低聚體葡萄籽原花青素對順鉑損傷HEK293細(xì)胞及抗癌活性的影響

連燕娜，高麗萍，郭 豫，高兆蘭，金 玉

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

低聚體葡萄籽原花青素對順鉑損傷HEK293細(xì)胞及抗癌活性的影響

連燕娜，高麗萍*，郭 豫，高兆蘭，金 玉

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

目的：探討低聚體葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins extract，GSPE）及其結(jié)構(gòu)單元兒茶素（catechin，C）對順鉑（cis-dichlorodiamineplatinum （II），DDP）損傷HEK293人胚腎細(xì)胞的保護(hù)作用以及對DDP抗A549人肺腺癌細(xì)胞活性的影響。方法：體外培養(yǎng)HEK293細(xì)胞和A549細(xì)胞，以DDP建立損傷模型，分別用不同質(zhì)量濃度的低聚體GSPE和兒茶素對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法測定細(xì)胞抑制率和存活率。結(jié)果：當(dāng)?shù)途垠wGSPE質(zhì)量濃度為16 mg/L時(shí)，對DDP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷的保護(hù)作用最佳，與DDP損傷組相比有顯著差異（P＜0.05），并且在達(dá)到此質(zhì)量濃度時(shí)可顯著增強(qiáng)DDP對A549細(xì)胞的損傷效果（P＜0.05）。相同條件下兒茶素對DDP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷無顯著影響（P＞0.05）。結(jié)論：體外培養(yǎng)條件下，一定質(zhì)量濃度的低聚體GSPE對DDP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，同時(shí)能增強(qiáng)DDP對A549細(xì)胞的殺傷作用。兒茶素對DDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞損傷的保護(hù)作用不明顯。

低聚體葡萄籽原花青素；兒茶素；順鉑；腎毒性

順鉑（cis-dichlorodiamineplatinum （Ⅱ），DDP）是一種被廣泛應(yīng)用的抗癌藥物，已在多種惡性腫瘤的治療中取得了顯著療效，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌等，它是目前有效的抗腫瘤藥物之一［1-2］。但DDP有明顯的毒性，如腎毒性、耳毒性、心臟毒性等［3-5］。由于DDP在腎臟中的聚集濃度最高，約為在血清中濃度的5 倍，因此腎毒性是DDP臨床應(yīng)用受限制的主要因素［6］。

葡萄籽原花青素（grape seed procyanidins extract，GSPE）是從葡萄籽中提取的黃酮類物質(zhì)，具有多種重要生物活性。近年來的研究表明，GSPE具有抗氧化、清除自由基、抗炎、保護(hù)心血管、降血脂、抗腫瘤等功能［7-11］。葡萄籽中含量最豐富且研究最多的是黃烷醇及其低聚物等黃酮類物質(zhì)［12］。黃烷醇單體包括兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）和表兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）。不同數(shù)量的黃烷醇單體聚合構(gòu)成原花青素，生物活性較強(qiáng)的是低聚體原花青素。

本課題組前期的研究表明GSPE可有效拮抗DDP誘導(dǎo)的腎損傷［13］，但由于GSPE結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其確切的有效成分尚不完全清楚。兒茶素是構(gòu)成GSPE的單體成分之一。兒茶素類化合物因具有多種生物活性，如抗氧化、保護(hù)心血管、保護(hù)肝臟、抗炎、抗衰老等［14-15］，現(xiàn)已引起國內(nèi)外研究者的普遍重視，但其對DDP誘發(fā)腎損傷的影響及對DDP抗癌效果的影響尚未見報(bào)道。因此本研究擬采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法探討低聚體GSPE和兒茶素對DDP誘導(dǎo)的HEK293人胚腎細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，以及對DDP體外殺傷A549人肺腺癌細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HEK293人胚腎細(xì)胞、A549人肺腺癌細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心。

DDP（批號：406022CF，注射用凍干粉劑） 齊魯制藥有限公司；低聚體GSPE（純度＞95%，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）級，其中二聚體56%、三聚體12%、四聚體6.6%、單體和其他大分子寡聚體20.4%（HPLC檢測）） 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；兒茶素（純度＞98%，HPLC檢測） 成都曼斯特生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶 美國Genview公司；胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293細(xì)胞和A549細(xì)胞用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、含5% CO2的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 DDP對細(xì)胞的毒性作用測定

取100 μL（1h105個(gè)/mL）處于指數(shù)生長期的細(xì)胞接種到96 孔板中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時(shí)，棄原培養(yǎng)液，加入100 μL含不同質(zhì)量濃度DDP的無血清DMEM培養(yǎng)基，其中對照組的DMEM培養(yǎng)基中不加DDP，每組設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、含5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測定細(xì)胞抑制率。

1.2.3 低聚體GSPE和兒茶素對細(xì)胞存活率的影響

將100 μL（1h105個(gè)/mL）處于指數(shù)生長期的細(xì)胞接種到96 孔板中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時(shí)，棄原培養(yǎng)液，加入100 μL含不同質(zhì)量濃度低聚體GSPE和兒茶素的無血清DMEM培養(yǎng)基，其中對照組的DMEM培養(yǎng)基中不加低聚體GSPE和兒茶素，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、含5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測定細(xì)胞存活率。

1.2.4 低聚體GSPE和兒茶素對DDP誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響

將100 μL（1h105個(gè)/mL）處于指數(shù)生長期的細(xì)胞接種到96 孔板中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時(shí)，進(jìn)行分組：1）對照組：DDP終質(zhì)量濃度為0 mg/L，GSPE或兒茶素終質(zhì)量濃度為0 mg/L；2）DDP組：HEK293細(xì)胞DDP終質(zhì)量濃度為20 mg/L，A549細(xì)胞DDP終質(zhì)量濃度為10 mg/L；3）DDP+GSPE或兒茶素組：在加DDP前4 h加入不同質(zhì)量濃度GSPE或兒茶素孵育細(xì)胞。每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，加入DDP后在37 ℃、含5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h測定細(xì)胞存活率。

1.2.5 MTT法測定細(xì)胞存活率和細(xì)胞抑制率

細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h后，向培養(yǎng)基中加入MTT，使之終質(zhì)量濃度為0.5 g/L，于37 ℃、含5% CO2的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清液并加入二甲基亞砜（100 μL/孔），振蕩混勻10 min，用酶標(biāo)儀（測定波長570 nm，參比波長630 nm）測定吸光度（A）。按照公式（1）、（2）計(jì)算細(xì)胞存活率和細(xì)胞抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚體GSPE和兒茶素對DDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

2.1.1 DDP對HEK293細(xì)胞的毒性作用

圖1 DDP對HEK293細(xì)胞的毒性作用Fig.1 Toxic effect of DDP on HEK293 cells

如圖1所示，隨著DDP質(zhì)量濃度升高，細(xì)胞抑制率也逐漸增大。當(dāng)DDP質(zhì)量濃度為60 mg/L時(shí)，對HEK293細(xì)胞抑制率達(dá)到最高，為0.85f0.03。當(dāng)DDP質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，對HEK293細(xì)胞抑制率接近最大值的一半，因此選用20 mg/L作為建立HEK293細(xì)胞DDP損傷模型的質(zhì)量濃度。

2.1.2 低聚體GSPE對HEK293細(xì)胞存活率的影響

圖2 不同質(zhì)量濃度低聚體GSPE對HEK293細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of GSOPE on the viability of HEK293 cells

如圖2所示，隨著低聚體GSPE質(zhì)量濃度的升高，HEK293細(xì)胞存活率逐漸增大，當(dāng)GSPE質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，HEK293細(xì)胞存活率達(dá)到最大，比對照組升高0.27f0.06，且與對照組（0.0 mg/L）相比具有顯著差異（P＜0.05）。當(dāng)GSPE質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時(shí)，HEK293細(xì)胞存活率逐漸降低，當(dāng)GSPE質(zhì)量濃度高于50 mg/L時(shí)，HEK293細(xì)胞存活率顯著低于對照組（P＜0.05）。即GSPE在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)HEK293細(xì)胞增殖。

2.1.3 兒茶素對HEK293細(xì)胞存活率的影響

如圖3所示，隨兒茶素質(zhì)量濃度的升高，HEK293細(xì)胞存活率逐漸增大，當(dāng)兒茶素質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，HEK293細(xì)胞存活率達(dá)到最大，比對照組升高0.41f0.16，且與對照組相比具有顯著差異（P＜0.05）。以上結(jié)果說明兒茶素在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)HEK293細(xì)胞增殖。

圖3 不同質(zhì)量濃度兒茶素對HEK293細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of catechin on the viability of HEK293 cells

2.1.4 低聚體GSPE對DDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

圖4 不同質(zhì)量濃度低聚體GSPE對DDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞損傷的Fig.4 Protective effect of GSOPE on DDP-induced toxicity in HEK293 cells

如圖4所示，用終質(zhì)量濃度為20 mg/L的DDP建立HEK293細(xì)胞損傷模型，用不同質(zhì)量濃度的低聚體GSPE拮抗DDP引起的細(xì)胞毒性。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，低聚體GSPE可有效保護(hù)DDP引起的HEK293細(xì)胞損傷，增加細(xì)胞存活率。當(dāng)?shù)途垠wGSPE質(zhì)量濃度為16 mg/L時(shí)，其對HEK293細(xì)胞的保護(hù)作用最佳，與DDP組相比具有顯著差異（P＜0.05），HEK293細(xì)胞存活率增加了0.21f0.05。

2.1.5 兒茶素對DDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

圖5 不同質(zhì)量濃度兒茶素對DDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞損傷的保護(hù)作用Fig.5 Protective effect of catechin on DDP-induced toxicity in HEK293 cells

如圖5所示，用終質(zhì)量濃度為20 mg/L的DDP建立HEK293細(xì)胞損傷模型，DDP組細(xì)胞存活率顯著低于對照組（P＜0.05）。而不同質(zhì)量濃度兒茶素對DDP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷沒有顯著影響。說明兒茶素對DDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞損傷沒有保護(hù)作用。

2.2 低聚體GSPE和兒茶素對DDP殺傷A549細(xì)胞的影響

2.2.1 DDP對A549細(xì)胞的殺傷作用

圖6 DDP對A549細(xì)胞的抑制作用（）Fig.6 Inhibitory effect of DDP on the growth of A549 cells ()

如圖6所示，隨著DDP質(zhì)量濃度升高，其對A549細(xì)胞抑制率逐漸增大。當(dāng)DDP質(zhì)量濃度為30 mg/L時(shí)，其對A549細(xì)胞抑制率達(dá)到最高，為0.85f0.04。當(dāng)DDP質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，其對A549細(xì)胞抑制率接近最大值的一半，因此選用10 mg/L作為建立A549細(xì)胞DDP損傷模型的質(zhì)量濃度。

2.2.2 低聚體GSPE對A549細(xì)胞的抑制作用

圖7 不同質(zhì)量濃度低聚體GSPE對A549細(xì)胞的抑制作用（）Fig.7 Inhibitory effect of GSOPE on the growth of A549 cells)

如圖7所示，當(dāng)?shù)途垠wGSPE質(zhì)量濃度≤5 mg/L時(shí)，其對A549細(xì)胞沒有顯著的抑制作用（P＞0.05）。當(dāng)?shù)途垠wGSPE質(zhì)量濃度高于5 mg/L時(shí)，其對A549細(xì)胞抑制率顯著高于對照組（P＜0.05）。即一定質(zhì)量濃度的低聚體GSPE可以抑制A549細(xì)胞增殖。

2.2.3 兒茶素對A549細(xì)胞的抑制作用

如圖8所示，當(dāng)兒茶素質(zhì)量濃度≤320 mg/L時(shí)，其對A549細(xì)胞沒有顯著的抑制作用。當(dāng)兒茶素質(zhì)量濃度達(dá)到640 mg/L時(shí)，其對A549細(xì)胞抑制率顯著高于對照組（P＜0.05）。即640 mg/L的兒茶素可抑制A549細(xì)胞生長，而≤320 mg/L的兒茶素對A549細(xì)胞增殖沒有顯著影響。

圖8 不同質(zhì)量濃度兒茶素對A549細(xì)胞的抑制作用（x±s，n=5）Fig.8 Inhibitory effect of catechin on the growth of A549 cells (x± s, n = 5)

2.2.4 低聚體GSPE對DDP殺傷A549細(xì)胞的影響

圖9 低聚體GSPE對DDP殺傷A549細(xì)胞的影響（x±s，n=5）Fig.9 Effect of GSOPE on DDP-induced toxicity in A549 cells (x± s, n = 5)

如圖9所示，用終質(zhì)量濃度為10 mg/L的DDP建立A549細(xì)胞損傷模型。當(dāng)?shù)途垠wGSPE質(zhì)量濃度低于8 mg/L時(shí)，其對A549細(xì)胞抑制率與DDP組沒有顯著差異，當(dāng)?shù)途垠wGSPE質(zhì)量濃度高于16 mg/L時(shí)，其對A549細(xì)胞抑制率顯著高于DDP組（P＜0.05），且隨GSPE質(zhì)量濃度的增大，A549細(xì)胞抑制率逐漸增大，說明當(dāng)?shù)途垠wGSPE高于一定質(zhì)量濃度時(shí)，可增加A549細(xì)胞對DDP的敏感性，協(xié)同DDP殺傷A549細(xì)胞。

2.2.5 兒茶素對DDP殺傷A549細(xì)胞的影響

圖10 兒茶素對DDP殺傷A549細(xì)胞的影響（x±s，n=5）Fig.10 Effect of catechin on DDP-induced toxicity of A549 cells (x± s, n = 5)

如圖10所示，用終質(zhì)量濃度為10 mg/L的DDP建立A549細(xì)胞損傷模型，DDP組A549細(xì)胞抑制率顯著高于對照組（P＜0.05），說明DDP可有效損傷A549細(xì)胞，而不同質(zhì)量濃度的兒茶素對DDP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞損傷沒有顯著影響。

3 討 論

DDP是臨床上被廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物之一，隨著研究的深入，DDP抗腫瘤作用的機(jī)制越來越清楚。DDP進(jìn)入機(jī)體后，在細(xì)胞外高氯離子環(huán)境中，大部分以原形化合物的形式存在。在有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2（organic cation transporter 2，OTC2）或銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1（copper transporter 1，Ctr1）的介導(dǎo)下，DDP可穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部［6］。DDP進(jìn)入細(xì)胞后，氯離子會很快被水分子取代，DDP被水化后形成親電子的活化形式。活化的DDP可與核酸分子上的巰基或嘌呤堿基的N7供氮活性中心反應(yīng)，形成鏈內(nèi)或鏈間加合產(chǎn)物，從而造成癌細(xì)胞的DNA損傷，阻止癌細(xì)胞分裂或誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［1］。

有研究表明，有些多酚類物質(zhì)可以通過改變基因的甲基化狀態(tài)或調(diào)節(jié)核因子的表達(dá)量來增強(qiáng)癌細(xì)胞對DDP的敏感性［16-17］。此外，一些黃烷醇等多酚類物質(zhì)本身可以通過增強(qiáng)正常細(xì)胞的抗氧化能力、阻滯癌細(xì)胞的細(xì)胞周期以及降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散等作用來達(dá)到一定的抗癌效果［18-20］。本研究表明，一定質(zhì)量濃度的低聚體GSPE預(yù)處理A549細(xì)胞后，可增強(qiáng)DDP對A549細(xì)胞的殺傷作用，提示低聚體GSPE可增強(qiáng)DDP的抗腫瘤作用。

隨著DDP的廣泛應(yīng)用，其腎毒性越來越被人們所重視。DDP的腎毒性與多種因素有關(guān)，其中氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是DDP誘導(dǎo)腎毒性的主要原因之一。DDP的親核氨基可與水分子作用產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體損傷、抗氧化酶活性下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等［21-22］。低聚體GSPE主要是通過增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化活性來保護(hù)DDP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷。孫蕓等［23］研究表明，聚合度對GSPE的抗氧化活性影響較大，單體的抗氧化活性低于二聚體。本研究結(jié)果顯示，低聚體GSPE可有效保護(hù)DDP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷，兒茶素對DDP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷沒有顯著影響。

當(dāng)?shù)途垠wGSPE質(zhì)量濃度為16 mg/L時(shí)，可有效保護(hù)DDP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷，而在此質(zhì)量濃度下，低聚體GSPE又可增強(qiáng)DDP對A549細(xì)胞的殺傷作用。而兒茶素對DDP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞和A549細(xì)胞損傷都沒有顯著影響。因此，低聚體GSPE和兒茶素雖然都屬于黃烷醇類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)有一定的相似性，但在對DDP所致腎損傷和DDP抗癌作用方面的影響上卻起著不同的作用。本研究結(jié)果表明，低聚體GSPE既能拮抗DDP誘導(dǎo)的腎損傷，又能增強(qiáng)DDP對A549的抑制作用，其確切的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究，兒茶素對DDP誘導(dǎo)的腎細(xì)胞損傷沒有顯著保護(hù)作用。

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Protective Effect of Grape Seed Oligomeric Proanthocyanidins Extract against Cisplatin-Induced Nephrotoxicity in HEK293 Cell and Effect on Anticancer Activity of Cisplatin in Human Lung Cancer Cells

LIAN Yanna， GAO Liping*， GUO Yu， GAO Zhaolan， JIN Yu
（Beijing Municipal Key Laboratory of Biological Active Substances and Functional Food， College of Applied Arts and Science，Beijing Union University， Beijing 100083， China）

Objective： To investigate the protective effect of grape seed oligomeric proanthocyanidins extract （GSOPE） and catechin （C） against cisplatin （DDP）-induced nephrotoxicity in human embryonic kidney （HEK） 293 cells and its effect on anticancer activity of DDP in human lung cancer A549 cells. Methods： HEK293 cells and A549 cells were cultured in vitro. The protective effects of GSOPE and catechin at various concentrations on DDP-induced HEK293 cells and their synergistic interaction with DDP against A549 cells were evaluated by MTT assay. Results： GSOPE at 16 mg/L could significantly protect DDP-induced HEK239 cells from death （P ＜ 0.05）， and the protective effect was better than that of other groups. GSOPE at 16 mg/L could also significantly enhance DDP-induced A549 cell death （P ＜ 0.05）. On the other hand， catechin had no influence on DDP-induced HEK293 cell death. Conclusion： In vitro， GSOPE， rather than catechin， can protect DDP-induced nephrotoxicity and can enhance DDP-induced lung cancer cell death.

grape seed oligomeric proanthocyanidins extract （GSOPE）； catechin； cisplatin； nephrotoxicity

10.7506/spkx1002-6630-201607033

Q946.8

A

1002-6630（2016）07-0182-05

連燕娜， 高麗萍， 郭豫， 等. 低聚體葡萄籽原花青素對順鉑損傷HEK293細(xì)胞及抗癌活性的影響［J］. 食品科學(xué)， 2016，37（7）： 182-186. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607033. http：//www.spkx.net.cn

LIAN Yanna， GAO Liping， GUO Yu， et al. Protective effect of grape seed oligomeric proanthocyanidins extract against cisplatin-induced nephrotoxicity in HEK293 cell and effect on anticancer activity of cisplatin in human lung cancer cells［J］. Food Science， 2016， 37（7）： 182-186. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607033. http：//www.spkx.net.cn

2015-05-12

北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（7163211）

連燕娜（1987—），女，碩士，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)對機(jī)體的生化作用。E-mail：lianyanna2009@sina.com

*通信作者：高麗萍（1962—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)對機(jī)體的生化作用。E-mail：gaolip62@163.com