血管緊張素原基因AGT M235T多態性與腦白質疏松癥相關性研究

孫麗偉，周衛東，劉承浩，楊　芳，王　君，汪　琦，任　歆，尹曉明，曾慶玉

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血管緊張素原基因AGT M235T多態性與腦白質疏松癥相關性研究

孫麗偉1，周衛東1，劉承浩1，楊芳1，王君1，汪琦1，任歆1，尹曉明2，曾慶玉2

目的探討腎素血管緊張素原(angiotensinogen,AGT)M235T基因多態性與腦白質疏松癥(Leukoaraiosis,LA)的相關性。方法采用聚合酶鏈反應(PCR)及聚合酶鏈反應-限制片段長度多態性(PCR-RFLP)及Sequenom系統檢測,經頭部MRI確診的202例腦白質疏松癥患者及105例經MRI排除LA的正常對照者AGTM235T基因多態性。結果腦白質疏松癥患者AGTMT基因型及T等位基因頻率與對照組有明顯差異，兩組間TT基因型差異無統計學意義。結論AGT基因MT基因型和T等位基因可能與腦白質疏松癥的發病相關。

腦白質疏松癥；基因多態性；血管緊張素原；腦小血管病

腦白質疏松癥是腦小血管疾病的一種，其與認知障礙[1]、跌倒發作以及神經精神疾病[2,3]有密切關聯，還可增加腦卒中的風險，嚴重影響老年人的健康和生活質量。目前腦白質疏松癥的發病機制尚不明確，有研究提示腦白質疏松癥是一種多基因遺傳性疾病。RAS系統通過影響血管收縮、血壓調節、血栓形成和血管壁的損傷，最終可能導致腦血管疾病。研究發現，AGT基因多態性不僅與高血壓、冠心病密切相關,還參與缺血性腦損傷的病理生理過程。本研究應用PCR-RFLP技術檢測AGT M235T基因多態性在腦白質疏松癥患者及正常人群中的分布情況，來探討其與腦白質疏松癥的相關性。

1　材料與方法

1.1研究對象病例組于2013年3月-2015年6月本院神經內科收集的已確診的腦白質疏松癥患者202例，男73例，女129例，平均年齡(65.68±9.131)歲，來自同一地區，非1級親屬。入選標準：年齡在50～85歲之間，符合腦白質疏松癥的診斷標準，經頭部MRI掃描確診。LA診斷標準：雙側大腦皮質下白質、側腦室周圍及半卵圓中心的散在或者彌漫性病灶，T1呈等信號或低信號，T2和FLMR呈高信號，DWI呈低信號[4]。排除標準：癡呆、帕金森、嚴重的全身系統性疾病、腦出血、腦梗死、顱腦腫瘤及其他遺傳代謝性神經系統疾病病史等患者。對照組：同期本院通過招募的年齡在50～85歲,且經MRI排除LA的正常對照105例，男35例，女70例，平均年齡(59.66±6.83)歲。兩組人群的排除標準一致。由兩名神經內科醫師根據Fazekas視覺等級評分法[5]對所有LA患者分別進行評定，兩者評定結果不一致的再通過上級醫師驗證。Fazekas視覺等級評定標準：Fazekas 0級：無LA；Fazekas 1級：點狀或片狀病灶(單個病灶直徑≤9 mm,簇狀病灶﹤20 mm)；Fazekas 2級：病灶開始融合，但病灶之間并無橋狀連接(單個病灶直徑10～20 mm，簇狀病灶直徑>20 mm)；Fazekas 3級：單個或片狀融合病灶直徑≥20 mm。

1.2臨床資料本研究已獲得煤炭總醫院倫理委員會批準，所有受試者均已簽署知情同意書。兩組均采用統一調查表填寫內容：年齡、性別、高血壓、高脂血癥、糖尿病等相關病史，同時進行血常規、血脂、空腹血糖、肝腎功能及頸部血管彩超等檢查。

1.3試劑與方法

1.3.1基因組DNA提取采取所有受試者肘部靜脈血2 ml于紫帽管中，-20 ℃保存。嚴格按照DNA提取試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司提供)說明書上的步驟進行DNA提取。

1.3.2AGT引物在美國國立生物技術信息中心數據庫(NCBI)獲得AGT基因組序列，ID號：183。引物設計及合成在中國上海生工生物工程有限公司完成。上游引物序列(FF)：5’ACCCTGGCCTCTCTCTATCTG3’。下游引物序列(RR)：5’AGCCACTTCCCCACTTCTCAAG3’。上下游引物之間共577 bp。突變位點在379 bp位置處。

1.3.3采用PCR-RFLP技術行PCR擴增PCR擴增體系：10×buffer(含Mg2+)5 μl；2.5 mmol dNTP 2 μl；10 μmol上游引物1 μl；10 μmol下游引物1 μl；模板DNA 2 μl；TaqDNA聚合酶0.5 μl；加ddH2O至終體積為50 μl。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min，再以94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s的程序循環35次，最后在 72 ℃延伸5 min。PCR儀：YG96梯度PCR儀。擴增回收前凝膠圖像(見圖1)。

1.3.4擴增產物的純化選用瓊脂糖凝膠電泳法純化回收。瓊脂糖濃度為2%，取30 μl擴增產物加5 μl溴酚藍上樣，每排加一個Marker。電泳45 min，紫外分析儀下，將目的條帶切下，用膠回收試劑盒回收，得到30 μl左右的純化產物。取3 μl上樣檢測并記錄。電泳儀：雙穩定時電泳儀-DYY-8C(北京市六一儀器廠)；紫外分析儀：Biosens-SC-BO5(BioTop)。

1.3.5擴增產物的測序純化后檢測成功的樣本進行BDT反應。依次加入測序酶、buffer、引物和純化后的產物，行PCR儀擴增。擴增產物采用酒精純化法，純化后的產物加入HIDI混勻，上機(3730XL)測序。突變位點的測序圖(見圖2)。

1.4統計學方法采用SPSS 21.0 軟件，兩組間不同基因型比較和等位基因頻率比較采用χ2檢驗，相對風險率以優勢比(odds ratio,OR) 及其95% 可信區間(confidenceinterval,CI)表示。以P<0.05為差異有統計學意義。計量資料應用t檢驗，分類資料應用χ2檢驗。等級資料應用非參數檢驗。

2　結　果

2.1AGT基因多態性所有DNA樣本經上述PCR 和擴增產物測序后，應用Chromas 2軟件讀取擴增的AGT基因序列，可觀察到AGT基因突變的3種類型：無突變型MM型(見圖2)、純合突變型TT型(見圖3)、雜合突變型MT型(見圖4、圖5)。

2.2經Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗表明，LA組和對照組兩組AGT基因M235 T 多態性基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。

2.3LA組和對照組AGT 基因M235 T多態性和等位基因頻率比較(見表1)。LA組AGT基因MT基因型頻率(33.2%對21%；χ2=5.220，P=0.022)及T等位基因頻率(20.5%對13.33%；χ2=4.071，P=0.044)高于對照組，均P<0.05，差異有統計學意義。LA組AGT基因MM基因型頻率(63.4%對76.2%；χ2=5.220，P=0.022)顯著低于對照組，P<0.05，差異有統計學意義。兩組相比，MT+TT(突變型)與MM(無突變型)顯著性增高(χ2=5.209，P=0.023)P<0.05，差異有統計學意義。

2.4LA組與對照組的人口資料學及臨床指標的比較(見表2)。與對照組相比，LA組年齡(t=-6.504，P=0.00)、高血壓病(χ2=13.873，P=0.000)、冠心病(χ2=4.733，P=0.030)均P<0.05，顯著性差異有統計學意義，因此，年齡、高血壓病、冠心病可能是腦白質疏松癥的危險因素。

2.5將兩組可能危險因素進行Logistic多因素方差分析(見表3)，結果顯示年齡(OR=1.092；95%CI：1.054～1.130；P=0.000)、基因突變(OR=1.754；95%CI：1.064～2.890；P=0.028)高血壓(OR=2.019；95%CI：0.778～3.233；P=0.009)是LA的獨立危險因素。行協方差分析排除年齡混雜因素后，該基因突變仍然與LA有相關性(P=0.015,95%CI：0.661～0.838)。

2.6AGT M235T基因多態性在LA不同分級間的比較因TT基因型分布頻率較低，將TT基因型與MT基因型歸為同組進行統計分析。對基因未突變組(MM型)與突變組(MT+TT型)與不同LA分級行Spearman相關分析，結果顯示：相關系數r=0.145，P=0.011，P<0.05，提示基因突變與LA 嚴重程度顯著相關，且成正相關關系。AGT基因突變各基因型在LA不同分級間的分布(見表4)。

表1　LA組和對照組 AGT 基因 M235 T 多態性和等位基因頻率比較

與對照組比較*較*P<0.05

表2　LA組與對照組的人口資料學及臨床指標的比較

與對照組比較*較*P<0.05

表3　兩組間危險因素的Logistic回歸分析

與對照組比較*較*P<0.05

表4　AGT基因突變各基因型在LA不同分級間的分布

圖1　DNA目的片段凝膠圖像

圖2　無突變型MM型

(需觀察的突變位點如箭頭所示，FF序列為T堿基，RR序列為A堿基)

圖3純合突變型TT型(FF 突變處T堿基突變為C堿基，RR 突變處A堿基突變為G堿基)

圖4雜合突變型MT型(FF 突變處T堿基突變為C堿基，RR 序列無突變仍為A堿基)

圖5雜合突變型MT型(FF 序列無突變仍為T堿基，RR 序列：突變處A堿基突變為G堿基)

3　討　論

腦白質疏松癥，又名白質高信號(white matter hyperintensities,WMH)，是一種常見的神經影像學表現。研究提示LA是一種多基因遺傳性疾病，文獻報道其遺傳率從55%～80%不等[6]。AGT M235T基因位于人染色體1q42～q43，該基因結構上至少存在16個多態性位點，位于第2外顯子核苷酸第704 處胸腺嘧啶(T)被胞嘧啶(C)替代,最終導致編碼產物第235 位氨基酸由蛋氨酸Met 突變為蘇氨酸Thr，即 M235T，構成3種基因型：未突變型235MM、突變純合型235TT和突變雜合型235MT。

本研究結果表明LA組的MT基因型和T等位基因明顯高于對照組(P<0.05)，該結論體現了中國人群LA的AGT基因型分布特點及突變特征。國外一薈萃分析[7]，納入了van Rijn、Schmidt、Sierra等6個研究[8～10]，分析顯示AGT基因突變與LA無相關性，但該分析僅涉及歐、美洲一些國家，由于種族差異，該結論不能反映亞洲中國人群LA的AGT突變特點，且該薈萃分析樣本量小，尚需更多及更大樣本量研究來證實AGT基因突變與LA相關性問題。國內一薈萃分析[11]顯示AGT 235T突變型可增加亞洲人群缺血性卒中風險,與白種人無關。故推測AGT MT基因型與T等位基因可能參與LA的發生，其機制尚不清楚。Stephen等及Lanz JR等[12]推測T等位基因通過升高血漿中血管緊張素原水平，間接使血管緊張素Ⅱ水平升高，后者使小動脈平滑肌收縮和血管平滑肌細胞的增生、肥大及脂質沉積，影響血壓的同時可直接導致皮質下小血管硬化,繼而引起皮質下及深層白質缺血性改變。

本研究發現LA發生與年齡、高血壓病、冠心病等因素相關,年齡、高血壓、AGT基因突變是LA發生的獨立危險因素。Kuller和Grueter等的研究認為[13]，隨著年齡的增長，腦小血管危險因素如動脈粥樣硬化、頸動脈斑塊、高血壓等所致小動脈狹窄，而供應腦白質區域血管灌注壓下降時，易造成腦白質缺血改變。本研究中LA患者AGT M235T基因突變與高血壓病(MT基因型χ2=0.669，P=0.413；MT+TT基因型χ2=0.441，P=0.507)無相關性，故我們推測MT基因型可能是獨立于血壓高水平的LA的遺傳學危險因素。Amelia等[14]也得出一致的結論。而Sierra等25例LA研究[10]，未得出AGTMT與LA的關聯，可能因樣本量過小所致。

在本研究中，我們所選擇的是中國北京地區漢族人群，比較好的控制了遺傳異質性對研究結果產生的影響，且本研究所選正常對照病例均經MRI檢查，入排標準嚴格，樣本同質性較好，能夠比較真實的反映國人LA的遺傳危險因素，通過對LA易感基因的篩查,可以在傳統危險因素的檢測基礎上,更為準確地篩查LA發生的高危人群，從而采取針對性的預防及治療措施。

[1]Assareh A,Mather KA,Schofild PR,et al.The genetics of white matter lesions[J].CNS Neurosci Thrapeut,2011,17:525-540.

[2]Debette S,Markus HS.The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging:systematic review and meta-analysis[J].BMJ,2010,341:c3666.

[3]牛寶豐,周衛東,劉長春,等.椎-基底動脈系統短暫性腦缺血發作患者腦白質變性的危險因素研究[J].中國神經免疫學和神經病學雜志,2015,24(1):46-48.

[4]Smith EE.Leukoaraiosis and stroke[J].Stroke,2010,41:139-143.

[5]Prins ND,Scheltens P.White matter hyperintensities,cognitive impairment and dementia:an updat[J].Nat Rev Neurol,2015,11:157-165.

[6]Lin Q,Huang WQ,Tzeng CM,et al.Genetic associations of leukoaraiosis indicate pathophysiological mechanisms in white matterlesions etiology[J].Rev Neurosci,2015,26(3):343-358.

[7]Paternoster L,Chen WT,Sudlow Cathie LM,et al.Genetic determinants of white matter hyperintensities on brain scans[J].Stroke,2009,40:2020-2026.

[8]Van Rijn MJ E,Bos MJ,Isaacs A,et al.Polymorphisms of the renin-angiotensin system are associatedwith blood pressure,atherosclerosis and cerebral white matterpathology[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry,2007,78(10):1083-1087.

[9]Schmidt R,Schmidt H,Fazekas F,et al.Angiotensinogen polymorphism M235T,carotid atherosclerosis,and small-vessel disease-related cerebral abnormalities[J].Hypertension,2001,38:110-115.

[10]Sierra C,Coca A,Gamez-Angelats E,et al.Renin-angiotensin system genetic polymorphisms and cerebralwhite matter lesions in essential hypertension[J].Hypertension,2002,39:343-347.

[11]LiangBY,QinLL,Wei HJ,et al.AGT M235T polymorphisms and ischemic stroke risk:a meta-analysis[J].J Neurological Sci,2013,331:118-125.

[12]Lanz JR,Pereira AC,Leos PA,et al.Angiotensinogen M235T polymorphism isassociated with coronary artery disease severity[J].Clin Chim Acta,2005,362:176-181.

[13]Kuller LH,Margolis KL,Gaussoin SA,et al.Relationship of hypertension,blood pressure,and blood pressure control with white matter abnormalities in the Women’s Health Initiative Memory Study (WHIMS)-MRI trial[J].J Clin Hypertens,2010,12(3):203-212.

[14]Assareh AA,Mather KA,Crawford JD,et al.Renin-angiotensin system genetic polymorphisms and brain white matter lesions in older australians[J].Am J Hypertension,2014,27:1191-1198.

Association of the polymorphism of angiotensinogen gene M235T leukoaraiosis

SUNLiwei,ZHOUWeidong,LIUChenghao,etal.

(DepartmentofNeurology,ChinaMeitanGeneralHospital,Beijing100028,China)

ObjectiveTo study the relationship between polymorphisms of angiotensinogen AGT(M235T)gene and leukoaraiosis.MethodsA case control study was carried out using 202 cases of leukoaraiosis(LA group) and 105 cases of control.The M235T polymorphisms gene were determined by polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (PFLP) technique and sequenom system test.ResultsThere was a statistical difference in AGT MT genotypes and T alleles frequency between leukoaraiosis group and control subjects.The difference of AGT TT genotypes between the two groups had no statistical significance.ConclusionThe mutation of AGT MT genotypes and T alleles frequency may be associated with leukoaraiosis.

Leukoaraiosis;Gene polymorphism;Angiotensinogen;Cerebral small vessel disease

1003-2754(2016)04-0303-04

2016-02-13；

2016-03-30

首都衛生發展科研專項(No.2011-6011-01)

(1.煤炭總醫院神經內科，北京 100028；2.煤炭總醫院影像科，北京 100028)

周衛東，E-mail：mtzyyneuro@163.com

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