以滸苔為碳源的地衣芽孢桿菌發酵產蛋白酶條件優化

王 穎，高 翔，周 君，張春丹，李 曄，王祖忠，袁 貝，戴 娟，錢琴蓮，蘇秀榕,

（1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；2.浙江省喬司監獄，浙江 杭州 310019）

以滸苔為碳源的地衣芽孢桿菌發酵產蛋白酶條件優化

王 穎1，高 翔2，周 君1，張春丹1，李 曄1，王祖忠1，袁 貝1，戴 娟1，錢琴蓮1，蘇秀榕1,*

（1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；2.浙江省喬司監獄，浙江 杭州 310019）

為了優化地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）以滸苔（Enteromorpha prolifera）為碳源進行發酵產蛋白酶的能力，以蛋白酶比活力為指標，通過單因素試驗探討不同因素對產酶效率的影響，在此基礎上運用Plackett-Burman設計篩選出了3 個顯著因素：培養基初始pH值、滸苔添加量和NaH2PO4添加量。采用響應面法對這3 個顯著因素進行優化，得到最佳產酶條件為培養基初始pH 6.66、滸苔添加量4.65%、NaH2PO4添加量0.027 4%，此條件下蛋白酶比活力預測值為66 354.70 U/g pro，3 次實驗驗證值為66 966.37 U/g pro。驗證值與基礎發酵條件下的最大蛋白酶比活力18 206.16 U/g pro相比，提高了2.68 倍。

地衣芽孢桿菌；滸苔；發酵條件；蛋白酶；Plackett-Burman設計

近年來，隨著全球氣候變化和水體富營養化，赤潮、綠潮等頻頻暴發，嚴重影響了海洋及周邊的生態環境，威脅了養殖業和旅游業的發展[1]。滸苔（Enteromorpha prolifera）等綠潮在我國青島海域連續暴發，成為了全世界的研究熱點[2-5]。滸苔是一種繁殖迅速的大型綠藻，營養豐富，高膳食纖維、低脂肪，且富含維生素、礦物質等，滸苔干物質中碳水化合物含量為43.3%～60.2%，蛋白質含量為16.0%～22.1%，灰分含量為12.4%～18.7%[6]。碳水化合物是滸苔的主要成分[6]，利用滸苔作為發酵碳源，變廢為寶，是滸苔資源化利用的一個理想途徑。

蛋白酶是一種重要的工業酶制劑，在改善食品風味、提高食品品質等方面發揮著重要作用，是食品工業中應用最廣泛的酶[7-8]。本實驗室從經60Co輻照的東海香參中分離到一株能夠產堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[9]。與中性蛋白酶相比，堿性蛋白酶具有更強的水解能力和耐堿能力，有較強耐熱性且有一定的酯酶活力，更易于實現工業化生產[10]。地衣芽孢桿菌是目前堿性蛋白酶的主要生產菌株之一[11]，優化其發酵條件，提高其產酶能力，對工業擴大化生產具有重要意義。

本實驗以地衣芽孢桿菌為發酵菌株，研究不同因素對發酵產酶能力的影響，采用Plackett-Burman試驗設計篩選對發酵產酶有顯著效應的因素，以滸苔為碳源，運用響應面分析法（response surface method，RSM）優化發酵條件，旨在為地衣芽孢桿菌產蛋白酶工業擴大化生產和滸苔的資源化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滸苔 福建福清市海興保健食品有限公司。

Folin-酚試劑、酪氨酸標準品 美國Sigma公司；干酪素 北京市海淀區微生物培養基制品廠；其他化學試劑均為分析純。

1.2 菌種與培養基

地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）CGMCC 4323寧波市健康食品與海洋藥物重點實驗室分離、保藏。

種子斜面培養基：蛋白胨1.0%、牛肉膏0.3%、NaCl 0.5%、瓊脂粉2.0%，自然pH值。種子液體培養基中不加瓊脂粉。

基礎發酵培養基：蔗糖7.500%、干酪素3.000%、NaCl 0.500%、K2HPO4·3H2O 0.530%、NaH2PO4·2H2O 0.030%、Na2CO30.056%、MnSO40.002%，自然pH值。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

種子培養：將－80 ℃保藏菌種劃線接入種子斜面培養基，37 ℃靜置培養12 h后接一環于種子液體培養基，37 ℃、120 r/min搖瓶培養12 h。

發酵培養：按6%接種量接種液體種子于本實驗設置的不同發酵培養基中，37 ℃、120 r/min發酵培養36 h。

1.3.2 發酵條件的優化

在基礎發酵培養基水平上分別對碳源、氮源、金屬離子、初始pH值、接種量進行單因素優化。在單因素試驗基礎上進行試驗次數為12 次的Plackett-Burman篩選試驗，對滸苔添加量、酵母膏添加量、K2HPO4添加量、Na2CO3添加量、FeCl3添加量、NaH2PO4添加量、培養基初始pH值、接種量8 個因素進行研究，篩選出有顯著效應的關鍵因素。采用Box-Behnken原理設計對Plackett-Burman試驗篩選出的3 個關鍵因素：培養基初始pH值、滸苔添加量和NaH2PO4添加量進行響應面優化，以獲得較好的發酵條件。

1.3.3 分析方法

采用Folin-酚顯色法測定蛋白酶活力。蛋白酶活力單位定義為：在40 ℃、pH 10.0的條件下，1 min內水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需要的酶量為一個酶活力單位（U）。在本研究中，蛋白酶活力以酶比活力（U/g pro）表示。

菌體計數采用比濁計數法，以培養基為空白，測定OD560nm值。OD560nm值代表了菌體生物量，值越高表示菌體生物量越大。

1.4 數據處理

采用Design-Expert 8.0.6.1和SPSS 13.0進行數據分析，Origin 8.0軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 基礎發酵參數測定

在基礎發酵培養基水平上，接種6%液體種子，每6 h取樣，測定OD560nm、pH值和酶比活力，結果見圖1。種子發酵6 h后菌體生長進入對數期，30 h后進入穩定期，36 h后菌體開始衰亡自溶，進入衰亡期。發酵起始12 h，培養基pH值急劇下降到6.2，之后慢慢回升到6.7左右，36 h后pH值又開始下降。乳酸是地衣芽孢桿菌的主要代謝產物[12]，pH值在菌體生長對數期急劇下降，可能與有機酸的產生有關；之后回升可能是由于菌體的代謝途徑發生改變，有機酸在某些代謝途徑中被利用或者菌體自身生長調節機制造成的。前6 h不產蛋白酶，24 h后大量產酶且在36 h時達到最大值，酶比活力為18 206.16 U/g pro，之后隨著菌體的衰亡，pH值的下降，酶比活力也急劇下降。根據細胞生長與產酶的關系，可以把酶的生物合成模式分為同步合成、延續合成、中期合成和滯后合成4 種類型[13]。分析圖1中酶活力與細菌生長曲線發現，在地衣芽孢桿菌生長一段時間后堿性蛋白酶開始進行生物合成，并且當菌體生長進入穩定期后該酶還可以延續合成一段時間，因此可以推測地衣芽孢桿菌產堿性蛋白酶的生物合成屬于延續合成型，產物形成屬于部分生長偶聯型，這一結果與馬永強等[13]研究地衣芽孢桿菌2709產堿性蛋白酶發酵動力學獲得的結論一致。

圖1 蛋白酶發酵動力學曲線Fig.1 Kinetic curves of protease activity and pH during fermentation

2.2 單因素試驗優化結果

2.2.1 碳源添加量對發酵產酶的影響

在基礎發酵培養基水平上，以滸苔代替蔗糖作為碳源，滸苔添加量分別為2.5%、3.5%、4.5%、5.5%、6.5%、7.5%、8.5%、9.5%。滸苔添加量為4.5%時酶比活力最高，為53 469.64 U/g pro，與基礎發酵最大酶比活力18 206.16 U/g pro相比提高了1.94 倍（圖2），由此可見，滸苔比蔗糖更有利于地衣芽孢桿菌產蛋白酶。地衣芽孢桿菌產堿性蛋白酶的生物合成屬于延續合成型，這種生物合成類型能夠受到誘導物的誘導作用，而滸苔干物質中蛋白質的含量較高（16.00%～22.10%）[5]，因此滸苔可能對蛋白酶的合成起到了誘導作用。同時，滸苔中纖維素（13.30%）與半纖維素（28.01%）的含量較高[14]，推測該菌株地衣芽孢桿菌主要以滸苔中的纖維素、半纖維素物質作為碳源進行發酵產酶，其胞外酶可能含纖維素酶，但其酶活性、降解纖維素的能力及滸苔作為碳源的利用效率還有待研究。另外，滸苔中氨基酸含量豐富，為13.30%（以干樣計），且種類齊全，主要包括天冬氨酸（1.52%）、苯丙氨酸（0.71%）、賴氨酸（0.68%）、亮氨酸（1.22%）、異亮氨酸（0.58%）、蘇氨酸（0.75%）、絲氨酸（0.74%）、組氨酸（0.22%）等[15]。這些氨基酸對地衣芽孢桿菌的生長有明顯促進作用，尤其是賴氨酸，不僅有利于生長，而且具有特殊的刺激生長作用，可視為生長因子[12]，這也可能是滸苔作為碳源能夠大大提高地衣芽孢桿菌產酶的原因之一。

圖2 滸苔添加量對蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of E. prolifera concentration on protease activity

2.2.2 氮源對發酵產酶的影響

在基礎發酵培養基水平上，分別添加3%的干酪素、牛肉膏、酵母膏、大豆蛋白、明膠、尿素、硝酸銨和蛋白胨作為氮源。圖3a表明，不同氮源對產酶影響有較大差異，本實驗中有機氮源比無機氮源更利于發酵產酶，尤其添加酵母膏作為氮源時蛋白酶比活力最高，為48 583.78 U/g pro，其次是大豆分離蛋白、明膠和尿素，添加硝酸銨和蛋白胨時蛋白酶比活力為0 U/g pro。孫倩等[16]對地衣芽孢桿菌產堿性蛋白酶的研究表明，以豆粕和磷酸銨混合物作為氮源時酶活最高，有機氮源與無機氮源的組合可以更充分地為菌種提供營養物質。本研究僅對單一氮源的選擇進行了初步篩選，不同氮源組合的篩選有待研究。

進一步研究酵母膏添加量對發酵產酶的影響，酵母膏添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%。酵母膏添加量為4%時酶比活力最高，為57 699.15 U/g pro，與基礎發酵最大酶比活力18 206.16 U/g pro相比提高了2.17 倍（圖3b）。

圖3 不同氮源及酵母膏添加量對蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources and yeast extract concentration on protease activity

2.2.3 金屬離子對發酵產酶的影響

在基礎發酵培養基水平上，添加0.002%不同金屬離子。由圖4可知，添加Fe3+時酶比活力最高，為55 007.92 U/g pro，與基礎發酵最大酶比活力18 206.16 U/g pro相比提高了2.02 倍，其次是Li+和Ba2+，添加Mg2+酶比活力最低。這表明Fe3+對地衣芽孢桿菌產蛋白酶有促進作用。

圖4 不同金屬離子對蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of different metal ions on protease activity

2.2.4 初始pH值對發酵產酶的影響

在基礎發酵培養基水平上，調節培養基初始pH值為5、6、7、8、9、10、11、12。由圖5可知，初始pH值為7時酶比活力最高，為58 651.32 U/g pro，與基礎發酵最大酶比活力18 206.16 U/g pro相比提高了2.22 倍。pH值繼續增大時，酶比活力逐漸降低，說明在中性培養基條件下地衣芽孢桿菌產蛋白酶活力較高。這一結果與劉海進[17]、卜令軍[18]等在地衣芽孢桿菌產堿性蛋白酶培養條件優化中確定的初始pH值為6.5～7.5一致，說明中性培養基條件下能夠穩定維持菌體生長與產酶效率。

圖5 初始pH值對蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of initial medium pH on protease activity

2.2.5 接種量對發酵產酶的影響

圖6 接種量對蛋白酶活力的影響Fig.6 Effect of inoculum amount on protease activity

分別接種2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%的培養12 h種子培養基于基礎發酵培養基中。由圖6可知，接種量為12%時酶比活力最大，為57 854.18 U/g pro，與基礎發酵最大酶比活力18 206.16 U/g pro相比提高了2.18 倍。隨后蛋白酶比活力呈現下降趨勢，可能是因為接種量增大，菌體進入對數期時間較早，培養基中菌體含量過多，導致營養成分不能滿足菌體正常生長代謝，從而影響了產蛋白酶能力。

2.3 Plackett-Burman篩選試驗

Plackett-Burman試驗設計及響應值見表1。從顯著性檢驗結果（表2）可以看出，各影響因素的顯著性排序為：初始pH值＞滸苔添加量＞NaH2PO4添加量＞K2HPO4添加量＞FeCl3添加量＞接種量＞酵母膏添加量＞Na2CO3添加量。其中，初始pH值、滸苔添加量和NaH2PO4添加量對蛋白酶比活力的影響最為顯著。因此，選取這3 個關鍵因素進一步作響應面分析。其他因素根據單因素試驗和節約成本的原則，將其水平控制在較好水平。

表1 Plackett-Burman試驗設計與結果（n=8）Table 1 Plackett-Burman design with experimental values of protease activity （n= 8）

表2 回歸方程顯著性檢驗Table 2 Significance test of regression equation

2.4 響應面法優化發酵條件

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表3數據進行二次回歸分析，得到二次多元回歸模型為：

該方程表達了蛋白酶比活力（Y）與3 個自變量間X1、X2、X3的關系。回歸方程的一次項和平方項系數都較大，說明響應值與試驗因子之間并不是簡單的線性關系；而交互項系數較小，說明響應面分析所選3 個因素間的交互效應較小。變量的正系數表明該變量的正向變化可引起響應值的增加；負的二次項系數表明方程的拋物面開口向下，具有極大值點，能夠進行最優分析。

表3 響應面試驗設計方案與結果Table 3 RSM Design with experimental values of protease activity

表4 響應面試驗結果方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

回歸模型的方差分析見表4。決定系數R2為0.991 6，模型的P值小于0.01，說明該模型回歸方程極顯著，不同的試驗因子之間差異高度顯著，該試驗方法是可靠的。失擬項的P值為0.947 2＞0.05，差異不顯著，表明回歸模型擬合程度較好，可用于試驗分析和預測。

響應面三維圖是回歸方程的圖形表述，可從圖中直觀快速地找到最佳參數、參數之間的相互作用以及最大的響應值[19]，從圖7上可以形象地看出各因素交互作用對響應值的影響。隨著初始pH值的提高、滸苔添加量的增加、NaH2PO4添加量的增加，蛋白酶比活力都呈現出先升后降的趨勢。響應面曲面坡度陡峭，表明各因素對酶活力的影響較大；等高線呈現橢圓型，各圖的兩因素交互作用明顯。結果表明在中心點附近存在最大響應值。

圖7 初始pH值、滸苔添加量、NaH2PO4添加量3 個因素間交互作用的響應面圖Fig.7 Response surface plots for the effects of initial medium pH，Enteromorpha prolifera concentration and NaH2PO4concentration on protease activity

對二次回歸方程求解，當響應值Y最大時各因素的水平分別為X1=－0.17、X2=0.14、X3=－0.13，轉換后得最佳發酵條件為初始pH 6.66、滸苔添加量4.65%、NaH2PO4添加量0.027 4%，此條件下的理論預測蛋白酶比活力為66 354.70 U/g pro。為檢驗實驗的可靠性，按照最優條件進行3 次實驗驗證，實際測得的蛋白酶比活力平均值為66 966.37 U/g pro，與理論預測值相比，相對誤差為0.9%。說明采用響應面法優化得到的發酵條件參數準確可靠，具有實用價值。

3 結 論

本研究通過單因素試驗、Plackett-Burman設計和響應面法相結合，確定了地衣芽孢桿菌發酵滸苔產堿性蛋白酶的最佳條件為初始pH 6.66、滸苔添加量4.65%、NaH2PO4添加量0.027 4%，此條件下的蛋白酶比活力預測值為 66 354.70 U/g pro，3 次實驗驗證平均值為 66 966.37 U/g pro，驗證值與預測值基本相符，且與基礎發酵最大蛋白酶比活力18 206.16 U/g pro相比，驗證值提高了2.68 倍，地衣芽孢桿菌的產酶能力得到了顯著提高。

很多研究表明，滸苔含有生物活性物質，具有顯著的藥理活性，如降血脂[20-21]、抗氧化[21-22]、提高免疫力[22-24]和抑制皮膚癌[25]等。本研究在獲得蛋白酶的同時還獲得了主要成分為滸苔殘渣和地衣芽孢桿菌的發酵副產物，若能夠對副產物的具體成分進行分析并充分發掘其生理功能，尋求提高其高值綜合利用途徑，將大大提高經濟效益，并更好地服務于創建資源節約型社會，因此，發酵副產物的成分及生理活性功能也值得今后進一步探討研究。

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Optimization of Fermentation Conditions for Protease Production by Bacillus licheniformis with Enteromorpha prolifera as Carbon Source

WANG Ying1, GAO Xiang2, ZHOU Jun1, ZHANG Chundan1, LI Ye1, WANG Zuzhong1, YUAN Bei1, DAI Juan1, QIAN Qinlian1, SU Xiurong1,*
(1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Qiaosi Prison in Zhejiang, Hangzhou 310019, China)

This work reports on the selection and optimization of culture conditions and medium components as well as their levels for improved production of protease by Bacillus licheniformis with Enteromorpha prolifera as a carbon source by the combined use of single factor method, Plackett-Burman design and response surface methodology (RSM). Initial medium pH, Enteromorpha prolifera concentration and NaH2PO4concentration were identified as the most significant factors that influence protease production. The levels of the three factors were optimized using RSM to be 6.66， 4.65% and 0.027 4%, respectively. Under the optimized conditions, the predicted values of protease activity was 66 354.70 U/g protein and an average value of 66 966.37 U/g protein was obtained from three replicate experiments, which was 3.68 times higher than that before optimization.

Bacillus licheniformis; Enteromorpha prolifera; fermentation conditions; protease; Plackett-Burman design

10.7506/spkx1002-6630-201607022

Q939.9

A

1002-6630（2016）07-0117-06

王穎, 高翔, 周君, 等. 以滸苔為碳源的地衣芽孢桿菌發酵產蛋白酶條件優化[J]. 食品科學, 2016, 37(7): 117-122.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607022. http://www.spkx.net.cn

WANG Ying, GAO Xiang, ZHOU Jun, et al. Optimization of fermentation conditions for protease production by Bacillus licheniformis with Enteromorpha prolifera as carbon source[J]. Food Science, 2016, 37(7): 117-122. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607022. http://www.spkx.net.cn

2015-10-01

國家科技星火計劃項目（2010GA701063）；浙江省重點社會發展項目（2009C03017-1）

王穎（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：plyinger@126.com

*通信作者：蘇秀榕（1956—），女，教授，博士，研究方向為食品科學與工程/生化與分子生物學。E-mail：suxiurong@nbu.edu.cn