對羥基苯甲醛等3 種天麻成分對灰樹花胞外多糖生物合成的影響

吳彩云，吳天祥,2,，朱俊杰，劉 昕，趙群麗

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學食品科學工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025）

對羥基苯甲醛等3 種天麻成分對灰樹花胞外多糖生物合成的影響

吳彩云1，吳天祥1,2,*，朱俊杰1，劉 昕1，趙群麗1

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學食品科學工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025）

在灰樹花液體發酵體系中，分別添加不同量的天麻素、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛3 種天麻成分，分析這3 種成分對灰樹花菌體生長和胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）合成的影響，采用苯酚-硫酸法測定胞外多糖含量。結果表明：適宜質量濃度的這3 種天麻成分均能促進灰樹花菌體生長和胞外多糖的生物合成，其中對羥基苯甲醛添加量為0.15 g/L時效果最佳，并且略低于體積分數7%天麻醇提取物。動態分析0.15 g/L對羥基苯甲醛和7%天麻醇提取物對灰樹花EPS合成促進作用的結果表明：在整個發酵過程中，二者促進灰樹花EPS生物合成的效果基本一樣，并且從發酵第7天開始，二者的EPS產量均顯著高于空白組（P＜0.05）。采用高效液相色譜法動態測定發酵期間對羥基苯甲醛含量變化，結果表明：在發酵的第5天，對羥基苯甲醛基本被完全吸收，而此時灰樹花EPS開始大量積累。因此，灰樹花可利用對羥基苯甲醛來促進EPS的生物合成。

對羥基苯甲醛；天麻成分；灰樹花；胞外多糖

天麻為蘭科植物的干燥塊莖，主產于貴州、四川、云南及陜西等地[1]，是我國名貴的中藥材之一，其主要成分有天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛等[2-5]?；覙浠ǎ℅rifola frondosa），又名貝葉多孔菌，隸屬于擔子菌亞門（Basidiomycotina），多孔菌科（Polyporaceae），是一種營養豐富、生物活性物質含量高的藥（食）用真菌。灰樹花多糖具有抗腫瘤[6-7]、清除自由基[8-9]、抗艾滋病[10]、抗氧化[8,11-12]、提高成纖維細胞增殖及促進膠原蛋白合成[10]等生物活性。液體發酵培養是獲得藥用真菌多糖一種快速、高效、經濟的方法。為了最大量獲得胞外多糖（exopolysaccharide，EPS），在藥用真菌液體發酵體系中添加一定的刺激物，不僅能促進菌體細胞的生長，而且能增加次生代謝產物（如EPS）的生物合成[13]。Liu Gaoqiang等[14]在靈芝液體深層發酵體系中添加乙酸乙酯可顯著促進靈芝多糖的合成和菌體生長。Tang Yajie等[15]在靈芝EPS的生物合成及其相關活力的研究表明，乳糖可促進靈芝菌體生長和EPS合成。在灰樹花液體深層發酵過程中，Hsieh等[16-17]添加橄欖油、植物油，Cheng Huabing等[18]添加適量聚乙二醇，侯曉梅等[19]添加適量的白花蛇草、薏苡仁、連翹、黃芪等中藥，趙亮等[20]添加山藥、苦蕎均可以促進灰樹花細胞生長和EPS的生物合成。

本課題組承擔了國家自然科學基金項目“天麻提取物有效成分對灰樹花發酵的代謝影響及機理研究”課題，前期研究結果表明，在灰樹花液體發酵體系中添加天麻提取物可顯著促進灰樹花細胞生長和EPS的生物合成[21-25]。但是并不確定這種促進作用主要是灰樹花利用了哪種或者哪幾種天麻主要成分所產生的結果。因此，本實驗在灰樹花發酵體系中添加幾種不同質量濃度梯度的天麻主要成分（包括天麻素（gastrodin，GA）、對羥基苯甲醇（p-hydroxybenzyl alcohol，HA）及對羥基苯甲醛（p-hydroxylbenzaldehyde，HBA）），分析灰樹花利用這些成分促進菌體生長和EPS合成的情況，并與添加天麻醇提取物實驗組作比較，進一步分析單一天麻成分對灰樹花EPS合成的促進作用是否高于天麻醇提取物。傳統中藥中有效成分不清楚、作用機理不明確等原因是阻礙中藥現代化發展的關鍵，科學地闡述中藥成分對微生物發酵的影響，能有效避免傳統中藥制品“大、黑、多”的缺點。通過本研究可探明天麻醇提取物中對灰樹花EPS合成增效貢獻力最大的成分，闡明作用機理，從而有效避免中藥天麻的大量使用。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

灰樹花菌株5.404 中國普通微生物菌種保藏管理中心。

天麻 貴州省德江縣基地；天麻素、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛 美國Sigma公司；葡萄糖 天津市大茂化學試劑廠；蛋白胨 上海盛思生化科技有限公司；KH2PO4天津市福晨化學試劑廠；MgSO4g7H2O 天津市瑞金特化學品有限公司；無水乙醇 成都金山化學試劑有限公司；其余均為分析純。

1.2 儀器與設備

CP114電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；GZX-9070 MBE數顯鼓風干燥箱、BXM-30R立式滅菌鍋上海博訊實業有限公司醫療設備廠；TG2-16G低速離心機 上海安亭科學儀器廠；SW-CJ-1D凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司；Molecular Devices SPECTRA MAX 190酶標儀 昆明納瑞科技有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀及檢測器、UF-C18色譜柱 美國Agilent公司。

1.3 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g/L（切成1 cm3大小，沸水煮30 min后過濾取濾液）、葡萄糖20 g/L、蛋白胨2 g/L、瓊脂20 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L，pH值自然。

液體種子培養基：葡萄糖30 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏6 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH值自然。

發酵培養基：葡萄糖50 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母膏6 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L，pH值自然。

1.4 培養方法

1.4.1 斜面種子培養

于母種試管中切取黃豆粒大小的菌絲塊接于PDA斜面中部，置于25 ℃恒溫培養箱中，培養至菌絲長滿整個斜面。

1.4.2 液體種子培養

將培養好的斜面菌種用接種扒切取蠶豆大小顆粒，接種于液體種子培養基中，一支PDA斜面接種一瓶。250 mL三角錐形瓶裝液量100 mL、25 ℃、150 r/min搖床培養4～7 d，三角錐形瓶中應長出大量細小、均勻的菌絲球且菌液清亮為佳。

1.4.3 發酵培養

按5%的接種量接種，用移液槍量取液體種子，接種于發酵培養基中。250 mL三角錐形瓶裝液量為100 mL、25 ℃、150 r/min、搖床培養時間根據需要設定。

1.5 天麻醇提取液制備

天麻經洗凈、蒸煮、55 ℃烘干、粉碎，過80 目后備用。稱取50 g的天麻，加1 000 mL體積分數75%乙醇浸提48 h，過濾，減壓蒸去乙醇，再加50 mL的蒸餾水重溶，過濾，即1 g天麻可得1 mL的醇提液，醇提液用于灰樹花液體培養。

1.6 分析方法

1.6.1 生物量的測定[24]

灰樹花菌體生長以其生物量為指標。將發酵液濾紙過濾，蒸餾水沖洗菌絲體3 次，于60 ℃數顯鼓風干燥箱中烘干至恒質量，稱質量即得菌絲體生物量。

1.6.2 EPS產量測定[21]

取一定量發酵上清液，加入7 倍75%乙醇，于冰箱中靜置24 h，于4 000 r/min離心15 min，除去上清液后，用75%乙醇清洗沉淀3 次，然后將沉淀在60 ℃條件下烘干，加水溶解，采用苯酚-硫酸法[26]測定胞外多糖含量。

1.6.3 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測條件[3]

色譜柱為Agilent TC-C18（4.6 mmh250 mm，5 μm）；流動相A：1 g/L磷酸-水，流動相B：乙腈，梯度洗脫：0～35 min，3%～30%（V/V）乙腈；35～45 min，30%～70%乙腈。流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長221 nm。

1.7 統計方法

所有的實驗數據均使用SPSS 17.0軟件分析顯著性，用Origin 8.0軟件做圖表。

2 結果與分析

2.1 不同體積分數的天麻醇提取物對灰樹花生物量和EPS產量的影響

圖1 天麻醇提取物對灰樹花發酵液中生物量和EPS產量的影響Fig.1 Effect of addition of different amounts of R. gastrodiae extract on biomass and EPS production by Grifola frondosa in submerged culture

在灰樹花發酵體系中添加不同體積分數天麻醇提取物，發酵9 d后生物量和EPS產量如圖1所示，隨天麻醇提取物體積分數的增加，灰樹花生物量和EPS產量先增加至最大量后降低，這可能是因為高體積分數的天麻提取物對灰樹花生長具有一定的抑制作用進而使EPS產量有所降低，此結果與賀宗毅[24]和Wang Na[21]等的一致。當天麻醇提取物添加量為7%時，灰樹花生物量和EPS產量分別達最大值（2.196f0.034） g/L和（1.365f0.018） g/L，與空白組（不加天麻）相比，分別增加了110.1%和78.5%?；谇捌谘芯?，認為天麻醇提取物中必定存在某種或某幾種可促進灰樹花菌體生長和EPS生物合成的成分。因此，添加7%天麻醇提取物作為后期實驗的實驗組。

2.2 天麻醇提取物成分分析

表1 HPLC法測定天麻醇提取物中3 種成分的含量Table 1 Determination of three ingredients from 75%ethanol extract of R. gastrodiae by HPLC

由表1可知，天麻醇提取物滅菌后天麻素、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛的含量分別增加了128.90%、21.12%和15.36%。由于灰樹花液體發酵培養需經過高壓滅菌，因此以滅菌后天麻醇提取物中天麻素、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛的含量進行實驗。

2.3 7%天麻醇提取物和3 種天麻成分對灰樹花發酵液中生物量和EPS產量影響的比較

圖2 天麻醇提取物和3 種天麻成分對灰樹花發酵液中生物量和EPS產量影響的比較Fig.2 Comparative effect of addition of 7% of R. gastrodiae extract, GA， HA and HBA on biomass and EPS production by Grifola frondosa in submerged culture

以滅菌后7%天麻醇提取物中所含天麻素、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛進行實驗，并與7%天麻醇提取物作比較，分析對灰樹花發酵液中生物量和EPS產量的促進作用。在灰樹花發酵液中分別添加0.383 g/L的天麻素、0.685 g/L對羥基苯甲醇、0.106 g/L對羥基苯甲醛和7%天麻醇提取物，發酵9 d后各實驗組生物量和EPS產量如圖2所示。天麻實驗組的生物量和EPS產量最高并且顯著高于空白組、GA、HA實驗組，其次是HBA實驗組，其余3 個實驗組的產量相差不大。單獨添加3 種天麻成分中，對羥基苯甲醛促進灰樹花生物量和EPS產量的效果最佳，但這種促進作用仍低于天麻醇提取物，這很可能是由于所添加的3 種成分的質量濃度過小或者過大，并且對羥基苯甲醛可能是天麻醇提取物中促進灰樹花EPS生物合成貢獻力最大的成分。

2.4 3 種天麻成分對灰樹花發酵液中EPS合成的影響

圖3 3 種天麻成分對灰樹花發酵液中EPS合成的影響Fig.3 Comparative effect of addition of different amounts of GA， HA and HBA on EPS production by Grifola frondosa in submerged culture

為了分析這3 種天麻成分對灰樹花EPS生物合成的影響和確定最佳添加量，在灰樹花液體發酵體系中分別添加0.02～0.35 g/L的天麻素、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛，發酵9 d后灰樹花EPS結果如圖3所示。EPS產量隨3 種添加物質量濃度的增大先增加至最大值后降低，對羥基苯甲醛添加量在0.05～0.25 g/L時的EPS產量均高于其他實驗組。此外，與空白組（不加添加物）相比，天麻素質量濃度為0.25～0.35 g/L、對羥基苯甲醇質量濃度為0.15～0.30 g/L和對羥基苯甲醛質量濃度為0.05～0.30 g/L時均能顯著促進灰樹花EPS的生物合成（P＜0.05），其中對羥基苯甲醛添加量為0.15 g/L時對灰樹花EPS合成的促進作用效果最佳，EPS達最大值（2.251 1f0.037 8） g/L，增加了40.53%。因此，在所添加的這3 種天麻成分中，對羥基苯甲醛對灰樹花EPS生物合成的促進作用最大。這種促進作用是高于還是等于天麻醇提取物，后期實驗將進一步說明，后期實驗以0.15 g/L對羥基苯甲醛為實驗組。

2.5 7%天麻醇提取物和對羥基苯甲醛對EPS合成的比較

圖4 0.15 g/L對羥基苯甲醛和7%天麻醇提取物對EPS合成的比較Fig.4 Comparative effect of addition of 0.15 g/L HBA and 7% R. gastrodiae extract on EPS production

由圖4可知，對羥基苯甲醛和7%天麻醇提取物的EPS產量幾乎一樣，分別為1.674 4 g/L和1.696 8 g/L，并且均顯著高于空白組的1.340 5 g/L（P＜0.05）。因此，對羥基苯甲醛對灰樹花EPS生物合成的促進作用與7%天麻醇提取物的基本一樣。

2.6 灰樹花液體發酵過程中7%天麻醇提取物和對羥基苯甲醛對生物量和EPS合成影響的動態變化

圖5 天麻醇提取物和對羥基苯甲醛對灰樹花發酵過程中EPS產量（a）和生物量（b）影響的比較Fig.5 Comparative effect of addition of 0.15 g/L HBA and 7% R. gastrodiae extract on dynamic curves of biomass （b） and EPS production （a） during fermentation

由圖5可知，在整個發酵過程中，3 個組的生物量和EPS產量逐漸增加至最大值后趨于穩定。在發酵的0～5 d內，3 個組的生物量和EPS產量很低并且基本一樣；在發酵5～13 d，對羥基苯甲醛和天麻醇提取物的生物量和EPS產量分別快速增加至發酵第9天和第11天后趨于穩定，并且兩實驗組的生物量和EPS產量基本一樣，空白組生物量和EPS產量分別發酵至第7天和第9天后基本不再增加。這說明發酵第5天開始，灰樹花大量吸收營養物質和天麻成分來促進自身菌體生長和EPS的生物合成。此外，發酵第7天后，對羥基苯甲醛和7%天麻醇提取物的生物量和EPS產量均顯著高于空白組（P＜0.05）。再一次說明對羥基苯甲醛和7%天麻醇提取物可顯著促進灰樹花菌體生長和EPS的生物合成。

2.7 灰樹花液體發酵過程中對羥基苯甲醛吸收利用情況與生物量和EPS產量間的關系

圖6 灰樹花液體發酵過程中對羥基苯甲醛吸收利用情況與生物量和EPS產量間的關系Fig.6 Relationship between HBA utilization and either biomass or EPS production during fermentation

圖6為對羥基苯甲醛添加量為0.15 g/L時，灰樹花發酵液中對羥基苯甲醛含量、生物量和EPS產量隨發酵時間的動態變化情況，對羥基苯甲醛含量從發酵第3天開始大幅度減少至發酵第7天基本為零，而從發酵第5天開始，灰樹花生物量和EPS產量開始大量積累。這再次說明發酵第5天后，對羥基苯甲醛被灰樹花大量吸收用以促進菌體生長和EPS生物合成。

3 結 論

在灰樹花深層發酵體系中，添加適宜質量濃度的天麻成分（包括天麻素、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛）均能促進灰樹花菌體的生長和胞外多糖的生物合成，其中對羥基苯甲醛添加量為0.15 g/L時對灰樹花EPS合成的促進作用效果最佳，并且略低于7%天麻醇提取物。因此，灰樹花可利用對羥基苯甲醛來促進EPS的生物合成，對羥基苯甲醛是對灰樹花EPS產量增效作用最大的天麻成分。EPS合成酶是菌體分泌的一種誘導EPS產生的一類酶的總稱。王瓊[27]和張清麗[28]等的研究認為α-磷酸葡萄糖變位酶（α-phosphoglucomutase，α-PGM）、磷酸葡萄糖異構酶（phosphoglucose isomerase，PGI）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase）、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（dTDP-glucose pyrophosphorylase）等是EPS合成的關鍵酶。Xu Xiaobao等[22]的研究表明天麻提取物可提高α-PGM酶活力。本研究中對羥基苯甲醛對灰樹花EPS生物合成的促進作用與天麻醇提取物的基本一樣。這可能是在提高EPS合成的關鍵酶酶活力方面，對羥基苯甲醛的效果與天麻提取物基本一樣，但是二者具體提高哪種或者哪幾種EPS合成酶酶活力尚不清楚，需要作進一步研究。

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Effect of p-Hydroxylbenzaldehyde and Other Main Ingredients of Rhizoma gastrodiae on the Biosynthesis of Exopolysaccharide by Grifola frondosa in Submerged Culture

WU Caiyun1, WU Tianxiang1,2,*, ZHU Junjie1, LIU Xin1, ZHAO Qunli1
(1. School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. Research Center of Food Science and Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

To test the stimulatory effects of three ingredients of Rhizoma gastrodiae on the biosynthesis of exopolysaccharide (EPS) by Grifola frondosa in submerged culture, gastrodin (GA), p-hydroxybenzyl alcohol (HA) and p-hydroxylbenzaldehyde (HBA) were separately added at various concentrations into the culture medium. The EPS concentration in the culture supernatant was determined by phenol-sulphuric acid assay. The results showed that all three additives had an effective stimulatory effect on mycelial growth and EPS production. Among them, the addition of p-hydroxylbenzaldehyde at 0.15 g/L exhibited the best effect, although slightly inferior to 7% (V/V) of the 75% ethanol extract of R. gastrodiae. Furthermore, kinetic analysis suggested that the EPS production curves with 0.15 g/L p-hydroxybenzaldehyde and 7% (V/V) of the R. gastrodiae extract over the entire fermentation process were substantially same， producing significantly more EPS than the blank group from the 7thday onwards (P < 0.05). As determined by high performance liquid chromatography (HPLC), dynamic changes in the concentration of p-hydroxylbenzaldehyde during the fermentation process showed that on the 5thday, p-hydroxylbenzaldehyde was completely absorbed and EPS began to accumulate in large quantity. Therefore, Grifola frondosa could utilize p-hydroxylbenzaldehyde to promote the biosynthesis of EPS.

p-hydroxylbenzaldehyde; ingredients of Rhizoma gastrodiae; Grifola frondosa; exopolysaccharide

10.7506/spkx1002-6630-201607016

Q936

A

1002-6630（2016）07-0083-05

吳彩云, 吳天祥, 朱俊杰, 等. 對羥基苯甲醛等3 種天麻成分對灰樹花胞外多糖生物合成的影響[J]. 食品科學, 2016, 37(7): 83-87. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607016. http://www.spkx.net.cn

WU Caiyun, WU Tianxiang, ZHU Junjie, et al. Effect of p-hydroxylbenzaldehyde and other main ingredients of Rhizoma gastrodiae on the biosynthesis of exopolysaccharide by Grifola frondosa in submerged culture[J]. Food Science, 2016, 37(7): 83-87. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607016. http://www.spkx.net.cn

2015-04-24

國家自然科學基金地區科學基金項目（31460537）

吳彩云（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：1749753070@qq.com

*通信作者：吳天祥（1965—），男，教授，博士，研究方向為發酵工程與生物轉化。E-mail：ce.txwu@gzu.edu.cn