響應面法優化重組大腸桿菌全細胞合成D-苯基乳酸

王 穎，何 禾，胡發根，齊 斌，王立梅，朱益波,

（1.常熟理工學院 蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇 常熟 215500；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

響應面法優化重組大腸桿菌全細胞合成D-苯基乳酸

王 穎1,2，何 禾1，胡發根1，齊 斌1，王立梅1，朱益波1,*

（1.常熟理工學院 蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇 常熟 215500；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

研究利用重組大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）/pET-28a-ldhD全細胞生物轉化苯丙酮酸（phenylpyruvic acid，PPA）合成D-苯基乳酸（D-phenyllactic acid，D-PLA）的條件。通過Plackett-Burman試驗設計，從影響細胞轉化的6 種因素中篩選得出轉化溫度、底物濃度和磷酸鈉緩沖液pH值對底物PPA摩爾轉化率有顯著影響；采用Box-Behnken試驗設計和響應面優化，對該重組菌全細胞轉化合成D-PLA的條件進行了優化。最佳分批轉化條件：轉化溫度為38 ℃、底物濃度為42 mmol/L、磷酸鈉緩沖液pH 7.0、菌體質量濃度20 g/L、葡萄糖質量濃度20 g/L。在該條件下反應0.5 h，底物摩爾轉化率為65.32%。根據此最佳轉化條件，經4 h的間歇補加底物轉化獲得D-PLA最終濃度為119 mmol/L（19.75 g/L），生產率為4.94 g/（Lgh）。

D-苯基乳酸；苯丙酮酸；重組大腸桿菌；生物轉化；響應面優化

苯基乳酸（phenyllactic acid，PLA），即2-羥基-3-苯基丙酸，是一種小分子的天然防腐劑，存在于蜂蜜和乳酸菌的發酵產物中[1-3]。近年來，PLA作為一種新穎的天然抑菌物質，引起食品行業普遍關注[4]。PLA具有兩種手性對映異構體[5]，D-PLA和L-PLA，可以作為手性中間體廣泛應用于化工、醫藥和生物合成等領域[6]。大量研究表明，PLA具有廣譜而高效的抗菌活力，對引起食物腐敗的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌等多種微生物具有抑制作用[7-10]。PLA作為乳酸菌苯丙氨酸的代謝產物，對人體和動物細胞均無毒性[11-12]。此外，PLA具有水溶性和熱穩定性好、有效pH值范圍寬、使用方便等優點，有利于其未來在食品工業中的普遍應用[13]。

目前，PLA的制備方法有化學合成法、微生物發酵法和酶催化法。化學合成法雖然具有較高的生產效率，但存在合成過程復雜、大量使用有機溶劑、產物為內消旋混合物等缺點[14]。酶催化法存在酶分離純化過程繁瑣、酶穩定性差、轉化過程中需要添加昂貴的輔因子等問題，尚不能大規模應用。利用微生物法合成PLA具有條件溫和、底物轉化率高和產物光學純度高等優點，受到了相關研究者的重視。

已報道多種微生物具有催化苯丙酮酸（phenylpyruvic acid，PPA）合成PLA的能力，主要有真菌（Geotrichum candidum ATCC 204307[15]）、乳酸菌（Lactobacillus[16-19]、Enterococcus faecalis TH10[20]、Weissella cibaria FMF4B16[21]、Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ITMY30[22]）、丙酸菌（Propionibacterium jensenii DSMZ 20535、P. acidipropionici DSMZ 4900）[23]等。其中，乳酸脫氫酶是微生物合成PLA的一種關鍵酶，但由于微生物細胞內乳酸脫氫酶的表達受到嚴格調控，限制苯基乳酸合成[24]。因此，利用基因工程手段獲得高效過表達乳酸脫氫酶的重組菌是提高苯基乳酸產量的有效途徑。

在前期工作中，本實驗室從Lactobacillus pentosus中克隆得到了D-乳酸脫氫酶（D-lactate dehydrogenase，D-ldh）的編碼基因，并利用原核表達載體pET-28a（+）構建一株能夠高效表達D-ldh的基因工程菌E. coli BL21（DE3）/pET-28a-ldhD[24]。此重組菌具有較高的還原PPA生產PLA能力，但是對于底物的轉化率還需要進一步提高。

采用高效表達D-乳酸脫氫酶的微生物全細胞合成D-PLA，可避免酶的分離純化，保證酶的活性，無需添加輔因子，簡化后處理工序，縮短生產周期，保證產物光學純度。本研究擬在Plackett-Burman試驗的基礎上，采用響應面分析法對重組大腸桿菌E. coli BL21（DE3）/ pET-28a-ldhD全細胞合成D-PLA的反應條件進行優化，以期為進一步提高微生物合成PLA的生產率和底物轉化率提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-苯基乳酸和一水苯丙酮酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司。

酵母提取物和胰蛋白胨 英國Oxoid公司；卡那霉素 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 菌株和培養基

重組大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）/pET-28a-ldhD[24]為蘇州市食品生物技術重點實驗室保藏。

Luria-Bertani（LB）培養基：酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L。根據需要，在培養基中添加50 μg/mL的卡那霉素。

基礎全細胞轉化體系為含全細胞重組大腸桿菌20 g/L、葡萄糖20 g/L、苯丙酮酸鈉40 mmol/L和體積分數1%吐溫-80的磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）。

1.3 儀器與設備

CR22GⅡ高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；SC100水浴控制器 德國Thermo公司；CTO-20AC高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司；HZQ-F280恒溫振蕩培養箱 太倉市華美生化儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 重組大腸桿菌培養及D-PLA合成

菌體活化：從固體培養基上挑取E. coli BL21（DE3）/pET-28a-ldhD單菌落接種至裝有10 mL新鮮LB培養基（含50 μg/mL卡那霉素）的100 mL三角瓶中培養，37 ℃、200 r/min過夜培養。

重組菌誘導及D-PLA合成[24]：將活化好的重組菌E. coli BL21（DE3）/pET-28a-ldhD按1%的接種量接種至裝有100 mL新鮮LB培養基（含50 μg/mL卡那霉素）的500 mL三角瓶中，搖床轉速200 r/min、37 ℃培養至OD600nm值為1.2，加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）至0.2 mmol/L，25 ℃誘導4 h后，4 ℃、6 000 r/min離心10 min收集菌體。菌體用pH值為7.0的磷酸鈉緩沖液洗滌2 次，重懸于10 mL磷酸鈉緩沖液中，反應0.5 h后取樣用高效液相色譜檢測轉化產物D-PLA和底物PPA。

1.4.2 轉化液樣品制備

取500 μL轉化液于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液100 μL，與流動相按1∶9的體積比混合均勻，經0.22 μm濾膜過濾后用HPLC法檢測。轉化反應體系中的菌體濃度以OD600nm值表示。

1.4.3 高效液相色譜條件

色譜柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H；流動相為5.0 mmol/L稀硫酸；流速0.6 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積5.0 μL，檢測波長210 nm。

1.4.4 Plackett-Burman試驗優化

前期工作中，對此重組大腸桿菌全細胞轉化反應進行了初步研究，得到最佳誘導條件[25]：將過夜培養的種子培養液按1%的體積比接種至含100 mL新鮮LB培養基（含50 μg/mL卡那霉素）的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min，培養至OD600nm值為1.2時添加IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，25 ℃誘導4 h后收集菌體。此外，還對全細胞轉化條件的各影響因素進行了單因素試驗[25]，結果表明：磷酸鈉緩沖液pH 7.0、轉化溫度為37 ℃，底物濃度為40 mmol/L，菌體質量濃度為20 g/L時，D-PLA產量較高[25]。

為進一步優化全細胞轉化條件，利用Plackett-Burman試驗設計，選擇菌體質量濃度（X1）、轉化溫度（X2）、轉化時間（X4）、葡萄糖質量濃度（X5）、底物濃度（X7）和緩沖液pH值（X8）6 個因素，并設置X3和X6兩個空白作為誤差分析項。每個因素分別選取低（－1）和高（1）兩個水平，共12 個試驗組合，以全細胞轉化反應中PPA摩爾轉化率為響應值。

1.4.5 響應面分析法試驗設計

為了確定影響重組大腸桿菌全細胞轉化合成D-PLA的各參數的水平以及不同參數之間的交互作用，將PPA有效地轉化為產物，因此，在相同誘導條件[24]下，并且給定轉化反應時間為0.5 h、搖床轉速為200 r/min、菌體質量濃度為20 g/L和葡萄糖質量濃度為20 g/L，本試驗采用三因素三水平的Box-Behnken設計原理進行響應面試驗設計，以磷酸鈉緩沖液pH值、轉化溫度和底物濃度為自變量，通過Design-Expert軟件對試驗數據進行回歸分析，預測全細胞轉化過程的最佳反應條件。

1.4.6 PPA分批補料合成D-PLA

將過夜培養的種子培養液按1%的體積比接種至含100 mL新鮮LB培養基（含50 μg/mL卡那霉素）的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min，培養至OD600nm值為1.2時添加IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，25 ℃誘導4 h后收集菌體。將適量菌體懸浮于含1%吐溫-80和20 g/L葡萄糖的50 mL磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0），在250 mL三角瓶中37 ℃、200 r/min進行轉化反應。分別在0、0.5、1、1.5、2、3 h補加2 mol/L苯丙酮酸鈉母液1、1、0.75、0.75、0.5、0.5 mL。每次補料前后各取200 μL菌液經10 000 r/min、4 ℃離心2 min，上清進行PPA和D-PLA的濃度檢測，菌泥沉淀進行OD600nm值檢測。

1.4.7 PPA摩爾轉化率計算

PPA摩爾轉化率按如下公式計算。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗結果

Plackett-Burman試驗設計方案及結果見表1。每個處理重復3 次，取平均值為試驗結果。采用Design-Expert 8.0.6軟件處理試驗數據，比較各因素的F值和可信度，選擇可信度＞95%的因素作為顯著影響因素，采用Box-Behnken響應面法進行下一步試驗。

影響全細胞轉化合成D-PLA的因素有菌體濃度、轉化溫度、轉化時間、葡萄糖質量濃度、底物濃度，確定各影響因素水平，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行Plackett-Burman試驗設計，并對Plackett-Burman試驗結果進行方差分析，結果見表2。可知，轉化溫度、底物濃度和緩沖液pH值對PPA摩爾轉化率有顯著影響，采用響應面分析法中Box-Behnken設計法建立多元二次模型方程，對其關鍵因子進一步研究。

表1 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 1 Plackett-Burman design and experimental response obtained for PPA conversion efficiency

表2 Plackett-Burman試驗設計方差分析Table 2 Analysis of variance （ANOVA） of Plackett-Burman design

2.2 重組大腸桿菌全細胞轉化合成D-PLA的多元二次模型方程的建立

根據Plackett-Burman試驗設計結果進行Box-Behnken試驗設計，Box-Behnken試驗設計方案及結果見表3，列出了Box-Behnken試驗設計和結果，其中第13～17次試驗為5 次重復的中心點試驗，用于考察模型的誤差。以PPA摩爾轉化率為響應指標，利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3進行二次多元回歸擬合，結果見表4。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Box-Behnken design and experimental response obtained for PPA conversion efficiency

表4 Box-Behnken試驗結果方差分析Table 4 Analysis of variance （ANOVA） of regression equation

經二次多項回歸擬合后，得到以全細胞轉化反應中PPA摩爾轉化率為響應值（Y）的回歸方程預測模型為：Y=64.28+1.98A+2.17B－4.40C+0.41AB－0.23AC－0.95BC－10.62A2－10.78B2－7.00C2。

表4方差分析表明，對摩爾轉化率所建立的回歸模型達到顯著水平（P＜0.05），失擬項不顯著（P=0.345 0），回歸方程可用。各因素對摩爾轉化率影響大小順序：底物濃度＞轉化溫度＞緩沖液pH值。一次項C極顯著，二次項A2、B2、C2極顯著。回歸方程決定系數R2=0.976 1，說明該回歸方程擬合程度高，能準確地反映各因素與響應值之間的真實關系，可以用于分析和預測最佳全細胞轉化反應條件。

圖1 轉化溫度、底物PPA濃度和緩沖液pH值對摩爾轉化率影響的響應曲面圖Fig.1 Response surface plots for the effects of temperature， PPA concentration and phosphate buffer pH on PPA conversion efficiency

結合圖1和Design-Expert 8.0.6軟件分析得到的全細胞轉化反應最佳條件是磷酸鈉緩沖液pH7.05、轉化溫度37.59 ℃、底物濃度41.77 mmol/L，此時PPA摩爾轉化率為65.21%。考慮到實際操作的可行性，對預測反應條件進行如下修正：磷酸鈉緩沖液pH值為7.0、轉化溫度為38 ℃、底物濃度為42 mmol/L。

在以上優化條件下進行了4 次驗證實驗。驗證實驗結果平均值為65.32%，預測值與實驗值的相對偏差為0.17%。說明采用響應面優化全細胞轉化反應條件是可行的，為進一步提高底物利用效率提供了依據。

2.3 底物分批補料強化D-PLA合成

通過響應面試驗獲得最適轉化條件，在此條件的基礎上進行底物分批補料實驗（圖2）。經4 h轉化，D-PLA最終濃度為119 mmol/L，生產率達到4.94 g/（Lgh），平均摩爾轉化率達62.96%。相比Bacillus coagulans SDM[25]全細胞轉化合成PLA（轉化時間20 h，轉化率70%，產量37.3 g/L），此重組大腸桿菌在合成D-PLA的產量和轉化率上有所不足，但是在生產率上有顯著提高。

圖2 底物分批補料轉化生產D-PLA的時間曲線Fig.2 Time course of D-PLA production in fed-batch fermentation with intermittent PPA feeding

3 結 論

本研究通過Plackett-Burman試驗設計篩選出影響重組大腸桿菌全細胞轉化PPA合成D-PLA的關鍵因素，以二次多項數學模型的響應面法優化獲得分批最佳反應條件為：磷酸鈉緩沖液pH 7.0、轉化溫度38 ℃、底物濃度42 mmol/L，菌體質量濃度20 g/L、葡萄糖質量濃度20 g/L。在該條件下反應0.5 h，底物的分批摩爾轉化率為65.32%，較優化前提高了約9%。底物分批補料實驗獲得D-PLA最終濃度為119 mmol/L，即19.75 g/L，生產率達4.94 g/（Lgh），平均摩爾轉化率達62.96%，較優化前D-PLA產量提高了2.5 g/L，底物的平均摩爾轉化率提高了接近9%。底物轉化率和產物生產率較優化前均有顯著提高，為進一步提高D-PLA產量提供理論依據。

[1] DIEULEVEUX V， VANDERPYL D， CHATAUD J， et al. Purification and characterization of anti-Listeria compounds produced by Geotrichum candidum[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(2): 800-803.

[2] TUBEROSO C I, BIFULCO E, CABONI P, et al. Lumichrome and phenyllactic acid as chemical markers of thistle (Galactites tomentosa Moench) honey[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 59(1): 364-369. DOI:10.1021/jf1039074.

[3] LI Xingfeng, JIANG Bo, PAN Beibei. Biotransformation of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by growing and resting cells of a Lactobacillus sp.[J]. Biotechnology Letters, 2007, 29(4): 593-597. DOI:10.1007/s10529-006-9275-4.

[4] WANG J, YOO J, LEE J, et al. Effects of phenyllactic acid on production performance, egg quality parameters, and blood characteristics in laying hens[J]. The Journal of Applied Poultry Research, 2009, 18(2): 203-209. DOI:10.3382/japr.2008-00071.

[5] 賈江花. 乳酸脫氫酶的克隆表達及酶學性質的研究[D]. 無錫: 江南大學, 2009.

[6] WANG J, LEE J, YOO J, et al. Effects of phenyllactic acid on growth performance, intestinal microbiota, relative organ weight, blood characteristics, and meat quality of broiler chicks[J]. Poultry Science, 2010, 89(7): 1549-1555. DOI:10.3382/ps.2009-00235.

[7] DIEULEVEUX V, GUEGUEN M. Antimicrobial effects of D-3-phenyllactic acid on Listeria monocytogenes in TSB-YE medium, milk, and cheese[J]. Journal of Food Protection, 1998, 61(10): 1281-1285.

[8] DIEULEVEUX V, LEMARINIER S, GUEGUEN M. Antimicrobial spectrum and target site of D-3-phenyllactic acid[J]. International Journal of Food Microbiology, 1998, 40(3): 177-183. DOI:10.1016/ S0168-1605(98)00031-2.

[9] VALERIO F, LAVERMICOCCA P, PASCALE M, et al. Production of phenyllactic acid by lactic acid bacteria: an approach to the selection of strains contributing to food quality and preservation[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 233(2): 289-295. DOI:10.1111/j.1574-6968.2004.tb09494.x.

[10] LAVERMICOCCA P, VALERIO F, VISCONTI A. Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(1): 634-640. DOI:10.1128/AEM.69.1.634-640.2003.

[11] ALLEN K, MOLAN P, REID G. A survey of the antibacterial activity of some New Zealand honeys[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1991, 43(12): 817-822. DOI:10.1111/j.2042-7158.1991.tb03186.x.

[12] WILKINS A, LU Y, MOLAN P. Extractable organic substances from New Zealand unifloral manuka （Leptospermum scoparium) honeys[J]. Journal of Apicultural Research, 1993, 32(1): 3-9.

[13] 李興峰, 江波, 潘蓓蕾. 新型生物防腐劑: 苯乳酸在食品中的研究與應用[J]. 食品與發酵工業, 2007, 33(5): 87-91. DOI:10.3321/ j.issn:0253-990X.2007.05.022.

[14] 李遠頌. 生物合成R-3-苯基乳酸的研究[D]. 儋州: 華南熱帶農業大學, 2006.

[15] NAZ S, GUEGUEN M, CRETENET M, et al. Aromatic amino acids as precursors of antimicrobial metabolites in Geotrichum candidum[J]. FEMS Microbiology Letters, 2013, 344(1): 39-47. DOI:10.1111/1574-6968.12152.

[16] LAVERMICOCCA P， VALERIO F， EVIDENTE A， et al. Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(9): 4084-4090. DOI:10.1016/ S0038-0717(97)00088-6.

[17] STROM K, SJOGREN J, BROBERG A, et al. Lactobacillus plantarum MiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(L-Phe-LPro) and cyclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) and 3-phenyllactic acid[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(9): 4322-4327. DOI:10.1128/AEM.68.9.4322-4327.2002.

[18] WANG Haikuan, YAN Yanhua, WANG Jiaming, et al. Production and characterization of antifungal compounds produced by Lactobacillus plantarum IMAU10014[J]. PLoS ONE, 2012, 7(1): e29452. DOI:10.1371/journal.pone/oo29452.

[19] PREMA P, SMILA D, PALAVESAM A, et al. Production and characterization of an antifungal compound (3-phenyllactic acid) produced by Lactobacillus plantarum strain[J]. Food Bioprocess Technology, 2010, 3(3): 379-386. DOI:10.1007/s11947-008-0127-1.

[20] OHHIRA I, KUWAKI S, MORITA H, et al. Identification of 3-phenyllactic acid as a possible antibacterial substance produced by Enterococcus faecalis TH10[J]. Biocontrol Science, 2004, 9(3): 77-81. DOI:10.4265/bio.9.77.

[21] NDAGANO D, LAMOUREUX T, DORTU C, et al. Antifungal activity of 2 lactic acid bacteria of the Weissella genus isolated from food[J]. Journal of Food Science, 2011, 76(6): 305-311. DOI:10.1111/ j.1750-3841.2011.02257.x.

[22] VALERIO F, LACERMICOCCA P, PASCALE M, et al. Production of phenyllactic acid by lactic acid bacteria: an approach to the selection of strains contributing to food quality and preservation[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 233(2): 289-295. DOI:10.1016/ j.femsle.2004.02.020.

[23] LIND H, SJOGREN J, GOHIL S, et al. Antifungal compounds from cultures of dairy propionibacteria type strains[J]. FEMS Microbiology Letters, 2007, 271(2): 310-315. DOI:10.1111/j.1574-6968.2007.00730.x.

[24] 胡發根, 沈麗, 季華蘭, 等. 重組大腸桿菌全細胞合成苯基乳酸的研究[J]. 食品工業科技, 2015, 36(9): 149-151. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2015.09.024.

[25] ZHENG Zhaojuan, MA Cuiqing, GAO Chao, et al. Efficient conversion of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by using whole cells of Bacillus coagulans SDM[J]. PLoS ONE, 2011, 6(4): e19030. DOI:10.1007/s10529-015-1778-4.

Optimization of D-Phenyllactic Acid Production by Whole Cells of Recombinant Escherichia coli Using Response Surface Methodology

WANG Ying1,2, HE He1, HU Fagen1, QI Bin1, WANG Limei1, ZHU Yibo1,*
(1. Key Laboratory of Food and Biotechnology of Suzhou, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China; 2. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

The bioconversion conditions for the production of D-3-phenyllactic acid from phenylpyruvic acid (PPA) using whole cells of Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhD were studied. Using Plackett-Burman design, buffer pH, substrate concentration and temperature were selected as the factors with significant influence on substrate conversion efficiency out of 6 factors. Subsequently, the optimization of the three factors was carried out using Box-Behnken design and response surface analysis. Results indicated that the optimal bioconversion conditions that provided the maximum molar conversion efficiency of PPA （65.32%) during 30 min were buffer pH 7.0, substrate concentration 42 mmol/L, and temperature 38 ℃, cell concentration 20 g/L and glucose concentration 20 g/L. Under these conditions, 119 mmol/L (19.75 g/L) of D-PLA with a productivity of 4.94 g/(L·h) was obtained after 4 h transformation with intermittent PPA feeding.

D-phenyllactic acid; phenylpyruvic acid; recombinant Escherichia coli; biotransformation; response surface optimization

10.7506/spkx1002-6630-201607017

TS201.2

A

1002-6630（2016）07-0088-05

王穎, 何禾, 胡發根, 等. 響應面法優化重組大腸桿菌全細胞合成D-苯基乳酸[J]. 食品科學, 2016, 37(7): 88-92.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607017. http://www.spkx.net.cn

WANG Ying, HE He, HU Fagen, et al. Optimization of D-phenyllactic acid production by whole cells of recombinant Escherichia coli using response surface methodology[J]. Food Science, 2016, 37(7): 88-92. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607017. http://www.spkx.net.cn

2015-04-30

國家自然科學基金面上項目（31470092）；江蘇省自然科學基金青年基金項目（BK20130380）；江蘇省高校自然科學研究面上項目（13KJB550002）；江蘇省“六大高峰人才”資助計劃項目（NY-021）；蘇州市科技支撐計劃項目（SNG201354）；常熟市科技計劃項目（CN201412）；科技部農業科技成果轉化資金項目（2013GB2C100176）

王穎（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：278478330@qq.com

*通信作者：朱益波（1980—），男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：centuryrain@126.com