番石榴葉中廣寄生苷和番石榴苷的降糖作用

歐陽文，朱曉艾，蘇 磊，陳雪香，葉淑敏，曹 庸,

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

番石榴葉中廣寄生苷和番石榴苷的降糖作用

歐陽文1，朱曉艾2，蘇 磊1，陳雪香2，葉淑敏1，曹 庸2,*

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

目的：研究番石榴葉、廣寄生苷和番石榴苷的降糖活性和相關性。方法：采用反相高效液相色譜法測定不同月份番石榴葉中番石榴苷和廣寄生苷的含量；建立降糖脂肪細胞模型，測定不同季節番石榴葉提取物的降糖活性；給藥干預后，測定細胞培養液中游離脂肪酸的含量，采用Western blotting法測定脂肪細胞膜葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）表達。結果：6ü9月份番石榴葉中番石榴苷和廣寄生苷的含量較高，同時6ü9月份番石榴葉的降糖活性也最好，降糖活性與化合物含量存在正相關性。番石榴葉提取物、番石榴苷和廣寄生苷均能顯著促進脂肪細胞膜上GLUT4蛋白的表達；番石榴葉提取物、番石榴苷和廣寄生苷均能顯著抑制游離脂肪酸的釋放，降糖活性和抑制脂肪分解也存在正相關性。結論：番石榴苷和廣寄生苷兩種黃酮苷類化合物是番石榴葉降糖、抑制游離脂肪酸釋放的主要活性物質基礎。

番石榴葉；番石榴苷；廣寄生苷；降糖活性；葡萄糖轉運蛋白4；游離脂肪酸

番石榴（Psidium guajava Linn.）為桃金娘科（Myrtaceae）番石榴屬果樹[1]。因具有降糖、抗氧化、止血、抗菌、抗病毒等多種藥用功效，番石榴不僅是一種食物，更作為一種民間醫藥，在全世界亞熱帶地區被廣泛使用[2]。番石榴葉含有多種類型的化學成分，目前已經報道的有鞣質、黃酮、三萜、多糖、揮發油、倍半萜、雜萜醛類等[3-4]。

番石榴葉的降糖效果已被國內外學者廣為接受，大量的科學研究亦證明其無毒副作用。在日本，特定保健用食品（Food for Specified Health Uses，FOSHU）已有批準作為防治2型糖尿病的含番石榴提取物的番石榴茶上市[5]。Mukhtar等[6]證明250 mg/kg的番石榴葉水提物對四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠具有顯著的降血糖作用，但對正常小鼠的血糖水平無明顯改變。Ojewole[7]發現番石榴葉水提物不僅可降低鏈脲佐菌素誘導的高血糖小鼠血糖水平，還可使Dahl鹽敏感小鼠的血壓和心率降低。馬山等[8]證明番石榴葉水煎劑可使各組大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平降低，空腹胰島素（fasting insulin，FINS）水平下降，胰島素敏感指數（insulin sensitivity index，ISI）升高，與模型組比較有顯著差異。王波等[9]研究表明攀枝花地區野生番石榴葉水提物、65%和95%乙醇提取物對葡萄糖性、腎上腺素性和鏈脲佐菌素性高血糖小鼠的降血糖效率分別為36.3%、33.5%和31.3%。Hsieh等[10]研究發現番石榴葉能抑制低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）的糖基化，對于由糖基化所引起的各種糖尿病并發癥如心血管疾病和神經病變都能起到很好的治療效果。Oh等[11]發現通過給不同年齡的 Leprdb/Leprdb小鼠腹腔注射10 mg/kg的番石榴葉甲醇提取物，呈現顯著的降血糖效果，其機制可能在于番石榴葉甲醇提取物顯著抑制了蛋白酪氨酸磷酸酶-1B（protein tyrosine phosphatase-1B，PTP-1B）的活性，而PTP-1B是導致胰島素抵抗和肥胖的關鍵環節。

近些年來，科研者不再滿足于粗提取物水平的研究，進而對番石榴確切的降糖物質基礎及作用機制進行了深入研究。王婧茹等[12]報道番石榴葉總三萜能顯著降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂水平，明顯改善糖尿病動物的糖脂代謝紊亂，升高血清胰島素水平，提高胰島素敏感指數；其作用機制可能與增加過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）蛋白的表達有關。蔡丹昭等[13]以鏈脲佐菌素性高血糖小鼠為模型，觀察番石榴葉總黃酮對高血糖小鼠血糖、血脂水平的影響，比較給藥前后小鼠體質量及心臟、肝臟、腎臟和胰腺的臟器指數變化，發現番石榴葉總黃酮能降低鏈脲佐菌素性高血糖小鼠的血糖水平。吳建中等[14]報道番石榴多糖能夠顯著降低糖尿病小鼠血糖水平，提高其抗氧化能力。Wang Hui等[15]通過活性跟蹤分離純化，發現番石榴葉提取物中槲皮素、山奈酚和楊梅酮對α-麥芽糖酶和α-淀粉酶具有很強的抑制效果。魏明[16]發現番石榴葉三萜化合物PGL-15能促進3T3-L1前脂肪細胞分化，顯著增加細胞葡萄糖消耗量和抑制游離脂肪酸的產生，并能顯著增加細胞內PPARγ及葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）mRNA的表達。Eidenberger等[17]報道番石榴葉醇提取物分離得到的黃酮苷類化合物具有顯著的抑制血糖平衡關鍵酶二肽基肽酶的活性，是番石榴具有降糖活性的物質基礎。

本研究團隊通過建立以葡萄糖消耗為特征的脂肪細胞模型，采用活性追蹤模式對番石榴葉降糖活性物質基礎進行了系統的分離純化研究，初步證明番石榴葉降糖活性物質基礎主要為番石榴苷和廣寄生苷兩個化合物[18-19]，在此基礎上，本實驗擬進一步研究這兩種化合物的降糖活性，并考察其與番石榴葉降糖作用的相關性，為番石榴葉降糖功能提取物的開發研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動物

番石榴葉，采自廣東省茂名市林業局，原植物經湖南吉首大學廖博儒教授鑒定為桃金娘科番石榴屬植物，植物標本現存于華南農業大學食品學院天然活性物工程技術研究中心。番石榴苷和廣寄生苷結晶為自制，面積歸一化法測定結果表明兩者純度均大于99%。

葡萄糖測定試劑盒 廣州科方生物技術有限公司；游離脂肪酸測定試劑盒 北京普利來基因技術有限公司；Ⅰ型膠原酶 美國Sigma公司；去酚紅Hanks緩沖液、青霉素-鏈霉素雙抗 杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；腎上腺素 日本TCI化成工業株式會社；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；兔抗GLUT4多克隆抗體、羊抗兔IgG 武漢博士德生物工程有限公司；硝酸纖維素膜 廣州威佳科技有限公司；乙腈（色譜純） 德國Merck公司；水為超純水，其他試劑均為分析純。

SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質量120～150 g，購自南方醫科大學實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2011-0015。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；酶標儀美國PE公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；TC-2323二氧化碳培養箱 美國Sheldon公司；移液器（各種規格）、電泳儀、轉印儀 美國伯樂公司；5417R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 不同月份番石榴葉中番石榴苷和廣寄生苷含量測定

1.3.1.1 反相高效液相色譜條件

色譜柱：島津Shim-pack VP-ODS C18柱（150 mmh4.6 mm，5 μm）；流動相：水-乙腈（82∶18，V/V）；紫外檢測波長：257 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min，進樣體積：10 μL。

1.3.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取3.9 mg番石榴苷，溶解定容于25 mL容量瓶中，加色譜甲醇溶解，過0.45 μm微孔濾膜，即得0.156 mg/mL的番石榴苷對照品溶液；精密稱取4.3 mg廣寄生苷，溶解定容于25 mL容量瓶中，加色譜甲醇溶解，過0.45 μm微孔濾膜，即得0.172 mg/mL的廣寄生苷對照品溶液。

1.3.1.3 樣品溶液的制備

精密稱取10 g番石榴葉，以10 倍體積50%乙醇回流提取3 次，60 ℃減壓濃縮，定容至100 mL容量瓶中。過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液作為樣品溶液。

1.3.1.4 線性關系考察

分別精密吸取番石榴苷對照品和廣寄生苷對照品溶液1、2、4、6、8、20 μL，注入液相色譜儀，按1.3.1.1節的色譜條件測定峰面積，以進樣量為橫坐標，番石榴苷對照品和廣寄生苷對照品峰面積值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.1.5 精密度實驗

精密吸取番石榴苷對照品和廣寄生苷對照品溶液10 μL，按照1.3.1.1節的色譜條件測定，重復進樣5 次。

1.3.1.6 重復性實驗

分別取同一批番石榴葉粉末5 份，按1.3.1.3節方法操作，按1.3.1.1節的色譜條件進行測定。

1.3.1.7 穩定性實驗

取同一份樣品溶液，室溫條件下放置，分別于0、2、4、6、8 h測定峰面積值。

1.3.1.8 加樣回收率實驗

精密稱取6 份已知含量的3月份番石榴葉粉10.0 g左右，分別按照1∶1（m/m）比例加入自制番石榴苷、廣寄生苷對照品，按照1.3.1.3節方法制備供試品，取10 μL進樣分析，測定并計算回收率。

1.3.2 不同月份番石榴葉乙醇提取物降糖活性測定

1.3.2.1 脂肪細胞的分離純化

[20]略作修改：大鼠脫頸處死，乙醇浴后無菌開腹。取附睪外層脂肪組織，Hanks緩沖液漂洗兩次并剔除附帶血管，再剪碎至體積約1 mm3，加入適量0.1% Ⅰ型膠原酶溶液37 ℃水浴消化1.5 h后，2～3 倍體積的胎牛血清終止消化。將細胞懸液1 200 r/min離心10 min，棄下層溶液，上層脂肪細胞同法加Hanks緩沖液洗滌細胞兩次，通過細胞計數板，加入Hanks液調節細胞濃度。

1.3.2.2 大鼠脂肪細胞降糖模型

參考文獻[21]略作修改：在96 孔板中建立200 μL反應體系：100 μL 2h106個/mL的細胞懸液、30 μL葡萄糖溶液（質量濃度1 mg/mL）、30 μL胎牛血清、40 μL樣品溶液。在此模型中用體積分數0.1%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）Hanks緩沖液作對照組，胰島素為陽性對照組。200 μL反應體系培養30 min后，每孔加入終濃度為10–5mol/L的腎上腺素，繼續培養3 h后，冰浴終止反應。然后每孔精密吸取2 μL上清液，采用微量葡萄糖氧化酶法[22]顯色，在酶標儀上505 nm波長處讀數，測定并計算各孔葡萄糖濃度，通過建立工作曲線，并和對照組比較計算各樣品葡萄糖的消耗量，由此評價番石榴葉乙醇提取物或兩種化合物攝取葡萄糖的能力，具體計算公式如下。

葡萄糖攝取水平/（mmol/L）= cctrl－ccompound

式中：cctrl為對照組的葡萄糖濃度/（mmol/L）；ccompound為樣品或分離得到的有效成分經過3 h培養后殘留培養基中的葡萄糖濃度/（mmol/L）。

1.3.2.3 供試樣品的制備與降糖活性測定

將不同月份的番石榴葉粉碎成粗粉，10 倍體積50%乙醇回流提取3 次，每次1 h，提取液60 ℃減壓濃縮、冷凍干燥，用體積分數0.5% DMSO配制成1.2 mg/mL的溶液進行降糖活性檢測。

1.3.3 Western blotting法分析GLUT4表達水平

1.3.3.1 膜蛋白的提取與定量

在脂肪細胞模型上，各種藥物干預后（廣寄生苷、番石榴苷與番石榴葉乙醇提取物質量濃度均為100 μg/mL，胰島素濃度為8 nmol/L），采用Hanks緩沖液漂洗脂肪細胞3 次，收集脂肪細胞，參考文獻[23]制備脂肪細胞的膜蛋白：藥物干預后細胞用TES緩沖液反復洗滌3 次，每孔加入200 μL TES緩沖液，小心將細胞刮出，重復樣品合并，放入EP管，在冰上采用玻璃勻漿器勻漿，1 000hg離心，去掉沉淀，上清液再16 000hg、4 ℃離心20 min，收集沉淀，TES緩沖液溶解，－70 ℃保存即為粗膜蛋白溶液，采用Bradford法（考馬斯亮藍法）檢測其蛋白質濃度。

1.3.3.2 電泳、轉膜、雜交和顯色

在細胞膜蛋白樣品中加入等體積的2×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）凝膠上樣緩沖液，煮沸10 min，用微量加樣器上樣。60 μg等份的各組膜蛋白溶液，采用質量分數10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，在150 V電壓條件下，轉至硝酸纖維素膜（nitrocellulose，NC）膜120 min，NC膜先用封閉液（5%脫脂奶粉配制的TBST溶液）封閉1 h，然后以TBST溶液洗4 次，每次10 min，雜一抗兔抗GLUT4多克隆抗體溶液中（用抗體稀釋液1∶130（V/V）稀釋）4 ℃孵育過夜，37 ℃緩搖1.5 h，取出后洗膜3 次，洗滌步驟同上。把NC膜浸于辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG中（用抗體稀釋液1∶2 000（V/V）稀釋），37 ℃緩搖1.5 h，取出膜后同上方法洗滌3 次。將NC膜置于DAB底物液中顯色反應5 min，棄去反應液，用水沖洗膜，終止反應，觀察結果。應用IMAGE J圖像分析軟件對NC膜上的條帶進行灰度值比較分析。

1.3.4 抑制游離脂肪酸釋放活性測定

1.3.4.1 游離脂肪酸標準曲線的建立

精確稱取16.4 mg棕櫚酸標準品，溶于游離脂肪酸抽提液中，配制為終體積1 mL、終濃度64 mmol/L的溶液，－20 ℃保存。制備標準曲線時，用抽提液將64 mmol/L標準品稀釋為3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 mmol/L，按照試劑盒說明書方法，分別加入銅試劑和顯色劑進行操作（標準品的空白對照為對應抽提液），在550 nm波長處比色。

1.3.4.2 樣品中游離脂肪酸含量測定

建立細胞活性檢測模型，各種藥物干預后，細胞液經過培養和冰浴終止反應，取50 μL細胞液（樣品空白對照為對應的培養液），加入抽提液150 μL和銅試劑50 μL，振蕩2 min，室溫靜置10 min后，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，取80 μL上層清液置于96 孔酶標板，加入150 μL顯色劑，振蕩5 s，室溫靜置5 min，在550 nm波長處比色。代入標準曲線方程測定游離脂肪酸的含量。

1.4 數據統計

2 結果與分析

2.1 反相高效液相色譜分析結果

2.1.1 供試品反相高效液相色譜純度分析

圖1 番石榴苷（a）、廣寄生苷（b）、番石榴葉乙醇提取物（c）反相高效液相色譜圖Fig.1 HPLC profiles of guaijaver （a）， avicularin （b） and guava leaf ethanol extract (c)

由圖1可知，本實驗室自制的番石榴苷和廣寄生苷化合物純度高，番石榴葉乙醇提取物中兩種化合物分離度好，即可采用反相高效液相色譜法對兩種化合物進行準確的含量分析。

2.1.2 線性關系結果

以進樣量為橫坐標，番石榴苷對照品和廣寄生苷對照品峰面積值為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明，番石榴苷在0.156～3.12 μg范圍內線性良好，線性回歸方程為y=22.532 0x+0.369 5（R2=0.999 2）。廣寄生苷在0.172～3.44 μg范圍內線性良好，線性回歸方程為y= 22.242 0x－0.433 5（R2=0.999 5）。

2.1.3 精密度實驗結果

精密吸取番石榴苷對照品和廣寄生苷對照品溶液10 μL，按照1.3.1.1節的色譜條件測定，重復進樣5 次，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.35%和1.12%，表明此方法的精密度高。

2.1.4 重復性實驗結果

分別取同一批番石榴提取液，按1.3.1.1節的色譜條件進行測定，測得番石榴苷和廣寄生苷峰面積值的RSD分別為1.76%和1.09%，說明方法的重現性好。

2.1.5 穩定性實驗結果

取同一份樣品溶液，分別于室溫條件下放置0、2、4、6、8 h后測定峰面積值，結果表明，番石榴苷標準品和廣寄生苷標準品在8 h內穩定性良好，RSD分別為1.93%和0.93%。

2.1.6 回收率實驗結果

表1 廣寄生苷、番石榴苷加樣回收率實驗結果（）Table 1 Results of recovery tests (

表1 廣寄生苷、番石榴苷加樣回收率實驗結果（）Table 1 Results of recovery tests (

實驗次數稱樣量/g原有量/mg 加入量/mg 實測量/mg 回收率/% 平均回收率/%（RSD/%）番石榴苷廣寄生苷番石榴苷廣寄生苷番石榴苷廣寄生苷番石榴苷廣寄生苷 番石榴苷 廣寄生苷1 9.69210.26411.853 10.02312.012 20.356 23.058 100.68 93.28 2 9.81710.39612.006 10.79112.084 21.093 23.971 99.12 99.01 3 9.98510.57412.212 10.60512.045 21.796 23.670 105.81 95.13 4 9.71610.28911.883 10.37812.099 20.400 23.711 97.42 97.76 5 9.80110.37911.987 10.29912.109 20.701 24.315 100.22 101.81 6 9.55310.11711.683 10.24512.073 20.521 22.843 101.55 92.44 100. 81（2.83）96.57（3.59）

由表1可知，番石榴苷平均回收率為100.81%，RSD為2.83%；廣寄生苷平均回收率為96.57%，RSD為3.59%。說明可通過該方法準確測定材料中兩種化合物的含量。

2.1.7 不同月份番石榴葉中番石榴苷和廣寄生苷含量

表2 不同月份的番石榴葉中廣寄生苷和番石榴苷含量Table 2 Guaijaverin and avicularin contents in guava leaves in different months mg/g

由表2可知，番石榴苷和廣寄生苷在不同月份番石榴葉中含量差異較大，主要表現為在溫度較高的月份含量高，溫度較低的月份含量偏低，兩種化合物均在7月份的番石榴葉中含量達到最高，分別為（3.405f0.124）、（3.332f0.134） mg/g，含量最低均在1月份，分別為（0.136f0.034）、（0.405f0.024） mg/g。另外，番石榴苷在5ü8月份、廣寄生苷在5ü10月份的番石榴葉中含量均超過了2 mg/g。

2.2 不同月份番石榴葉乙醇提取物降糖活性

2.2.1 葡萄糖標準曲線

利用血糖測定試劑盒和酶標儀檢測細胞培養液中葡萄糖濃度。標準品濃度和吸光度之間線性回歸方程為y=0.034 8x－0.013 3（R2=0.999）。以上結果說明可通過比色測定吸光度從而準確計算出細胞培養液中的葡萄糖濃度。

2.2.2 番石榴葉乙醇提取物、廣寄生苷和番石榴苷的降糖活性

圖2 番石榴葉乙醇提取物、番石榴苷和廣寄生苷的降糖活性Fig.2 Hypoglycemic activity of guava leaf ethanol extract， guaijaverin and avicularin

以大鼠脂肪細胞為模型，觀察番石榴葉50%乙醇提取物、廣寄生苷和番石榴苷（以8 nmol/L胰島素為陽性對照）的降糖效果，結果見圖2。對照組葡萄糖濃度為（10.87f0.19） mmol/L，相比之下，8 nmol/L的胰島素能夠極顯著促進葡萄糖的攝?。≒＜0.01），同時番石榴葉50%乙醇提取物組、廣寄生苷組和番石榴苷組均可劑量依賴性地促進葡萄糖攝取。100 μg/mL番石榴苷組和廣寄生苷組葡萄糖濃度分別為（9.07f0.25）、（8.57f0.38） mmol/L。以上結果說明，該模型能夠用于評價物質是否具有降糖效果，同時番石榴葉50%乙醇提取物、番石榴苷和廣寄生苷均具有良好的降糖效果。

2.2.3 不同月份番石榴葉乙醇提取物降糖活性

采集2012年全年的番石榴葉，經50%乙醇提取，用脂肪細胞活性檢測模型對質量濃度為1.2 mg/mL的各月份樣品進行降血糖活性分析。

圖3 不同月份番石榴葉乙醇提取物降糖活性Fig.3 Hypoglycemic activity of ethanol extracts of guava leaves in different months

如圖3所示，在2012年全年的番石榴葉乙醇提取物中，以7月份的番石榴葉乙醇提取物的降糖效果最強，1月份的最弱。而6ü9月份番石榴葉乙醇提取物均可使細胞液中的葡萄糖濃度維持在較低水平。此外，1ü4月份的番石榴葉乙醇提取物降糖量呈現明顯的增加趨勢，9ü12月份表現為降糖量遞減變化趨勢。所以，2012年全年的番石榴葉乙醇提取物所對應的葡萄糖攝取水平表現為一個開口向下的拋物線。進一步將葡萄糖攝取水平與不同月份番石榴苷和廣寄生苷兩種化合物總含量比較，結果見圖4。兩種化合物總含量在不同月份的變化中亦表現為一個開口向下的拋物線，與葡萄糖攝取能力的變化趨勢基本一致，這說明在脂肪細胞模型中，番石榴葉乙醇提取物的降糖能力和兩種化合物總含量緊密相關，即番石榴苷和廣寄生苷兩種化合物總含量越高，則降糖效果越好，這充分說明番石榴苷和廣寄生苷是番石榴葉的主要降糖物質基礎。

2.3 Western blotting結果

細胞對葡萄糖的攝取量關鍵在于細胞外膜上GLUT4的數量，為研究各處理因素對GLUT4水平的影響，采用蛋白質免疫印跡分析法檢測GLUT4的表達水平。如圖5所示，對照組GLUT4灰度值最低，廣寄生苷組GLUT4灰度值最高，為對照組的3.44 倍；其次是番石榴苷組，為對照組的2.85 倍；胰島素組和番石榴葉50%乙醇提取物組的GLUT4灰度值分別為對照組的2.64、1.90 倍。

圖5 各組大鼠脂肪細胞GLUT4蛋白質印跡灰度值Fig.5 GLUT4 expression on fat cell membrane treated by avicularin or guaijaverin

結合圖2結果，分析番石榴葉50%乙醇提取物、廣寄生苷和番石榴苷以及8 nmol/L胰島素這4 組中葡萄糖攝取量和GLUT4含量的關系，結果見圖6。GLUT4含量越高，細胞對葡萄糖攝取量越多，兩者之間表現出明顯的正相關性。

圖6 不同樣品作用下細胞攝取葡萄糖水平和GLUT4含量的關系Fig.6 Relationship between glucose-uptake level and GLUT4 expression

2.4 抑制游離脂肪酸釋放活性

2.4.1 游離脂肪酸標準曲線

以棕櫚酸為標準品，采用游離脂肪酸試劑盒和酶標儀檢測細胞培養液中游離脂肪酸濃度。棕櫚酸標準品濃度和吸光度之間線性回歸方程為y=0.598 3x+0.238 6（R2=0.999 1）。這說明可通過比色測定吸光度來準確計算出細胞培養液中的游離脂肪酸濃度。

2.4.2 番石榴葉乙醇提取物、廣寄生苷和番石榴抑制游離脂肪酸釋放活性

將番石榴葉50%乙醇提取物、廣寄生苷和番石榴苷干預后的細胞培養液進行檢測分析，各組游離脂肪酸濃度如圖7所示。

圖7 脂肪細胞培養液中游離脂肪酸含量比較Fig.7 FFA content in the culture supernatant of fat cells

廣寄生苷組細胞培養液中游離脂肪酸含量最低，為（0.69f0.11） mmol/L，其次是番石榴苷組，為（0.89f0.15） mmol/L，8 nmol/L胰島素處理后細胞培養液中游離脂肪酸含量為（0.99f0.02） mmol/L；而番石榴葉50%乙醇提取物組培養液中游離脂肪酸含量較高，為（1.61f0.16） mmol/L，接近對照組的（1.87f0.13） mmol/L。可能是由于番石榴葉50%乙醇提取物中有效成分的作用濃度較低，因此其抑制效果較弱。

結合各組樣品的降糖實驗結果，以對照組葡萄糖和游離脂肪酸含量為基準值0，對各組細胞葡萄糖攝取活性和抑制游離脂肪酸釋放活性之間的關系進行分析，結果見圖8，除番石榴葉乙醇提取物組外，其余各組的糖脂代謝呈現出相似的趨勢，即葡萄糖攝取活性和抑制游離脂肪釋放活性趨勢一致。

圖8 樣品對細胞攝取葡萄糖活性和抑制游離脂肪酸釋放的效果分析Fig.8 Relationship between glucose-uptake level and percent inhibition of FFA release

3 結論與討論

本實驗采用反相高效液相色譜法測定番石榴葉中番石榴苷和廣寄生苷兩種化合物的含量，采用大鼠脂肪細胞模型對番石榴葉乙醇提取物、兩種主要黃酮苷——番石榴苷和廣寄生苷進行了降糖、抑制游離脂肪酸活性的研究，結果表明：1）番石榴苷和廣寄生苷在不同月份番石榴葉中含量差異較大，以6ü9月份的番石榴葉中含量較高，最高在7月份，番石榴苷和廣寄生苷含量分別為（3.405f0.124）、（3.332f0.134） mg/g；2）不同月份番石榴葉提取物降糖效果差異較大，以6ü9月份效果較好，最佳的是7月份的番石榴葉提取物，此時葡萄糖攝取量為（1.58f0.09） mmol/L。同時不同月份番石榴葉乙醇提取物降糖效果與廣寄生苷和番石榴苷含量成正相關；3）番石榴苷和廣寄生苷均能顯著促進GLUT4蛋白在脂肪細胞中的表達，從而起到降糖效果，且GLUT4蛋白的表達量與葡萄糖攝取量成正相關；4）番石榴苷和廣寄生苷均能顯著抑制大鼠脂肪細胞游離脂肪酸的釋放，且降糖活性與抑制游離脂肪的釋放活性成正相關。

游離脂肪酸升高（脂毒性）導致的胰島素抵抗已經成為當前該領域的研究熱點。游離脂肪酸的增多將導致細胞內絲/蘇氨酸激酶活性的增強，進而導致胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）-1、IRS-2的絲/蘇氨酸殘基磷酸化，降低胰島素受體后信號通路，影響磷脂酰-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的活化，結果使葡萄糖轉運蛋白（GLUT）的活力及細胞內其他胰島素信號逐漸消失，從而發生胰島素抵抗[24]。易屏等[25]研究證實，游離脂肪酸可抑制胰島素刺激的葡萄糖轉運，其機制在于抑制IRS-1和PI3K蛋白的表達，但對GLUT4蛋白表達卻無影響，由此可見，游離脂肪酸對糖代謝作用在于影響胰島素介導的信號轉導，抑制GLUT4向細胞膜的遷移。本研究結果表明，番石榴苷和廣寄生苷可促進GLUT4向脂肪細胞膜的遷移，其可能機制在于這兩種化合物能抑制游離脂肪酸釋放，避免了高濃度游離脂肪酸對胰島素信號轉導的損傷。

番石榴葉的降血糖效果已得到了充分的肯定，具有較高的藥用價值，且原料來源豐富、成本較低，具有廣泛的應用前景。本研究在初步確定番石榴苷和廣寄生苷為番石榴葉降糖活性物質基礎上，進一步圍繞物質基礎展開研究，在含量和降糖活性關系、GLUT4蛋白表達和抑制游離脂肪酸釋放層面上，進一步證實了番石榴葉的降糖活性物質主要來自番石榴苷和廣寄生苷這兩種黃酮苷，本研究結果為番石榴葉的進一步開發和利用打下了堅實的基礎。番石榴樹生長所處的氣溫、光照、雨量等氣候環境使番石榴葉的內質生化成分包括各種功能活性化合物等會發生較大變化。在中國廣東地區，一般春季是在3ü5月，夏季是在6ü10月，秋季是11月，冬季是在12ü2月。從本研究結果來看，7月份番石榴葉降糖活性最高，6ü9月份這4 個月的番石榴葉活性基本持平，這可能與其活性物質在光合作用和呼吸作用的合成和分解的強度差值達到最大有關。冬季氣溫低，且光照時間短、光照強度弱，導致番石榴葉體內各種活性組分的合成能力降低，這可能是11ü2月份的番石榴葉降糖能力最差的原因。

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Hypoglycemic Activity of Avicularin and Guaijaverin in Guava Leaves

OUYANG Wen1， ZHU Xiaoai2， SU Lei1， CHEN Xuexiang2， YE Shumin1， CAO Yong2，*
（1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；2. College of Food Science， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Objective： To study the hypoglycemic activity of avicularin and guaijaverin in guava leaves. Methods： Reversedphase high performance liquid chromatography （RP-HPLC） was used to determine the content of avicularin and guaijaverin in guava leaves in different months of the year. The fat cell model was established to evaluate hypoglycemic activity of the ethanol extract of guava leaves， avicularin and guaijaverin respectively. Western blotting was used to analyze GLUT4 expression on the fat cell membrane. Free fatty acids as another index were also determined using a fatty acid kit. Results：The contents of guaijaverin and avicularin in guava leaves showed great difference in different months， and guava leaves had higher contents and hypoglycemic activity both between June and September. The guava leaf extract， guajava and avicularin could all significantly promote GLUT4 protein expression on the fat cell membrane and significantly inhibit the release of free fatty acids. Conclusion： Guaijaverin and avicularin are the major bioactive components in guava leaves with hypoglycemic activity and inhibitory capacity against free fatty acid release.

guava leaves； guaijaverin； avicularin； hypoglycemic activity； glucose transporter 4 （GLUT4）； free fatty acid

10.7506/spkx1002-6630-201607031

TS201.2

A

1002-6630（2016）07-0168-07

歐陽文， 朱曉艾， 蘇磊， 等. 番石榴葉中廣寄生苷和番石榴苷的降糖作用［J］. 食品科學， 2016， 37（7）： 168-174.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607031. http：//www.spkx.net.cn

OUYANG Wen， ZHU Xiaoai， SU Lei， et al. Hypoglycemic activity of avicularin and guaijaverin in guava leaves［J］. Food Science， 2016， 37（7）： 168-174. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607031. http：//www.spkx.net.cn

2015-05-15

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201321）；湖南省教育廳優秀青年基金項目（13B084）；湖南省“中藥學”重點學科建設項目（湘教通［2011］ 76號）；湖南中醫藥大學中藥化學教學團隊項目（TD-007）

歐陽文（1981—），男，講師，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail：oyw810225@126.com

*通信作者：曹庸（1966—），男，教授，博士，研究方向為天然活性物質。E-mail：caoyong2181@scau.edu.cn