不同形態(tài)硒與VE聯(lián)用對H2O2誘導人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞氧化應激損傷的保護作用

李 霞，姚 昭，張云龍，李紅艷

（南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

不同形態(tài)硒與VE聯(lián)用對H2O2誘導人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞氧化應激損傷的保護作用

李 霞，姚 昭，張云龍，李紅艷*

（南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

目的：研究不同形態(tài)硒化合物（有機硒：L-硒甲基硒代半胱氨酸；無機硒：亞硒酸鈉）單獨使用及其與VE聯(lián)合使用后對H2O2誘導人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）產(chǎn)生氧化應激損傷的保護作用。方法：采用體外細胞培養(yǎng)方法，將HUVECs隨機分為7 組：對照組、H2O2組、L-硒甲基硒代半胱氨酸（L-Se-methylselenocysteine，L-SeMSC）組、亞硒酸鈉（sodium selenite，SS）組、VE組、L-SeMSC+VE聯(lián)用組、SS+VE聯(lián)用組。經(jīng)不同樣品干預處理后，采用四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測 HUVECs存活率；檢測各組細胞內(nèi)脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性的變化。結(jié)果：各處理組HUVECs存活率之間沒有顯著差異；與H2O2組比較，0.1 mg/L亞硒酸鈉、10 mg/L VE處理能使HUVECs內(nèi)MDA生成量顯著減少，SOD和GSH-Px活性顯著升高，并且亞硒酸鈉和VE聯(lián)合使用在細胞水平上具有顯著的協(xié)同作用，而L-SeMSC組與對照組無顯著差異。結(jié)論：亞硒酸鈉和VE均可保護由H2O2誘導引起的HUVECs氧化損傷，提高HUVECs抗氧化能力，并且亞硒酸鈉和VE聯(lián)用具有明顯的協(xié)同抗氧化作用。

硒；VE；人臍血管內(nèi)皮細胞；協(xié)同抗氧化活性

細胞受到氧化刺激時，細胞內(nèi)成分如脂類、蛋白質(zhì)和核酸都會受到程度各異的損傷，從而導致基因突變、細胞癌變和個體衰老等現(xiàn)象。此過程相應地會伴隨著一些酶活性的變化以及一系列代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，這些指標可作為測試細胞損傷的標志物，進而用于表征樣品的抗氧化能力［1］。過氧化氫（H2O2）是一種重要的活性氧（reactive oxygen species，ROS），可導致包括血管內(nèi)皮細胞在內(nèi)的多種細胞發(fā)生一系列的生化反應。氧化應激引起的血管內(nèi)皮細胞損傷是動脈粥樣硬化形成的重要發(fā)病機制之一，在代償范圍內(nèi)，ROS對血管內(nèi)皮造成的損傷是可以恢復的，然而超過一定限度，將造成血管內(nèi)皮細胞壞死和凋亡等不可逆的損傷［2-3］。

L-硒甲基硒代半胱氨酸是一種新型硒強化劑，被認為是生物學效應最強的含硒化合物之一［4-6］。亞硒酸鈉作為目前最廣泛的硒營養(yǎng)補充劑，可以預防許多營養(yǎng)性疾病發(fā)生［7］。兩種形態(tài)的硒化合物以提供硒元素的形式在體內(nèi)作為多種抗氧化酶的活性中心，抗氧化酶催化氧化還原反應能夠減輕ROS系統(tǒng)給機體帶來的氧化損傷［8］。VE是公認的脂溶性斷鏈抗氧化劑，它可以影響谷胱甘肽氧化還原以及氧化劑和抗氧化劑之間的平衡［9-10］，而硒是谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的重要組成成分，可以間接增強GSH-Px的活性。因此，硒和VE在抗氧化應激方面密切相關(guān)。過去對硒元素和VE協(xié)同作用的研究主要集中陸生動物醫(yī)學上［11］，而二者協(xié)同對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的影響及機理鮮見報道。本研究探討不同形態(tài)硒和VE單獨使用及聯(lián)合使用對H2O2誘導HUVECs損傷后，細胞存活率和細胞中抗氧化酶——超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、GSH-Px活性以及脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的變化，探討不同形態(tài)硒抗氧化功能的差異，進一步研究硒與VE在細胞內(nèi)聯(lián)合協(xié)同增效抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HUVECs來自于美國菌種保藏中心。

胎牛血清 美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基 美國Invitrogen公司；SOD試劑盒、MDA試劑盒、GSH-Px試劑盒 南京建成生物工程研究所；30% H2O2西隴化工股份有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）粉劑（pH 7.2～7.4） 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；谷氨酰胺、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 北京Solarbio公司；L-硒甲基硒代半胱氨酸（L-Se-methylselenocysteine，L-SeMSC） 江西川奇制藥有限公司；亞硒酸鈉（sodium selenite，SS） 國藥集團化學試劑有限公司；水溶性VE 廣東天和誠科技公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）天津大茂有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

生物安全柜 蘇州凈化設備工程公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；MK3型酶標儀 芬蘭Thermo公司；CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱 長沙長錦科技公司；倒置生物相差顯微鏡 上海光學儀器進出口有限公司；HWS-150型恒溫恒濕箱 精宏實驗設備有限公司；Simplicity?純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 HUVECs復蘇與培養(yǎng)

從液氮中取出凍存的HUVECs，迅速于37 ℃水浴3 min，并不斷搖晃使其解凍。1 000 r/min離心5 min后棄去上清液，加培養(yǎng)液吹打制備單細胞懸液，分裝至多個培養(yǎng)瓶中。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間，待細胞增長至80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化后傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行下一步實驗。

1.3.2 H2O2誘導HUVECs損傷模型的建立

取對數(shù)生長期的正常HUVECs接種于96 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，等細胞增長至80%融合時，空白對照組加入200 μL含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；除空白對照組外，其他組分別加入H2O2終濃度為25、50、75、100、125、150 μmol/L的200 μL含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)8 h，MTT法檢測細胞存活率，確定建立損傷模型的H2O2最適濃度。

1.3.3 不同形態(tài)硒與VE單獨和聯(lián)用對HUVECs活力的影響

取對數(shù)生長期的HUVECs，按細胞密度為2h104個/mL接種于96 孔板中，每孔200 μL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細胞24 h。將HUVECs隨機分為6 組：對照組、L-SeMSC組（0.1 mg/L）、SS組（0.1 mg/L）、VE組（10 mg/L）、L-SeMSC（0.05 mg/L）+VE（5 mg/L）聯(lián)用組、SS（0.05 mg/L）+VE（5 mg/L）聯(lián)用組，除正常對照組外，其余組先用含有相應樣品的DMEM培養(yǎng)液處理24 h，對照組則添加相同體積的PBS。24 h后棄去培養(yǎng)液，用含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6 h，以穩(wěn)定細胞。最后，每孔細胞中加入200 μL含0.5 mg/mL MTT的培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中37 ℃條件下避光孵育4 h。吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩使藍紫色結(jié)晶充分溶解。每更換一次培養(yǎng)液后，用PBS沖洗兩遍。再用酶標儀測定光密度（OD490nm）值。按照下式計算各組HUVECs的細胞存活率。

1.3.4 經(jīng)H2O2處理后各組HUVECs的MDA生成量及SOD、GSH-Px活力測定

采用體外細胞培養(yǎng)方法，將HUVECs隨機分為7 組：對照組、H2O2組（100 μmol/L）和L-SeMSC組、SS組、VE組、L-SeMSC+VE聯(lián)用組、SS+VE聯(lián)用組。H2O2組的HUVECs用含有H2O2（100 μmol/L）的DMEM培養(yǎng)液處理8 h，其余組（對照組除外）先用1.3.3節(jié)所述的含相應樣品的DMEM培養(yǎng)液處理24 h，再將培養(yǎng)基換成含有100 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)8 h。細胞經(jīng)消化后4 ℃、1 500 r/min離心10 min。在收集管里加入600 μL裂解液，反復凍融兩次，隨后4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取離心后的上清液，通過硫代巴比妥酸法測定MDA含量，通過黃嘌呤氧化酶法和二硫代二硝基苯甲酸法分別測定SOD和GSH-Px活力，測定步驟嚴格按照試劑盒說明書方法操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2誘導HUVECs氧化損傷模型的建立

圖1 不同濃度H2O2處理HUVECs活力比較Fig.1 Comparison of cell viability in HUVECs treated with different concentrations of H2O2

如圖1所示，以空白對照組（0 μmol/L）HUVECs的細胞存活率為100%，25、50、75、100、125、150 μmol/L的H2O2處理后，細胞存活率分別降至95.34%、82.67%、70.98%、49.12%、25.56%、10.92%，除25 μmol/L劑量組外，其他組與空白對照組相比均有顯著差異（P＜0.05），當H2O2濃度為100 μmol/L時，HUVECs的細胞存活率符合氧化損傷模型要求，故選100 μmol/L H2O2處理8 h作為建模條件。

2.2 各組樣品對HUVECs活力的影響

圖2 各組細胞存活率比較Fig.2 Cell viability in different groups

由圖2可知，各處理組HUVECs存活率與對照組之間均無顯著差異（P＞0.05），故0.1 mg/L L-SeMSC、0.1 mg/L SS、10 mg/L VE、0.05 mg/L L-SeMSC+5 mg/L VE、0.05 mg/L SS+5 mg/L VE在本實驗條件下均不會抑制HUVECs活力，即選取的各樣品劑量可用于后續(xù)實驗。

2.3 不同形態(tài)硒與VE聯(lián)用對H2O2誘導HUVECs抗氧化能力的影響

2.3.1 各組HUVECs的MDA含量比較

圖3 各組細胞MDA含量比較Fig.3 MDA contents in HUVECs from different groups

如圖3所示，H2O2組的HUVECs經(jīng)過H2O2處理之后，細胞中MDA含量（（52.43f2.32） nmol/mg pro）與對照組（（28.31f3.71） nmol/mg pro）相比顯著升高（P＜0.05），MDA是ROS降解多不飽和脂肪酸的代謝產(chǎn)物，是最常見的脂質(zhì)過氧化指標之一，其含量高低間接反映了細胞氧化損傷的程度。在經(jīng)VE、SS處理過后，HUVECs內(nèi)MDA含量與H2O2組相比顯著下降，分別為（37.91f4.01）、（36.16f3.87） nmol/mg pro（P＜0.05）。SS+VE聯(lián)用組的MDA含量（（29.17f 3.44） nmol/mg pro）與H2O2組相比下降更為明顯（P＜0.05），同時與VE組、SS組相比也具有顯著差異（P＜0.05）。然而L-SeMSC組HUVECs內(nèi)MDA含量與H2O2組相比卻不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），L-SeMSC+VE組的MDA含量（（35.32f4.92） nmol/mg pro）與VE組相比無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.2 各組HUVECs的SOD與GSH-Px活力比較

圖4 各組細胞SOD和GSH-Px活力比較Fig.4 Activity of antioxidant enzymes in HUVECs from different groups

SOD是細胞內(nèi)主要的抗氧化酶之一，如圖4所示，經(jīng)H2O2處理后，H2O2組HUVECs內(nèi)SOD活力（（57.42f6.81） U/mg pro）與對照組（（148.56f8.74） U/mg pro）相比急劇下降（P＜0.05）。L-SeMSC組HUVECs的SOD活力（（62.23f6.97） U/mg pro）與H2O2組相比無顯著差異（P＞0.05），VE組、SS組、L-SeMSC+VE組HUVECs內(nèi)SOD活力分別為（84.3f7.32）、（78.37f5.24）、（86.63f6.43） U/mg pro，與H2O2組相比顯著升高（P＜0.05），而SS+VE組HUVECs的SOD活力高達（146.36f9.32） U/mg pro，顯著高于H2O2組（P＜0.05）且與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），并且顯著高于VE組、SS組，而L-SeMSC+VE組HUVECs的SOD活力與VE組相比無顯著差異（P＞0.05）。

GSH-Px是細胞內(nèi)以硒元素為活性中心的重要的抗氧化酶，如圖4所示，H2O2組中HUVECs的GSH-Px活力（（93.71f6.21） U/mg pro）與對照組（（176.49f9.63） U/mg pro）相比顯著下降（P＜0.05）。VE組（（123.83f8.32） U/mg pro）和SS組（（141.72f5.87） U/mg pro）HUVECs的GSH-Px活力與H2O2組相比均顯著降低（P＜0.05）。值得注意的是，L-SeMSC組HUVECs的GSH-Px活力（（103.36f8.55） U/mg pro）與H2O2組相比無顯著差異（P＞0.05），且L-SeMSC+VE組HUVECs的GSH-Px活力（（132.62f7.31） U/mg pro）與VE組相比差異也不存在統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但是SS+VE組HUVECs的GSH-Px活力（（163.54f8.96） U/mg pro）卻遠遠高于H2O2組（P＜0.05），并與SS組相比也更高（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 H2O2對HUVECs的氧化損傷

血管內(nèi)皮細胞的損傷以及功能異常是動脈粥樣硬化發(fā)生的早期癥狀，許多因素都能導致血管內(nèi)皮細胞的損傷，如調(diào)節(jié)因子、炎癥因子、活性氧、脂肪氧化酶的紊亂等［12］，其中ROS產(chǎn)生的氧化損傷是導致動脈粥樣硬化發(fā)生的重要因素，ROS的產(chǎn)生和積累對血管內(nèi)皮細胞功能的改變以及凋亡起到重要作用。本實驗中所用的H2O2作為一種強氧化劑，它可以促進自由基的生成，如果機體中H2O2不能及時被抗氧化酶消除，即可透過細胞膜，在膜外與Cu2+或Fe3+反應，生成活性更強的羥自由基（·OH），后者可使血管內(nèi)皮細胞的細胞膜發(fā)生過氧化損傷，引起細胞脂質(zhì)過氧化反應，并持續(xù)發(fā)展為鏈式反應，幾乎可以和任何細胞成分發(fā)生反應，對細胞產(chǎn)生明顯的損傷作用［13］。

在本研究中采用100 μmol/L的H2O2誘導人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞氧化模型，經(jīng)H2O2處理之后，H2O2組HUVECs內(nèi)MDA含量與對照組相比顯著升高，SOD和GSH-Px活性則急劇下降，這表明在100 μmol/L的H2O2誘導下，細胞內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，自由基侵害細胞后，與細胞內(nèi)的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，產(chǎn)生MDA等代謝產(chǎn)物，大量的MDA使得細胞膜磷脂結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆變化，進而導致細胞膜的通透性增加，與此同時，細胞外分泌乳酸脫氫酶含量增多，細胞活力下降，引起細胞損傷［14］。此外，細胞內(nèi)過量的自由基可能會抑制抗氧化酶活性，造成細胞內(nèi)SOD和GSH-Px活力與對照組相比也顯著下降，使得自由基的清除能力大大減弱，使得細胞氧化損傷程度進一步加重［15］。

3.2 VE、SS對H2O2誘導HUVECs氧化損傷的保護作用

在VE作用下，細胞內(nèi)由H2O2誘導產(chǎn)生的過量氧自由基能夠及時被清除，阻止ROS對細胞膜的進一步的氧化損傷［16］。而在加入Na2SeO3后，為細胞提供了大量的硒元素，首先硒自身能阻止脂類過氧化物與游離基相結(jié)合，其次，硒還能夠參與體內(nèi)抗氧化酶如GSH-Px、硫氧化還原蛋白、硒蛋白R的形成，通過抗氧化酶催化氧化還原反應，能夠減輕ROS系統(tǒng)帶來的氧化損傷［17-18］，此外，補充硒還能使細胞內(nèi)谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量升高，而GSH又能使VE再生［19］。因此，在Na2SeO3和VE聯(lián)合使用后，兩者在細胞內(nèi)能發(fā)揮協(xié)同抗氧化作用，效果優(yōu)于單獨使用Na2SeO3和VE。

3.3 SS、L-SeMSC對H2O2誘導HUVECs氧化損傷的影響

Liu Jiaguo［20］和Wang Yang［21］等分別發(fā)現(xiàn)可以通過補充一定量的L-SeMSC和SS來提高抗氧化酶的活力，進而減緩大鼠和小鼠氧化應激的現(xiàn)象，Zeng Huawei等［22］研究發(fā)現(xiàn)在Caco-2細胞中L-SeMSC的吸收顯著高于SS，除此之外，Ip等［23］研究發(fā)現(xiàn)甲基硒酸（CH3SeO2H）在抑制小鼠乳腺增生上皮細胞代謝堆積物和促進癌細胞凋亡等方面的效果顯著高于相同硒濃度的L-SeMSC，甲基硒酸是一種功能類似于L-SeMSC在β-裂解酶作用下脫去氨基酸的物質(zhì)，因此，L-SeMSC被認為在β-裂解酶存在的情況下，可以有與甲基硒酸相同的作用。而在本研究中，添加L-SeMSC對HUVECs內(nèi)MDA含量和SOD、GSH-Px活力與H2O2組相比均無明顯差異。這可能是因為L-SeMSC發(fā)揮其抗氧化作用必須在β-裂解酶的作用下轉(zhuǎn)化為CH3SeH，CH3SeH進而進入無機硒代謝池，轉(zhuǎn)化為H2Se，作為合成各種含硒蛋白的前體，以硒代半胱氨酸的形式嵌入各種蛋白［24］，例如含硒的GSH-Px。但是β-裂解酶僅存在于腸道、肝臟、腎臟和乳腺細胞中，血管內(nèi)皮細胞由于缺乏β-裂解酶，不能裂解L-SeMSC，因此在人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中發(fā)揮不了其抗氧化作用。而亞硒酸鈉可通過硒化氫的甲基化轉(zhuǎn)化為甲基硒，參與代謝活動，不需要β-裂解酶的參與［25］。因此，在本研究中L-SeMSC對細胞的保護作用要弱于其他形態(tài)的硒。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明亞硒酸鈉、VE均可減弱因H2O2引起的細胞過度脂質(zhì)過氧化，減少細胞內(nèi)MDA生成量，增強細胞內(nèi)SOD、GSH-Px活力，并且亞硒酸鈉和VE聯(lián)合使用時，可起到抗氧化協(xié)同效應。而由于人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞內(nèi)缺乏β-裂解酶，不能分解L-SeMSC，故L-SeMSC在人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中無明顯的抗氧化活性。

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Protective Effect of Individual and Combined Selenium and VE on H2O2-Induced Oxidative Damage in HUVECs

LI Xia， YAO Zhao， ZHANG Yunlong， LI Hongyan*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang 330047， China）

Objective： To study the protective effect of individual and combined selenium and VE on human umbilical vein endothelial cell （HUVECs） with H2O2-induced oxidative damage. Methods： HUVECs cultured in vitro were divided into normal control group， model control group and five treatment groups including L-Se-methylselenoeysteine （L-SeMSC）group， sodium selenite （SS） group， VE group， L-SeMSC + VE group， and SS + VE group. The HUVECs were injured by H2O2after they were incubated for 24 h. The effects of all these treatments on cell viability were assayed by MTT. The activity of antioxidant enzymes （SOD and GSH-Px） and the content of MDA were determined. Results： Compared with the model group， treatment with 0.1 mg/L SS， or 10 mg/L VE could increase the viability of HUVECs， reduce the content of MDA， and increase the activity of antioxidant enzymes （SOD and GSH-Px）. The combination of SS and VE exerted a synergistic antioxidant effect at the cellular level， but L-SeMSC did not exhibit a significant difference when compared with the control group. Conclusion： both SS and VE possess protective effect on H2O2-induced damage in HUVECs， and can enhance cell antioxidant activity in a synergistic manner.

selenium； VE； human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）； synergistic antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201607035

TS201.4

A

1002-6630（2016）07-0192-05

李霞， 姚昭， 張云龍， 等. 不同形態(tài)硒與VE聯(lián)用對H2O2誘導人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞氧化應激損傷的保護作用［J］. 食品科學， 2016， 37（7）： 192-196. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607035. http：//www.spkx.net.cn

LI Xia， YAO Zhao， ZHANG Yunlong， et al. Protective effect of individual and combined selenium and VE on H2O2-induced oxidative damage in HUVECs［J］. Food Science， 2016， 37（7）： 192-196. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201607035. http：//www.spkx.net.cn

2015-06-30

江西省博士后科研項目（2013KY04）；江西省科技廳國際合作項目（20122BDH80003）

李霞（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：931152524@qq.com

*通信作者：李紅艷（1986—），女，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物與健康。E-mail：lihongyan@ncu.edu.cn