[J].Stroke,2010,41:e519-e536.

[2]Tosun C,Kurland DB,Mehta R,et al.Inhibition of the Sur1-Trpm4 channel reduces neuroinflammation and cognitive impairment in subarachnoid hemorrhage[J].Stroke,2013,44:3522-3528.

[3]Sheldon S,Macdonald RL,Cusimano M,et al.Long-term consequences of subarachnoid hemorrhage:examining working memory[J].J Neurol Sc,2013,332:145-147.

[4]張法永,毛仁玲,陳銜城.蛛網膜下腔出血誘導小鼠長期認知功能損害[J].中國臨床神經外科雜志,2010,7(4):183-186.

[5]Han SM,Wan H,Kudo G,et al.Molecular alterations in the hippocampus after experimental subarachnoid hemorrhage[J].J Cereb Blood Flow Metab,2014,34(1):108-117.

[6]Kaalund SS,Riise J,Broberg BV,et al.Differential expression of parvalbumin in neonatal phencyclidine-treated rats and socially isolated rats[J].J Neuroche,2013,124:548-587.

[7]Prunell GF,Mathiesen T,Svendgaard NA.A new experimental model in rats for study of the pathophysiology of subarachnoid hemorrhage[J].Neuroreport,2002,13:2553-2556.

[8]Williams CL,McGaugh JL.Enhancement of memory processing in an inhibitory avoidance and radial maze task by post-training infusion of bombesin into the nucleus tractus solitaries[J].Brain Res,1994,654:251-256.

[9]張法永,陳銜城,毛仁玲.低氧訓練對短暫腦缺血引起認知功能損害的保護作用[J].中風與神經疾病雜志,2008,25(2):155-157.

[10]吳瀚峰,張鈺,張法永.心肺體外循環后大鼠長期空間認知功能損害和海馬區微膠質細胞激活[J].中國臨床神經科學,2015，4:361-365.

[11]Han SR,Shin C,Park S,et al.expression of activating transcription factor-2 and c-Jun in the immature and adult rat hippocampus following lithium-pilocarpine induced status epilepticus[J].Yonsei Med J,2009,50(2):200-205.

[12]Bendel P,Koivisto T,Hanninen T,et al.Subarachnoid hemorrhage is followed by temporomesial volume loss:MRI volumetric study[J].Neurology,2006,67:575-582.

[13]Ouyang YB,Voloboueva LA,Xu LJ,et al.Selective dysfunction of hippocampal CA1astrocytes contributes to delayed neuronal damage after transient forebrain ischemia[J].J Neurosci,2007,27(16):4253-4260.

[14]Kesner RP.An analysis of the dentate gyrus function[J].Behav Brain Res,2013,254:1-7.

[15]Morris AM,ChurchwellJC,Kesner RP,et al.Selective lesions of the dentate gyrus produce disruptions in place learning for adjacent spatial locations[J].Neurobiol Learn Mem,2012,97:326-331.

[16]ZaletelI,Filipovi D,Puka N.Chronic stress,hippocampus and parvalbumin-positive interneurons:what do we know so far[J].Rev Neurosci,2016,ahead-of-print/revneuro-2015-0042.

[17]Koh MT,Shao Y,Sherwood A,et al.Impaired hippocampal-dependent memory and reduced parvalbumin-positive interneurons in a ketamine mouse model of schizophrenia[J].Schizophr Res,2016,S0920-9964(16):30023-30028.

[18]Yi F,Ball J,Stoll KE,et al.Direct excitation of parvalbumin-positive interneurons by M1 muscarinic acetylcholine receptors:roles in cellular excitability,inhibitory transmission and cognition[J].J Physiol,2014,592(16):3463-3494.

[19]Wei D,Yang F,Wang Y,et al.Degeneration and regeneration of GABAergic interneurons in the dentate gyrus of adult mice in experimental models of epilepsy[J].CNS Neurosci Ther,2015,21(1):52-60.

The study of long term dysfunction of cognition and its relationship with parvalbumin-postive interneurons at hippocampus in rats with subarachnoid hemorrhage

MAORenling,DUANYu,GAOXin,etal.

(DepartmentofNeurosurgery,HuadongHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China)

ObjectiveTo investigate the long-term cognitive impairment and the variation of parvalbumin-postive (PV) GABAergic interneurons following subarachnoid hemorrhage.MethodsThe Sprague-Dawley rats were randomly assigned to control,sham and SAH group.Twenty weeks later,the cognitive function was tested by 8-arm maze.Immunohistochemical study was used to detect PV-positive interneurons in hippocampus.ResultsCompared to the other two groups,SAH rats needed more days for training (P<0.05),that implied with the decreased ability in learning.In memorial test,all three groups had the same correct rate at the intervals of 1 h,12 h and 24 h,however,SAH rats showed a significant decrease at 2 h,3 h and 6 h (P<0.05).The number of PV-positive interneurons of SAH rats decreased significantly at CA1(P<0.01) and dentate gyrus (P<0.05).ConclusionSAH can cause long-term cognitive deficits in rats,which may cause by the decrease of PV-positive interneurons in CA1and DG.SAH leads to persist decrease some interneurons in hippocampus,which may be one of the key reasons for the long lasting cognitive impairment.

Subarachnoid hemorrhage;Cognitive impairment;Hippocampus;Parvalbumin-postive interneuron

1003-2754(2016)04-0292-04

2016-02-12；

2016-03-30

國家自然科學基金面上項目(No.81271296)

(1.復旦大學附屬華東醫院神經外科，上海 200040；2.加州大學圣地亞哥分校生物化學系細胞生物學專業，美國 加州 92093；3.復旦大學附屬華山醫院神經外科，上海 200040)

張法永，E-mail:zhangfayong66@sina.com

R743.35

A