姜黃素通過IGF-1/Akt/FoxO3a通路保護多巴胺能神經元細胞

鄭世茹，白宏英，程寶倉

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姜黃素通過IGF-1/Akt/FoxO3a通路保護多巴胺能神經元細胞

鄭世茹，白宏英，程寶倉

目的觀察姜黃素對魚藤酮致帕金森(PD)大鼠黑質多巴胺能神經元的保護作用及其機制。方法清潔級(SPF)雄性SD大鼠80只，隨機分為溶劑對照組(空白組)、姜黃素對照組(對照組)、魚藤酮模型組(模型組)、姜黃素治療組(治療組)，每組20只。空白組和對照組頸、背部皮下注射葵花油，其余兩組在相同部位注射魚藤酮建立帕金森模型，連續28 d，造模后觀察各組大鼠行為學改變并評分。此后對照組和治療組每天給予姜黃素灌胃，其余兩組等量二甲基亞砜灌胃，連續28 d，后將大鼠全部處死。采用原位雜交、免疫印跡(Western blot)法檢測黑質部IGF-1、Akt、FoxO3a的表達，采用免疫組化染色法檢測黑質部酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)陽性細胞數。結果模型組大鼠TH、IGF-1、磷酸化的Akt(p-Akt)、磷酸化的FoxO3a(p-FoxO3a)表達較空白組和姜黃素組顯著降低(P<0.05)；姜黃素治療組TH、IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a表達高于模型組(P<0.05)。結論姜黃素可抑制帕金森大鼠多巴胺能神經元凋亡，其抗凋亡機制可能與激活IGF-1/Akt/FoxO3a通路有關。

帕金森病；魚藤酮；細胞凋亡；姜黃素

近來研究發現魚藤酮可透過血腦屏障并抑制腦組織線粒體復合物Ⅰ的活性，使呼吸鏈功能缺陷、能量生成障礙引起細胞內環境紊亂以及引發脂質過氧化和大量自由基的產生、細胞內鈣超載，最終引起細胞凋亡，導致多巴胺能神經元變性缺失從而出現PD癥狀[1，2]。當Akt途徑被抑制時，FoxO3a去磷酸化，在細胞核內大量表達，調節不同的凋亡靶目標，導致細胞凋亡；而PI3K-Akt通路激活后，FoxO3a磷酸化，核內表達減少，神經細胞凋亡減少，表明FoxO3a的磷酸化受PI3K-Akt通路調節。IGF-1是該信號通路的上游調節因子[3,4]。目前國內外文獻對此信號通路在帕金森病中的研究較為少見。作者在建立魚藤酮致帕金森大鼠模型的基礎上通過觀察大鼠中腦黑質類胰島素一號增長因子(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、磷酸化的蛋白激酶B(PKB、又稱Akt)、磷酸化的FoxO3a(一種Forkhead轉錄因子O亞家族的同源蛋白)表達水平以及中腦黑質區酪氨酸羥化酶(throsine hydroxylase,TH)陽性細胞數的變化，并應用姜黃素干預后對其表達的影響，探討姜黃素可能的發揮多巴胺能神經元保護作用的分子機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及試劑清潔級健康雄性SD大鼠80只，體質量(200～220)g[山西醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(晉)20150001]。室溫(2 5±2) ℃飼養，自然光照。魚藤酮、姜黃素均購自美國 Sigma 公司，兔抗鼠IGF-1抗體、p-AKT抗體、p-Foxo3a抗體和TH抗體均購自美國Santa cruz公司。

1.2模型制備方法所有實驗動物適應性飼養5 d確認無異常后，80只隨機分為4組：空白組、對照組、模型組、治療組，每組20只。模型組與治療組大鼠采用頸背部皮下注射魚藤酮法(將1.5 mg/kg溶解于葵花油，濃度1.5 mg/ml)制備模型，1次/d，連續注射28 d[5]。空白組及對照組造模方法同模型組，但只單純注射等量葵花油。在造模28 d后的同一時間點，觀察大鼠異常形態及行為，并參照Chen[6]等的評分標準評分。行為學評分2分以上為造模成功，最后每組均以酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫組化法作組織學鑒定。對照組及治療組在造模成功24 h后予姜黃素(40 mg/kg/d)灌胃治療，1次/天，連續治療28 d。空白組與模型組同步每日等量二甲基亞砜灌胃，28 d后將大鼠全部處死。

1.3酪氨酸羥化酶免疫組化染色在最后1 d實驗結束24 h后，10%水合氯醛(35 mg/100 g體質量)大鼠腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注內固定，取腦，在冰盤上分離出中腦黑質；石蠟包埋切片，脫蠟、水化、抗原修復，PBS反復沖洗，加入封閉血清、一抗(1∶200)，4 ℃過夜；PBS沖洗，加二抗，PBS沖洗，滴加鏈霉卵白液，PBS沖洗，3-氨基-9-乙基卡唑(AEC)顯色，蘇木精染色，脫水，中性樹膠封片。陰性對照：以正常兔血清代替一抗。正常腦組織與魚藤酮損傷后腦組織對比后再次驗證了造模成功。

1.4免疫印跡(Western blot)檢測在最后1 d實驗結束24 h后，大鼠給予10%水合氯醛(35 mg/100 g體質量)腹腔注射麻醉，取腦，生理鹽水沖洗，在冰盤上快速分離出中腦黑質，-80 ℃保存。將腦組織剪碎，放于勻漿器中，加入蛋白裂解液，冰水勻漿裂解1 min，裂解液14000 r/min離心5 min；吸取上清液稀釋，加入緩沖液，混勻后在沸水浴中煮沸5 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，分別加入IGF-1(1∶1000)、p-Akt(1∶1000)、p-FoxO3a(1∶1000)抗體，4 ℃搖床低速搖動過夜孵育，緩沖液洗滌，加二抗(1∶4000)，37 ℃恒溫搖床上，低速搖動孵育45 min，緩沖液洗滌，ECL顯色，圖像分析。

2　結　果

2.1大鼠中腦黑質區IGF-1、Akt、FoxO3a的表達變化Western blot法檢測大鼠中腦黑質IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a的結果顯示，模型組IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a的表達較空白組和對照組均顯著降低(P<0.05);治療組IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a的表達較模型組均顯著升高(P<0.05)(見表1、圖1)。

2.2大鼠中腦黑質區陽性細胞數變化 免疫組化染色結果顯示，與空白組和姜黃素組相比，模型組大鼠中腦黑質區TH陽性細胞數顯著減少；經姜黃素治療后，與模型組相比，治療組大鼠中腦黑質區TH陽性細胞數顯著增加(見表2、圖2)。

表1　各組大鼠黑質區IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a的表達

與空白組、對照組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05

表2　各組大鼠黑質區TH陽性細胞數變化±s)

與空白組、對照組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05

1：空白組2：對照組3：模型組4：治療組

圖1Western-blot法測定各組大鼠黑質區IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a表達情況

A：空白組；B組：對照組　C組：模型組；D組：治療組

3　討　論

目前對PD病因和病理機制的認識在不斷深入，主要涉及遺傳因素、免疫炎癥反應、α-突觸核蛋白的集聚、氧化應激學說、鈣失衡、線粒體功能障礙、興奮性氨基酸學說和細胞凋亡等。研究證據顯示，神經毒性損毀作用在導致DA能神經元損傷中，細胞凋亡是重要形式[7，8]，凋亡蛋白caspase的激活是中腦黑質DA能神經元丟失的早期信號[9]。

PI3K/Akt通路是介導細胞存活的一條經典通路[10]。IGF-1可激動PI3K/Akt通路，活化的PI3K通過3-磷酰化磷酸肌醇酯和磷酸肌醇依賴性激酶(PDK)共同作用而激活Akt,活化的Akt可進一步激動促存活因子的轉錄從而抑制凋亡。研究發現，激活PKA和MAPK信號轉導通路，可以對DA能神經元凋亡產生有效的抑制作用；另一基因產物P13K/PKB信號轉導通路的磷酸化AKT水平保持持續穩定，則明顯增加DA能神經元的細胞活性[11,12]。FoxO3a是PI3K-Akt信號通路重要的下游轉錄因子，磷酸化的PI3K激活Akt，Akt直接磷酸化FoxO3a，使其與胞核內結構蛋白特異性結合，由細胞核轉運至細胞質，其介導的促凋亡過程得到抑制，從而促進細胞存活。

大量的研究證明,姜黃素具有抗氧化、抗炎、降血脂、抗腫瘤、以及對神經系統等多方面藥理作用，還因其具有多靶點作用途經以及毒性低、安全性好、不良反應小、藥源廣、價格低廉等潛在優勢，受到越來越多地重視。姜黃素可通過Bax/Bcl-2、NF-κB、ICAM-1、p38MAPK、JNK/SAPK和ERK1/2信號轉導通路等多種機制，調節中樞神經系統內多種信號級聯，發揮神經元細胞保護作用；但姜黃素是否能夠通過激活IGF-1/Akt/FoxO3a通路，最終減少DA能神經元的變性丟失，報道較少。

本實驗結果顯示，環境毒素魚藤酮在損傷黑質多巴胺能神經元的同時，抑制了大鼠黑質細胞P13K/PKB信號轉導途徑中的IGF-1、Akt、FoxO3a等多個關鍵分子的表達，并使酪氨酸羥化酶陽性細胞數顯著減少，提示IGF-1/Akt/FoxO3a信號通路轉導異常可能介導了模型大鼠黑質多巴胺能神經元的變性死亡；而姜黃素治療能增強模型大鼠黑質細胞P13K/PKB信號轉導通路中的IGF-1、Akt、FoxO3a的表達，并能減少模型大鼠黑質多巴胺能神經元數量的丟失；提示姜黃素可保持P13K/PKB信號轉導通路的磷酸化AKT水平持續穩定，明顯增加DA能神經元的細胞活性，抑制DA能神經元變性死亡。帕金森病是在多因素交互作用下通過線粒體功能障礙、細胞凋亡等多種機制最終導致DA神經元細胞的大量變性丟失。本研究以抑制細胞凋亡為切入點，探討姜黃素對DA神經元細胞的保護作用及作用機制，為姜黃素對帕金森病的治療研究以及如何提高中腦黑質IGF-1、Akt、FoxO3a的表達治療帕金森病提供了新的思路與途徑。

綜上所述,本研究結果表明姜黃素可對多巴胺能神經元細胞起保護作用，干預PD的發生和發展，其作用機制可能與其能提高黑質部IGF-1、Akt、FoxO3a的表達水平，通過該信號通路調控細胞凋亡參與組織細胞的發生和修復，減少多巴胺能神經元的變性丟失有關。然而,姜黃素如何通過IGF-1/Akt/FoxO3a信號轉導通路調控細胞凋亡還需要深入的研究證實。

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Curcumin prevents dopaminergic neurons through IGF-1/Akt/FoxO3a singaling pathway

ZHENGShiru，BAIHongying，CHENGBaocang.

(DepartmentofNeurology,TheSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China)

ObjectiveTo observe the protecetive effect of curcumin on substantia nigra dopaminergic neurons of rotenone-induced Parkinsin’s disease(PD) in SD rats and study their possible mechanism.Methods80 male SD mice under SPF condition with average body weight of 210 g were randomly allocated to four groups(n=20,each) of solvent control group(blank group)，curcumin control group(control group),rotenone-induced PD group(PD group)and curcumin treatment group(treatment group).Curcumin (1.5 mg/kg) (versus 1 ml sun-flower oil in blank group and control group) were subcutaneously injected in neck-back skin in PD group and treatment group in order to establish the model of PD.The preparation of model was given once day for continuous 28 days.After the model establishment,the ethology changes were observed and scored.Subsequently,the rats in control group and treatment group received daily curcumin(40 mg/kg) (versus same volume dimethyl sulfoxide in blank group and PD group) orally.The treatment was given once a day for continuous 28 days.All rats in four groups were sacrificed on 29th day.Their brain tissues were taken and tested.The expressions of IGF-1,Akt and FoxO3a proteins in substantia nigra tissues were measured by Western blotting.The changes of tyrosine hydroxylase (TH) positive cells in the substantia nigras were evaluated by immunohistochemical staining.ResultsThe expressions of TH,IGF-1,p-Akt and p-FoxO3a in substantia nigra tissues were significantly lower in model group than in blank group and control group(bothP<0.05).The expressions of TH,IGF-1,p-Akt and p-FoxO3a in substantia nigra tissues were significantly higher in treatment group than in model group (bothP<0.05).ConclusionsCrcumin can inhibit rotenone-induced apoptosis of dopaminergic neurons in rats．The anti-apoptotic mechanism might be associated with activation of IGF-1/Akt/FoxO3a signaling pathway.

Parkinson's disease；Rotenone；Apoptosis；Curcumin

1003-2754(2016)04-0299-04

2016-02-18；

2016-03-30

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(No.142300410461)

(鄭州大學第二附屬醫院神經內科，河南 鄭州 450014)

白宏英，E-mail：hybai@126.com

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