D-乳糖醇代替異丙基-β-D-巰基半乳糖苷對重組蛋白誘導表達的影響

畢云楓，姜仁鳳，何 舒，任大勇，徐琳琳，沈明浩

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

D-乳糖醇代替異丙基-β-D-巰基半乳糖苷對重組蛋白誘導表達的影響

畢云楓，姜仁鳳，何 舒，任大勇，徐琳琳，沈明浩*

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

目的：用D-乳糖醇代替異丙基-β-D-巰基半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）作為誘導劑，誘導重組葡萄糖苷酶的表達。方法：首先通過單因素試驗探討D-乳糖醇濃度、誘導時間及誘導溫度對重組葡萄糖苷酶表達的影響，從而確定最佳影響因素的水平值，然后在單因素試驗的基礎上采用三因素三水平的響應面法對重組葡萄糖苷酶表達進行優化分析，依據回歸分析方法確定最佳誘導工藝條件。結果：最佳誘導工藝條件為D-乳糖醇的誘導終濃度1.0 mmol/L、誘導時間7.0 h、誘導溫度34 ℃。結論：D-乳糖醇可以代替IPTG作為一種高效的lac及其衍生物的啟動子基因工程重組蛋白的理想誘導劑。

α-葡萄糖苷酶；誘導；響應面；D-乳糖醇

異丙基-β-D-巰基半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG），是一種高效的lac及其衍生物的啟動子誘導劑，是β-半乳糖苷酶的活性誘導物質。它可以直接進入大腸桿菌細胞內部，發揮誘導作用，使蛋白構象變化，導致阻遏蛋白與O序列解離、發生轉錄，從而發揮誘導作用。IPTG是一種非代謝性的誘導物，不會被菌體所消耗，只需要極少量的存在就能穩定地誘導乳糖啟動子的轉錄[1]。但其具有潛在的毒性，對菌體生長有一定的抑制作用，且價格較昂貴[2-3]。而乳糖是一種二糖，沒有毒性，具有天然誘導乳糖操縱子的作用，但乳糖本身作為一種碳源可以被菌體代謝利用，因此需要不斷地向培養基中加入乳糖，因而對于菌體的生理及代謝也有一定程度的影響[4]。另外，乳糖需要借助于乳糖透過酶（permase）的作用進入細胞，然后經過β-半乳糖苷酶的作用轉化為異乳糖（allolactose）才能起到誘導劑的作用[5]。同IPTG相比，乳糖作為誘導劑對于乳糖操縱子的誘導調控過程更為復雜[6-7]。雖然乳糖誘導重組蛋白表達的應用研究有較多報道[8-10]，但很多都表明乳糖誘導效果不及IPTG。所以李攀峰等[11]在2014年進一步研究了IPTG與乳糖聯合誘導表達的優化，但誘導表達效果也不及單獨使用IPTG誘導。目前國內外對重組菌誘導劑研究最多的也只有IPTG和乳糖[12-15]，而它們本身及在誘導過程中存在很多缺點，因此，尋找一種更適宜的替代物非常有必要。

由于D-乳糖醇（4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖醇）化學結構與IPTG相似，極易溶于水，微溶于乙醇，同時穩定性較強，在酸、堿、光照及高溫條件下仍能保持穩定性，安全性較高，當前作為一種食品添加劑應用于食品工業；其次，價格便宜、來源廣泛。所以本研究以D-乳糖醇為誘導劑來誘導重組α-葡萄糖苷酶的表達。響應面分析法由Box及其合作者于20世紀50年代提出并逐步完善，它以回歸方程作為函數估算的工具，將多因子試驗中因素與試驗結果的關系用多項式擬合，將因子與實驗結果的關系函數化[16-18]，因此，本研究將探討各因子與響應面值之間、因子與因子之間的相互關系，并進行優化。本實驗將利用α-葡萄糖苷酶轉化進大腸桿菌中進行體外表達后的重組酶，研究通過D-乳糖醇作為誘導劑誘導α-葡萄糖苷酶在大腸桿菌中的高效表達，并利用響應面法對D-乳糖醇誘導條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 菌種

按文獻[19]的方法將新阿波羅棲熱袍菌（Thermotoga neapolitana DSM 4359）α-葡萄糖苷酶基因（注冊號為lcl2740）連接到pET-28a（+）質粒載體，轉化進大腸桿菌BL21（DE3），－80 ℃凍存。此工程菌為卡那霉素抗性。

1.2 試劑與儀器

胰蛋白胨（tryptone）和酵母提取物（yeast extract）英國Oxoid公司；硫酸卡那霉素（Kan） 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；葡萄糖測定試劑盒 上海榮盛生物藥業有限公司；海藻糖 美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

JYP2-II超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；島津1800紫外分光光度計 日本島津公司。

1.3 LB培養基的制備

LB液體培養基的配制：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，用1 mmol/L的NaOH調節pH值至7.0，于121 ℃滅菌20 min后備用。LB固體培養基的制備：在液體培養基的基礎上加入2 g/100 mL的瓊脂，于121 ℃滅菌20 min后，倒入平板。

1.4 菌種的活化及擴培

取保存于－80 ℃的工程菌在LB固體培養基劃線，37 ℃恒溫箱過夜培養。然后取活化的工程菌，挑取單菌落于液體培養基中，200 r/min、37 ℃過夜振蕩培養。

1.5 工程菌的生長曲線

用LB液體培養基培養工程菌，每隔1 h取樣用分光光度法測定菌體生長的OD600nm值。以工程菌菌液培養的時間為橫坐標，以各時間點所測得菌液平均OD600nm值為縱坐標，繪制工程菌的生長曲線。

1.6 D-乳糖醇誘導表達

1.6.1 工程菌最適誘導濃度的確定

在工程菌生長的菌液OD600nm值為0.4～0.6時，分別加入不同濃度的D-乳糖醇，使其終濃度分別達到0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L，然后在32 ℃振蕩培養，誘導6 h。通過相對酶活力的測定，確定最適的誘導濃度。

1.6.2 最適誘導時間的確定

在工程菌生長的菌液OD600nm值達到0.4～0.6時，加入最適濃度的誘導物，在32 ℃分別誘導培養4、5、6、7、8 h。通過相對酶活力的測定，確定最適的誘導時間。

1.6.3 最適誘導溫度的確定

在工程菌生長的菌液OD600nm值達到0.4～0.6時，加入最適誘導物，在最適的誘導時間下，分別在30、32、34、36、38 ℃誘導培養。通過相對酶活力的測定，確定最適的誘導溫度。以上測定值都做3 個平行樣。

1.6.4 α-葡萄糖苷酶的提取及活力測定

誘導后的菌液經7 000hg離心5 min，取離心后菌體沉淀3～4 次反復凍融后，用pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液溶解并超聲波破碎，然后經12 000hg離心機離心取上清液，得粗酶液。酶活力測定的反應體系為：60 μL pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液、20 μL終濃度為5 mmol/L海藻糖為底物和20 μL粗酶液均勻混合，60 ℃水浴2 h。依據葡萄糖測定試劑盒測酶活力，計算相對酶活力。酶活力單位定義：在上述條件下，每分鐘產生1 μmol葡萄糖所需要的酶量。相對酶活力是與最大酶活力的比值，并定義最大酶活力為100%。

1.7 響應面法試驗設計

在單因素試驗基礎上，運用Design-Expert統計軟件，以誘導劑D-乳糖醇濃度（A）、誘導時間（B）、誘導溫度（C）為主要考察因素，相對酶活力為響應值（Y），進行三因素三水平的響應面試驗分析。

1.8 D-乳糖醇與IPTG誘導表達[20-21]

在工程菌生長的菌液OD600nm值達到0.4～0.6時，分別加入最適誘導濃度1.0 mmol/L的D-乳糖醇在34 ℃條件下誘導7 h，和0.8 mmol/L的IPTG在30 ℃誘導4 h，誘導重組α-葡萄糖苷酶的表達。

2 結果與分析

2.1 工程菌的生長曲線

圖1 工程菌生長曲線Fig.1 Growth curve of the engineered strain

由圖1可知，工程菌在0～2 h為遲緩期，工程菌適應新環境，生長速率緩慢；3～6 h為對數生長時期，此時營養物質較充分，工程菌呈對數快速增長；7～9 h為穩定期，由于培養基中的營養物質不斷地被消耗，工程菌新陳代謝產生的毒性物質的積累等因素的影響，工程菌生長速率逐漸下降，而死亡的細菌開始逐漸增加，增殖數與死亡數漸漸趨于平衡，細菌總數處于穩定狀態；10 h后為衰亡期，營養物質減少，衰亡速率超過增長速率，細菌總數呈下降趨勢。

2.2 單因素試驗結果

圖2D-乳糖醇濃度對α-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.2 Effect of lactitol concentration on α-glucosidase activity

由圖2可知，在D-乳糖醇在0.4～1.0 mmol/L濃度范圍內，相對酶活力隨濃度的增加而不斷升高，1.0 mmol/L時相對酶活力最大，所以確定最佳誘導濃度為1.0 mmol/L。當濃度繼續增大時，相對酶活力反而下降。說明工程菌對D-乳糖醇的誘導效應是十分敏感的，較低的濃度即能啟動目的基因高效的表達，而高濃度反而抑制酶的表達。

圖3 誘導時間對α-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.3 Effect of induction time on α-glucosidase activity

由圖3可知，誘導時間在4～7 h范圍內，相對酶活力隨時間的延長而不斷增加，7 h時相對酶活力最大，當誘導時間繼續增加時，相對酶活力卻下降。由于誘導時間越長目的基因的表達量越多，就越容易形成包涵體[22]，從而導致相對酶活力下降。故選擇7 h為最佳誘導時間。

圖4 誘導溫度對α-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.4 Effect of induction temperature on α-glucosidase activity

由圖4可知，誘導溫度在30～34 ℃范圍內，相對酶活力隨溫度的增加而不斷增加，34 ℃時相對酶活力最大，當溫度繼續增加時，相對酶活力急劇下降。誘導溫度為34 ℃時目的基因表達量最高。這是由于溫度較低時，菌體生長速率和反應速率較慢，從而增加外源蛋白的正確組裝和折疊，更多地形成可溶性的、有活性的產物[23]。

2.3 響應面試驗結果分析

在單因素試驗結果的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計，根據三因素三水平方式分別進行17 組試驗，其中12 個為析因試驗，5 個為中心試驗以估計誤差。結果見表1。

表1 響應面試驗設計與結果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

根據表1中Box-Behnken設計的試驗結果，運用Design-Expert軟件對表中結果進行二次回歸分析，得到二次回歸方程：Y=－263.488+107.333A+4.065B+16.063C+0.542AB－0.218AC+0.175BC－47.169A2－1.024B2－0.228C2。

回歸方程二次項A2、B2、C2的系數均為負數，說明回歸方程存在穩定點，即最大值點。回歸方程的分析結果和回歸方程方差分析結果分別見表2、3。

表2 回歸模型分析結果Table 2 Significance test of all coefficients in regression model

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由表2、3可知，模型P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著。方程中除AB、AC、BC交互項不顯著外，C為顯著，其他各項對Y相對酶活力影響都是極顯著。分析結果同時也表明試驗因素對響應值不是簡單的線性關系，二次項對響應值也有很大的影響[24-26]。模型的復相關系數R2=0.964 6，表明96.46%的實驗數據可用該模型進行解釋，說明方程擬合較好，可靠性較高。變異系數值越低，顯示實驗穩定性越好，本實驗變異系數達到0.33%，較低，說明試驗點數據的這種擬合方法合理、可靠。

2.4 響應面各因素間的交互作用

根據表2的回歸模型分析可知，3 個因素對酶活力均具有顯著影響。在保持1 個因素為最優條件下，其他2 個因素與響應值關系用三維坐標圖表示，可以直觀反映各因素對響應值的影響關系，見圖5。

圖5 各因素交互作用的響應面和等高線圖Fig.5 Contour and response surface plots for the interactive effect of three factors on α-glucosidase activity

圖5 直觀地給出了各個因素交互作用的響應面和等高線分析圖，其中各圖表示A、B、C中任意一個變量取零水平時，其余兩個變量對酶活力的交互影響，從響應面的最高點和等高線可以看出，在所選的范圍內存在極值，既是響應面的最高點，同時也是等值線最小橢圓的中心點[27-29]。圖5a表明，A、B的交互作用較強，實際值較大的A和B，反而使得響應值相對酶活力有減小的趨勢，可能由于時間長導致目的基因蛋白形成較多的包涵體。當誘導劑D-乳糖醇濃度在0.8～1.2 mmol/L、誘導時間在6～8 h時，隨著D-乳糖醇濃度和誘導時間的增加，相對酶活力不斷增加，D-乳糖醇濃度高于1.0 mmol/L，時間高于7 h時相對酶活力下降。圖5b表明，AC的交互作用在因素B實際值為7 h以上時較強，也表現出與圖5a相同的現象。當D-乳糖醇濃度在0.8～1.2 mmol/L、誘導溫度在32～36 ℃時，隨著D-乳糖醇濃度和誘導溫度的增加，相對酶活力不斷增加，D-乳糖醇濃度高于1.0 mmol/L、誘導溫度高于34 ℃時，相對酶活力開始下降。圖5c表明，BC的交互作用不大，在因素B實際值為7 h以上因素C很大的范圍內都能夠得到較大的響應值，當誘導時間在6～8 h、誘導溫度在32～36 ℃時，隨著誘導時間和誘導溫度的不斷增加，相對酶活力不斷增加，誘導時間高于7 h，誘導溫度高于34 ℃時，相對酶活力開始下降。所以從響應面圖和等高線分析圖可以確定其最佳D-乳糖醇濃度為1.0 mmol/L、誘導時間為7 h、誘導溫度為34 ℃。

2.5 D-乳糖醇與IPTG誘導表達效果比較

圖6 IPTG與D-乳糖醇對α-葡萄糖苷酶活力的影響效果比較Fig.6 Effect of IPTG versus D-lactitol on α-glucosidase activity

圖6 為IPTG和D-乳糖醇在最優表達條件（D-乳糖醇誘導濃度為1.0 mmol/L、誘導時間為7 h、誘導溫度為34 ℃）下的蛋白表達結果，在相同的酶液終體積下，D-乳糖醇為誘導劑所誘導的葡萄糖苷酶為IPTG最佳條件下誘導后的相對酶活力的99.13%，相差極其微小，經方差分析|t|=0.369 0＜t0.05（4）=2.776，說明用D-乳糖醇做誘導劑與IPTG做誘導劑無顯著性差異，所以可以用D-乳糖醇替代IPTG做重組蛋白表達的誘導劑。

3 結 論

乳糖操縱子作為一種可誘導的負調控型操縱子，是目前研究的最為詳盡的基因操縱子，已被廣泛應用于大腸桿菌工程菌株的構建中。IPTG和乳糖是文獻報道最多的誘導劑。其中IPTG誘導條件簡單，在大腸桿菌中不被代謝和降解，效果持久穩定。但IPTG存在潛在的毒性且價格昂貴，因而只作為實驗室少量蛋白表達時的誘導劑[30]；乳糖作為原核細胞的常用碳源，是乳糖操縱子控制細菌自身系列酶的天然底物，對乳糖操縱子具有天然的誘導作用，且價廉易得、無毒無害；但由于乳糖可以被細胞作為碳源代謝利用，誘導過程需要多次添加，操作麻煩，誘導效果不及IPTG，且誘導機制比IPTG更為復雜，誘導條件不易掌握，需要對菌體生長及誘導條件進行更為精細的研究及優化[31]。

本實驗通過響應面法優化了D-乳糖醇誘導重組α-葡萄糖苷酶的表達條件。得到重組α-葡萄糖苷酶的最佳誘導表達條件為：誘導劑D-乳糖醇濃度1.0 mmol/L、誘導時間7 h、誘導溫度34 ℃。在最適條件下，通過比較D-乳糖醇與IPTG對重組蛋白的誘導表達，發現酶的誘導量幾乎無差異。D-乳糖醇與IPTG的化學結構相似，且無毒無害，價廉易得，不被菌體所降解，誘導過程簡便易行。所以D-乳糖醇完全可以代替IPTG作為lac及其衍生物的啟動子誘導劑。對于各種利用原核表達系統進行重組蛋白的實驗研究及大規模工業生產，均具有十分重要的現實意義和應用價值。

[1] MARBACH A, BETTENBROCK K. Lac operon induction in Escherichia coli: systematic comparison of IPTG and TMG induction and influence of the transacetylase LacA［J］. Journal of Biotechnology，2012, 157(1): 82-88. DOI:10.1016/j.jbiotec.2011.10.009.

[2] 陳亮, 任隨周, 許枚英, 等. 乳糖替代IPTG誘導脫色酶TpmD基因在大腸桿菌中的高效表達[J]. 微生物學通報, 2009, 36(4): 551-556.

[3] WENG Y P, HSU F C, YANG W S, et al. Optimization of the overexpression of glutamate mutase S component under the control of T7 system by using lactose and IPTG as the inducers[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 38(3/4): 456-469. DOI:10.1016/ j.enzmictec.2005.07.002.

[4] 張毅, 屈賢明, 楊勝利. 乳糖作為誘導劑對重組目的蛋白表達的影響[J]. 生物工程學報, 2000, 16(4): 464-468. DOI:10.3321/ j.issn:1000-3061.2000.04.011.

[5] JOBE A, BOURGEOIS S. Lac repressor-opreator interaction: VI. The natural inducer of the lac operon[J]. Journal of Molecular Biology, 1972, 69(3): 397-404.

[6] 丁嵐, 侯曉彥, 王小紅, 等. 乳糖誘導葡萄球菌腸素A基因在大腸桿菌中的表達[J]. 食品與微生物技術學報, 2011, 30(2): 255-256.

[7] FERNáNDEZ-CASTANé A, VINE C E, CAMINAL G, et al. Evidencing the role of lactose permease in IPTG uptake by Escherichia coli in fed-batch high cell density cultures[J]. Journal of Biotechnology, 2012, 157(3): 391-398. DOI:10.1016/j.jbiotec.2011.12.007.

[8] 李兆鵬, 張栩, 徐斌, 等. 重組大腸桿菌高密度發酵中乳糖誘導表達hBLyS［J］. 過程工程學報， 2005， 5（4）: 446-449. DOI:10.3321/ j.issn:1009-606X.2005.04.020.

[9] 李春麗, 陳其新, 何國慶. 乳糖誘導植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein在大腸桿菌中的表達[J]. 生物工程學報, 2006, 22(6): 1021-1025. DOI:110.3321/j.issn:1000-3061.2006.06.026.

[10] 衛紅飛, 萬敏, 楊世杰, 等. 不同誘導劑對工程菌發酵及重組蛋白表達的影響[J]. 中國生物制品學雜志, 2005, 18(6): 518-525. DOI:10.3969/j.issn.1004-5503.2005.06.027.

[11] 李攀峰, 張洪斌, 胡雪芹. IPTG與乳糖聯合誘導重組大腸桿菌右旋糖酐蔗糖酶表達[J]. 食品科學, 2014, 35(1): 185-188. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201401036.

[12] 任增亮, 堵國成, 陳堅, 等. 大腸桿菌高效表達重組蛋白策略[J].中國生物工程雜志， 2007， 27（9）: 103-109. DOI:10.3969/ j.issn.1671-8135.2007.09.019.

[13] NGUYEN Q A, SCHUMANN W. Use of IPTG-inducible promoters for anchoring recombinant proteins on the Bacillus subtilis spore surface［J］. Protein Expression and Purification， 2014， 95（3）: 67-76. DOI:10.1016/j.pep.2013.11.018.

[14] KILIKIAN B V, SUáREZ I D, LIRIA C W, et al. Process strategies to improve heterologous protein production in Escherichia coli under lactose or IPTG induction[J]. Process Biochemistry, 2000, 35(9): 1019-1025. DOI:10.1016/S0032-9592(00)00137-0.

[15] 鄧永康, 吳民瀘, 劉盛邦, 等. 乳糖誘導重組尿酸酶基因在大腸桿菌中的表達[J]. 中國生物工程雜志, 2009, 29(7): 74-79.

[16] 王敏, 李市場, 劉紅霞, 等. 響應面優化粘紅酵母油脂提取工藝的研究[J]. 中國油脂, 2010, 35(4): 7-11.

[17] XYNOS N, PAPAEFSTATHIOU G, GIKAS E, et al. Design optimization study of the extraction of olive leaves performed with pressurized liquid extraction using response surface methodology[J]. Separation and Purification Technology, 2013, 122(3): 323-330. DOI:10.1016/j.seppur.2013.10.040.

[18] 趙強, 索有瑞, 李天才, 等. 響應面法優化苦蕎皮中總黃酮超聲波提取工藝[J]. 食品科學， 2014， 35（16）: 64-70. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201416012.

[19] 陳麗麗, 陳萍, 華欣春, 等. Thermotogɑ neɑpolitɑnɑ α-葡萄糖苷酶基因克隆及表達[J]. 食品與發酵科技, 2011, 47(6): 58-62. DOI:10.3969/j.issn.1674-506X.2011.06-014.

[20] 李春麗, 徐雪麗, 鄭振宇, 等. 人β防御素3和植物des-pGLu1-brazzein融合蛋白表達菌的誘導條件優化及其活性分析[J]. 生物工程學報, 2008, 24(3): 485-490.

[21] 畢云楓, 劉薇薇, 李彥陽, 等. Thermotoga neapolitana葡萄糖苷酶基因的克隆、表達及其酶學性質[J]. 吉林大學學報, 2013, 39(6): 1148-1152.

[22] 麻曉慶, 王繼紅, 韓曉曦, 等. 基因重組蛋白L243誘導表達包涵體的變性、復性與純化[J]. 吉林醫藥學院學報, 2007, 28(1): 1-3. DOI:10.3969/j.issn.1673-2995.2007.01.001.

[23] 葉姣, 陳長華, 夏杰, 等. 溫度對重組大腸桿菌生長及外源蛋白表達的影響[J]. 華東理工大學學報, 2002, 28(2): 364-367. DOI:10.3969/ j.issn.1006-3080.2002.04.008.

[24] 胡成旭, 侯昕彤, 馮永寧, 等. 響應面法優化云芝多糖提取條件的研究[J]. 食品工業科技, 2007, 28(7): 124-130. DOI:10.3969/ j.issn.1002-0306.2007.07.037.

[25] 畢金峰. 響應面分析法優化馬鈴薯變溫壓差膨化干燥工藝研究[J]. 食品科學, 2007, 28(11): 236-240. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2007.11.052.

[26] 王曉陽, 唐琳, 趙壘. 響應面法優化刺槐花多酚的超聲提取工藝[J].食品科學, 2011, 32(2): 66-70.

[27] 許暉, 孫蘭萍, 張斌, 等. 響應面法優化花生殼黃酮提取工藝的研究[J].中國糧油學報, 2009, 24(1): 107-111.

[28] POLIN S, PAKAMON C. Optimisation of microencapsulation of holy basil essential oil in gelatin by response surface methodology[J]. Food Chemistry, 2014, 152(1): 313-320. DOI:10.1016/ j.foodchem.2013.10.159.

[29] 朱磊, 王振宇, 周芳. 響應面法優化微波輔助提取黑木耳多糖工藝研究[J]. 中國食品學報, 2009, 9(2): 53-60. DOI:10.3969/ j.issn.1009-7848.2009.02.010.

[30] 趙春麗, 范秀軍, 趙冰, 等. IPTG誘導濃度對重組人肝再生增強因子基因表達的影響[J]. 東北農業大學學報, 2004, 35(4): 441-445. DOI:10.3969/j.issn.1005-9369.2004.04.012.

[31] 賈敏, 江波, 張曉鳴, 等. 乳糖誘導D-塔格糖3-差向異構酶基因在大腸桿菌中的表達[J]. 食品工業科技, 2012, 34(13): 143-152.

D-Lactitol as a Substitute for Isopropyl-β-D-Thiogalactoside to Induce Recombinant Protein Expression

BI Yunfeng, JIANG Renfeng, HE Shu, REN Dayong, XU Linlin, SHEN Minghao*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Objective: To induce the expression of recombinant glycosidase using D-lactitol instead of isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG). Methods: Single-factor experiments were performed to discuss the effect of D-lactitol concentration, induction time and temperature on the expression of recombinant glucosidase and consequently select three appropriate levels for each of the three variables. Subsequently, the levels of these variables were optimized by regression analysis and response surface methodology. Results: The optimal induction conditions were determined to be induction at 34 ℃ for 7.0 h with 1.0 mmol/L lactitol. Conclusion: D-Lactitol can replace IPTG as an ideal inducer for the production of recombinant proteins in genetically engineered strains with the efficient promoter of lac and its derivatives.

α-glucosidase; induction; response surface methodology; D-lactitol

10.7506/spkx1002-6630-201607024

Q786

A

1002-6630（2016）07-0128-06

畢云楓, 姜仁鳳, 何舒, 等. D-乳糖醇代替異丙基-β-D-巰基半乳糖苷對重組蛋白誘導表達的影響[J]. 食品科學, 2016, 37(7): 128-133. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607024. http://www.spkx.net.cn

BI Yunfeng, JIANG Renfeng, HE Shu, et al. D-Lactitol as a substitute for isopropyl-β-D-thiogalactoside to induce recombinant protein expression[J]. Food Science, 2016, 37(7): 128-133. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607024. http://www.spkx.net.cn

2015-06-22

吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目（吉教科合字[2015]第207號）

畢云楓（1976—），男，副教授，博士，研究方向為食品酶學。E-mail：yunfeng5609@sohu.com

*通信作者：沈明浩（1963—），男，教授，博士，研究方向為食品質量與安全評價。E-mail：shenmh2003@163.com