多效唑人工抗原的合成與鑒定

王曉芬，鄢愛平，譚 婷，毛雪金，劉俊俊，郭 嵐，萬益群,,

（1.南昌大學化學學院，江西 南昌 330031；2.南昌大學分析測試中心，江西 南昌 330047；3.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

多效唑人工抗原的合成與鑒定

王曉芬1，鄢愛平2，譚 婷2，毛雪金3，劉俊俊1，郭 嵐2，萬益群1,2,*

（1.南昌大學化學學院，江西 南昌 330031；2.南昌大學分析測試中心，江西 南昌 330047；3.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

為合成新的、有效的多效唑人工抗原，采用琥珀酸酐法對多效唑小分子進行結構修飾，以獲得含羧基的多效唑半抗原。將純化后的半抗原分別與牛血清白蛋白和卵清蛋白經N-羥基琥珀酰亞胺活潑酯法偶聯制備免疫原和包被原。采用質譜、紅外光譜、核磁共振氫譜對多效唑半抗原的結構進行鑒定；采用紫外光譜及高性能基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜對偶聯物的結構進行鑒定。結果顯示成功合成出多效唑人工抗原，為其抗體的制備和免疫學方法的構建奠定了前期研究基礎。

多效唑；半抗原；人工抗原；制備

多效唑（paclobutrazol，PAC）作為一種抑制類的植物生長調節劑，具有延緩植物生長、抑制莖桿伸長、縮短節間、促進花芽分化、增加植物抗逆性能、提高作物產量等功能，廣泛應用于水稻、麥類、花生、果樹、煙草、油菜、大豆等農作物生產。多效唑在土壤中易被吸附且降解慢，殘留時間長[1-2]，如使用不當，亂用或濫用，則有可能通過食物鏈傳遞，對人體健康造成潛在風險。為此，許多歐盟國家已經禁用[3]，日本、新西蘭、韓國和澳大利亞等國均規定多效唑的最高殘留限量為0.5 mg/kg[4]。我國食品安全國家標準GB 2763ü2015《食品中農藥最大殘留限量》[5]對多效唑殘留量的規定如下：谷物中稻谷、小麥≤0.5 mg/kg，油菜籽≤0.2 mg/kg，水果中蘋果和荔枝≤0.5 mg/kg。因此，開展食品中多效唑殘留快速檢測新技術研究對食品安全生產、現場監督都有著十分重要的現實意義。

多效唑殘留檢測目前主要采用氣相色譜（gas chromatography，GC）、液相色譜（liquid chromatography，LC）、氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液相色譜-質譜聯用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）等技術[6-9]，這些方法的準確度和精密度較高，但存在檢測成本高、周期長及操作繁瑣等缺陷，不適于大規模現場篩查。與色譜等分析技術相比，免疫分析法具有樣品前處理簡單、樣品用量少、檢測成本低、選擇性高及分析速度快等特點[10]，其原理是基于抗原與抗體特異性結合。該法已廣泛應用于食品中真菌毒素、藥物用品、農藥、獸藥殘留[11-15]等危害物的檢測，但應用于食品中植物生長調節劑的分析研究報道相對較少。

制備小分子化合物的人工抗原，需要與載體進行交聯，但小分子化合物必須具有或衍生出能與載體進行交聯反應的功能基團（如氨基、羧基、重氮鹽等），才能與載體交聯[16]。多效唑是小分子物質，具有反應原性，但不具備免疫原性，因而必須與載體大分子蛋白偶聯成為全抗原才可用于制備抗體。Cao Zhen等[17]以威廉姆森經典反應，合成多效唑半抗原，并取得了較好的成果。本實驗采用微波無溶劑法將多效唑與琥珀酸酐反應衍生成為帶羧基（—COOH）的半琥珀酸酐酯，拓寬了可選用的抗原合成方法。同時，該方法制備多效唑半抗原簡單、有效和安全，且可較好地與載體蛋白交聯制備多效唑的人工抗原，為多效唑抗體的進一步制備提供了前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

多效唑（純度≥99.5%）、琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）、無水吡啶 上海百靈威公司；N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDAC）、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF） 生工生物工程（上海）股份有限公司；牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）美國Sigma公司；1hPBS透析液（0.01 mol/L，pH 7.4）：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、KH2PO40.2 g、Na2HPO4g12H2O 29 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 儀器與設備

AV 600核磁共振波譜儀 瑞士布魯克公司；6430三重串聯四極桿液相色譜-質譜聯用儀、1260高效液相色譜 美國Agilent公司；TGL-16G高速臺式離心機上海安亭科學儀器公司；5800基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀 美國AB SCIEX公司；5700 智能型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司；SM2渦旋混合器德國IKA公司；2501PC紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 多效唑半抗原的制備

選用微波[18-21]無溶劑法合成多效唑半琥珀酸酯（paclobutrazol-hemisuccinate，PAC-HS）。用無水吡啶做溶劑，按照多效唑、琥珀酸酐、DMAP物質的量比1∶20∶1的比例混合均勻，氮氣吹干溶劑。將混合物置于微波爐中（P=406 W）間歇反應2.5 h。反應結束后加入2 mL氯仿溶解，取出混合物離心去沉淀，取上清液再加入2 mL二次水，渦旋振蕩2 min，以除去副產物丁二酸。取有機相，氮氣吹干，得到多效唑半抗原。其合成路線見圖1。

圖1 琥珀酸酐法合成路線Fig.1 Synthetic route of PAC-HS by succinic anhydride method

1.3.2 多效唑半抗原的純化及鑒定

采用Agilent 1260液相色譜儀對上述所合成的多效唑半抗原進行純化，收集10～11 min流出液，氮氣吹干，得到純化后的多效唑半抗原。其色譜分離條件如下：色譜柱：ZORBAX RX-C18（250 mmh9.4 mm，5 μm）；流動相：甲醇+0.1%甲酸水溶液（65∶35，V/V）；柱溫：30 ℃；流速：3.0 mL/min；檢測波長：222 nm；進樣量：100 μL。

1.3.3 多效唑半抗原的結構鑒定

采用液相色譜-質譜聯用儀對純化后的多效唑半抗原進行分析，正離子模式下做一級、二級質譜鑒定，并結合核磁共振氫譜和紅外光譜鑒定，對多效唑半抗原進行結構分析。

1.3.4 NHS活潑酯法[22]制備人工抗原

1.3.4.1 NHS活潑酯法制備免疫抗原

準確稱取2 mg PAC-HS溶于200 μL DMF中，加入NHS 4 mg（另溶于200 μL DMF），再加入7.5 mg稱量好的EDC，室溫下振蕩反應16 h（溶液1）；稱取8.7 mg BSA（PAC-HS與BSA的物質的量比為39∶1）溶于1.6 mL 1hPBS中（溶液 2）。再將溶液 1 逐滴加入溶液2 中，邊加邊振蕩，冰浴振蕩反應6 h。反應混合物移入處理好的透析袋中，用1hPBS透析3 d，每天換兩次透析液，即得到多效唑免疫抗原（PAC-HS-BSA），合成路線見圖2。

圖2 活潑酯法免疫抗原合成路線Fig.2 Synthetic route of immunogen active ester method

1.3.4.2 NHS活潑酯法制備檢測抗原

稱取1.2 mg PAC-HS溶于200 μL DMF中，加入NHS 2 mg（溶于200 μL DMF），再直接加入3.6 mg EDC，室溫振蕩反應16 h（溶液3）；稱取5 mg OVA（n（PAC-HS）∶n（OVA）=26∶1）溶于1.6 mL 1hPBS 中（溶液4）。溶液3與溶液4混勻后，冰浴振蕩反應6 h。同上透析即得到多效唑檢測抗原（PAC-HS-OVA），合成路線同圖2。

采用紫外光譜及高性能基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS）法對多效唑人工抗原進行結構鑒定，其中MALDI-TOF/MS檢測方法如下：將蛋白及蛋白偶聯物用 MALDI-TOF/MS 進行檢測，通過分子質量數據的改變可說明半抗原與蛋白偶聯成功與否，并可計算出蛋白與半抗原的偶聯比[19-20]。

基質輔助溶液的配制：將34 μL 0.15% TFA與17 μL的乙腈混合，再加入適量的芥子酸使溶液達到過飽和狀態，超聲15 min，1 000 r/min離心3 min，備用[23]。

將載體蛋白BSA、OVA以及偶聯物PAC-HS-BSA、PAC-HS-OVA脫鹽后分別與基質輔助溶液混合，點到樣品靶上，放入質譜儀內進行激光掃描。多效唑與載體蛋白的結合比按以下公式[24]計算。

式中：MA、MB和MC分別表示半抗原、蛋白、偶聯物的相對分子質量。

2 結果與分析

2.1 多效唑半抗原的純化

圖3 未純化的半抗原的質譜圖Fig.3 Mass spectrum of non-purified hapten

采用微波無溶劑法合成得到的多效唑半抗原，正離子模式下一級質譜圖如圖3所示，m/z 394.1離子為目標物PAC-HS峰，但仍含有較多的雜質信號，如過剩的原料多效唑（m/z 294.1），多效唑中的雜質（m/z 316.1）和副產物產生等。為了避免雜質與載體蛋白偶聯而干擾免疫效果，需進一步提純。

治療4周后，2組患者的FMA-UE、MBI和肩關節各方向主動關節活動度均有明顯提高(均P<0.05)，觀察組的FMA-UE和肩關節前屈、水平內收、水平外展主動關節活動度提高程度更高于對照組(均P<0.05)，2組患者的肩關節后伸、MBI改善程度差異無統計學意義。見表2～3。

2.2 多效唑半抗原的結構鑒定

2.2.1 PAC-HS的質譜鑒定

圖4 PAC-HS的一級質譜圖Fig.4 Full scan mass spectrum of PAC-HS

本實驗采用半制備高效液相色譜法對合成的多效唑半抗原進行純化，得到較純的目標物質（圖4），能夠有效去除產物中的副產物和過剩的原料。

圖5 PAC-HS的二級質譜掃描圖Fig.5 Secondary mass spectrum of PAC-HS

圖4 結果表明，一級質譜ESI+下出現的m/z 394.1，相應于加合質子準分子離子峰[M+H]+，與目標物的理論相對分子質量（393）相符。對分子離子進行ESI+-MS2鑒定（圖5）出現若干碎片離子峰，各種碎片歸屬如下（圖6）：開裂方式1產生氯芐基峰（m/z 124.9），開裂方式2產生含苯環和雜環基峰（m/z 206.1），開裂方式3產生叔丁基峰（m/z 57.1），開裂方式4產生另一個含苯環和雜環基峰（m/z 276.1），開裂方式5產生丁酸殘基峰（m/z 101.0），高質量端峰對應母體加合離子峰（[M+H]+，m/z 394.2）。一級質譜和二級質譜峰表明經純化后可得到多效唑半抗原目標化合物。

圖6 PAC-HS的結構式圖解Fig.6 Illustrative structural diagram of PAC-HS

2.2.2 PAC-HS紅外光譜鑒定

圖7 多效唑及其半抗原的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of paclobutrazol and PAC-HS

由圖7可知，原料和產物紅外光譜有相似之處，如：2 970.4 cm－1處為CüH伸縮振動吸收峰，3 130.1 cm－1處為ArüH伸縮振動吸收峰，1 690.7、1 500.5、1 410.2 cm－1處為苯環和雜環雙鍵骨架伸縮振動吸收峰，760.7 cm－1處為ArüH面外彎曲振動吸收峰。同時也發現PAC和PAC-HS有明顯的不同，例如：反應后多效唑中3 420.9 cm－1處OüH伸縮振動吸收峰減弱，而酯基特征顯現，1 730.3 cm－1處為酯C=O伸縮振動吸收峰，1 100.3 cm－1處為CüOüC單鍵伸縮振動吸收峰。特別是半抗原中出現了1 730.3 cm－1為C=O的伸縮振動吸收峰。紅外光譜分析表明多效唑中的羥基與琥珀酸酐形成了酯，即半抗原產物。

2.2.3 PAC-HS核磁共振分析

將PAC及純化后的PAC-HS進行1H-NMR分析，結果見圖8及圖9。由圖8可知：1H-NMR（600 MHz， DMSO）δ 0.616（9H，—(CH3)3），7.105～7.240（4H，苯環），7.752～8.516（2H，雜芳環），3.226（2H，üCH2），3.437（1H，—OH），4.750（1H，CHüN），5.506（1H，CHüO）。圖9與圖8相比，PAC-HS的1H-NMR（600 MHz，DMSO）譜圖中保留了母體中苯環和氮雜環的氫譜信息，但δ 3.437（H，—OH）峰消失，增加了12.340（H，—COOH）峰和2.613～3.109（4H，—CH2CH2）峰。由此可推測琥珀酸酐開環與多效唑發生了酯化反應，同時其中一個酰基轉變成了羧酸，為新化合物與蛋白質結合創造了條件。

圖8 PAC的核磁共振圖譜Fig.8 1H-NMR spectrum of PAC

圖9 PAC-HS的核磁共振圖譜Fig.9 1H-NMR spectrum of PAC-HS

通過上述紅外光譜、質譜和核磁共振氫譜分析，綜合結果表明所合成的產物即為理論設想的多效唑半抗原目標物。

2.3 多效唑人工抗原的鑒定

2.3.1 紫外光譜掃描

圖10 PAC-HS（a）、BSA（b）和PAC-HS-BSA（c）的紫外掃描圖譜Fig.10 UV scanning spectra of PAC-HS （a）， BSA （b） and PAC-HS-BSA （c）

BSA在波長278 nm處有吸收峰，多效唑半抗原在222 nm波長處有最大吸收峰，BSA與半抗原偶聯后，其產物的峰形發生變化且吸收產生了一定位移（圖10c），表明PAC-HS與BSA可能產生了偶聯。同樣，由圖11可知，OVA與PAC-HS也可能產生了偶聯。

圖11 PAC-HS（a）、OVA（b）和PAC-HS-OVA（c）的紫外掃描圖譜Fig.11 UV scanning spectra of PAC-HS （a）， OVA （b） and PAC-HS-OVA （c）

2.3.2 質譜鑒定及偶聯物結合比分析

圖12 BSA（a）、OVA（b）、PAC-HS-BSA（c）及PAC-HS-OVA（d）的質譜圖Fig.12 Mass spectra of BSA （a）， OVA （b）， PAC-HS-BSA （c） and PAC-HS-OVA （d）

BSA和OVA在連上多效唑分子后，其質量數會發生改變，對照組蛋白質BSA 的質譜圖（圖12a）可見，單電荷離子峰為66 354.057，對照組OVA 的質譜圖（圖12b）中單電荷離子峰為44 273.303。由PAC-HS-BSA 的質譜圖（圖12c）可見，PAC-HS-BSA分子離子峰為71 274.359，PAC-HS-OVA分子離子峰（圖12d）為46 181.668。已知PAC-HS的相對分子質量是393，可得出平均每個載體蛋白BSA分子上偶聯的多效唑半抗原分子個數=（71 274.359－66 354.057）/ 393≈12.5 個。載體蛋白OVA 分子上偶聯的多效唑半抗原分子個數=（46 181.668－44 273.303）/393≈4.9 個。制備相應的抗血清小分子化合物合成的全抗原，一般要求小分子與載體蛋白的最適偶聯比在1∶10～1∶25之間，方可有效地刺激機體產生免疫應答[25]，另有文獻報道每一載體上含有8～25 個半抗原能得到效價較高的抗體[26-27]。從偶聯比結果來看，本實驗制備的多效唑免疫抗原（PAC-HS-BSA）免疫小鼠，有可能產生相應的應答。

3 結 論

本實驗以琥珀酸酐為反應物，采用微波無溶劑法制備多效唑半抗原，將多效唑中的—OH衍生成為帶有üCOOH的分子，以便利用更多—COOH偶聯蛋白。同時采用半制備高效液相色譜法對合成的多效唑半抗原進行了純化，以避免雜質與載體蛋白偶聯而干擾免疫效果。在此基礎上，采用碳二亞胺法制備了多效唑的免疫原及包被原。應用質譜、紅外光譜及核磁共振等分析技術，對所制備的多效唑半抗原及其全抗原進行了結構鑒定。同時采用MALDI-TOF/MS分析技術，測得免疫原和包被原的偶聯比分別為12.5∶1和4.9∶1，成功合成了多效唑人工抗原，為進一步研究構建食品中多效唑快速分析新方法奠定了基礎。

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Synthesis and Identification of Stable Artificial Paclobutrazol Antigen

WANG Xiaofen1, YAN Aiping2, TAN Ting2, MAO Xuejin3, LIU Junjun1, GUO Lan2, WAN Yiqun1,2,*
(1. College of Chemistry, Nanchang University, Nanchang 330031, China; 2. Center of Analysis and Testing, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 3. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In order to synthesize a novel and effective artificial paclobutrazol antigen， succinic anhydride method was used to modify the structure of paclobutrazol. Paclobutrazol hapten (PAC-HS) with an active carboxyl group was obtained, and conjugated separately with BSA (bovine serum albumin) and OVA (ovalbumin) by carbodiimide method. Immunogen and coating antigen were obtained and designated as PAC-HS-BSA and PAC-HS-OVA, respectively. The hapten was characterized by mass spectrometry, infrared spectroscopy and1H nuclear magnetic resonance spectroscopy. Ultraviolet spectrophotometry was applied to determine the artificial paclobutrazol antigen. The coupling ratios of the conjugates were determined by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF/MS）. The results suggested that paclobutrazol antigen was successfully synthesized, which will greatly facilitate antibody production and immunoassay development.

paclobutrazol； hapten； artificial antigen； preparation

10.7506/spkx1002-6630-201607025

TS201.2

A

1002-6630（2016）07-0134-06

王曉芬, 鄢愛平, 譚婷, 等. 多效唑人工抗原的合成與鑒定[J]. 食品科學, 2016, 37(7): 134-139. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607025. http://www.spkx.net.cn

WANG Xiaofen， YAN Aiping， TAN Ting， et al. Synthesis and identification of stable artificial paclobutrazol antigen［J］. Food Science，2016, 37(7): 134-139. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607025. http://www.spkx.net.cn

2015-08-15

江西省科技支撐計劃項目（20133ACG70002；20141BBG70093；20141BBF60047）；江西省教育廳2014年度科學技術研究項目（GJJ14221）

王曉芬（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品質量與安全。E-mail：luckyfen123@163.com

*通信作者：萬益群（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品質量與安全。E-mail：wanyiqun@ncu.edu.cn